CN106834328B - 一种s-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种S‑核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及表达方法和应用，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ分别对pET28‑a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有Hind Ⅲ和Xho Ⅰ粘性末端的luxS基因片段和pET28‑a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和载体片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a‑luxS。本发明获得的蛋白质在细菌交流介导的有益性状开发和有害性状控制的研究及应用领域具有巨大潜力。

Description

一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达 方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域技术领域，尤其涉及一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用。

背景技术

细菌能够分泌自诱导因子感知周围环境中细菌的密度并调控基因表达的现象称为群体感应(quorum sensing，QS)，参与调控细菌的多种生长发育过程，如生物发光、孢子形成、抗生素生成、生物薄膜形成、细菌毒力因子分泌等、与人类卫生保健、农业生产及环境保护等都有密切的关系。根据细菌合成的信号分子和感应机制不同，QS系统主要分为3种：革兰阴性菌的AHL-LuxI/LuxR系统、革兰阳性菌中寡肽介导的双组分感应系统与呋喃硼酸二脂类化合物(AI-2)介导的AI-2/LuxS种间群体感应系统。由于在自然状态下微生物多以不同菌种混合存在的方式生存，并在种间存在广泛的信息交流，所以AI-2/LuxS群体感应调控系统备受重视。研究其诱导的密度感应机制，有助于理解微生物生物学行为，并为探索治疗微生物感染提供新思路。

细菌通过种间群体感应通用信号分子AI-2实现种间信息交流，而S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(LuxS)是AI-2合成途径中的关键酶。AI-2合成途径中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被作为一种甲基供体,产生的毒性中间产物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由5-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)水解成S-核糖高半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。LuxS催化SRH裂解成DPD和高半胱氨酸，DPD自动进行分子重排生成信号分子AI-2。

乳酸菌是革兰氏阳性细菌，其中不仅有寡肽介导的双组分感应系统，而且存在AI-2/LuxS群体感应系统。乳酸菌产细菌素与对人体消化道粘附的特性有助于抑制或排挤机会致病菌，降低人体被致病菌感染的风险。研究表明乳酸菌的这些益生特性受QS系统调控。

目前市面缺少商品化的AI-2，但存在SAH。SRH可在酸性高温条件下水解，生成SRH，再经LuxS体外催化合成DPD。对于研究AI-2介导的群体感应系统的实验来说，有在体外高效的表达LuxS蛋白，继而体外合成AI-2用于考察不同实验组别的差异，能使实验结果更具有说服力。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用。本发明将S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因(luxS)的重组表达载体pET28a-luxS，将该表达载体导入大肠杆菌细胞内，通过诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导，完成S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达，并通过亲和纯化得到目的蛋白。

本发明第一方面，提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28-a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和pET28-a载体大片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a-luxS。

所述LuxS基因来源于植物乳杆菌。植物乳杆菌是公认的益生菌，在食品发酵行业中已经被广泛应用，所以来自于其中的基因也可认为是对人体安全无害的，这将为该发明将来在食品发酵领域的应用提供理论的安全保障。

所述LuxS基因PCR扩增时的引物如下：

前引物luxS-F：5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’；

后引物luxS-R：5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’；

本发明第二方面，提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，所述制备方法包括构建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体的步骤，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至培养物的OD600值达到0.6-0.8，向培养物中加入IPTG，继续培养5～7h，离心收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤如下：

S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用镍亲和层析柱进行纯化，先用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅰ洗脱，然后采用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ洗脱，再用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅲ洗脱，去除非特异性结合的杂蛋白；最后用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅳ，收集洗脱液，SDS-PAGE检测洗脱液中样品纯度，得到纯化后的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；

所述缓冲液Ⅰ为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，90～110mM imidazole(咪唑)，pH 7.5～8.5；

所述缓冲液Ⅱ为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，140～160mM imidazole，pH 7.5～8.5；

所述缓冲液Ⅲ为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，190～210mM imidazole，pH 7.5～8.5；

所述缓冲液Ⅳ为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，250～290mM imidazole，pH 7.5～8.5。250mM imidazole(咪唑)浓度的洗脱液可正好洗脱目的蛋白，而较低的浓度梯度可以有效清除杂蛋白，保留目的蛋白。

作为优选，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤具体操作如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素45～55μg/ml的LB液体培养基中，将培养物按照0.8～1.2％接种量接种于500mL含有卡拉霉素45～55μg/ml的LB培养基，36～38℃振荡培养，至培养物的OD600值达到0.6-0.8，向培养物中加入IPTG至0.8～ 1.2mM，36～38℃继续培养6～8h；4000～6000rpm离心5～7min，收集菌体，用非变性镍柱结 合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；

所述非变性镍柱结合缓冲液成分如下：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，20～50mMimidazole，pH 7.5～8.5。

作为优选，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化中缓冲液Ⅰ洗脱9～11个柱体积，缓冲液Ⅱ洗脱9～11个柱体积，缓冲液Ⅲ洗脱4～6个柱体积，缓冲液Ⅳ洗脱18～22个柱体积。

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al3+、Ca2+和EDTA影响下活性上升，在Cu2+、Ni2+、 Zn2+及甘油作用下活性下降，即S-核糖基高半胱氨酸裂解酶参与催化反应时Al3+、Ca2+和 EDTA能够增强催化效率，Cu2+、Ni2+、Zn2+及甘油降低催化效率。

本发明第三方面，还提供所述制备方法制得的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在合成AI-2及其AI-2类似物方面中的应用。

本发明特点之一在于，本发明使用的luxS基因来源于乳酸菌，植物乳杆菌是公认的益生菌，在食品发酵行业中已经被广泛应用，所以来自于其中的基因也可认为是对人体安全无害的，这将为该发明将来在食品发酵领域的应用提供理论的安全保障。

本发明特点之二在于，本发明将制备的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白进行纯化，纯化的主要目的是使用纯的酶体外合成自诱导物2，用于群体感应相关科学研究。本发明通过筛选纯化条件，能够很好地将S-核糖基高半胱氨酸裂解酶分离出来，首先使用S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化中缓冲液Ⅰ洗脱9～11个柱体积，再使用缓冲液Ⅱ洗脱9～11个柱体积，然后使用缓冲液Ⅲ洗脱4～6个柱体积，最后使用缓冲液Ⅳ洗脱18～22个柱体积，其中在梯度洗脱中，咪唑的浓度由低到高增加，咪唑梯度过大或过小都会造成杂蛋白较多，纯化效率低，实验证明以50mM的梯度差比较合适，缓冲液IV中咪唑浓度增加到250mM时，缓冲液IV可正好洗脱目的蛋白，而较低的浓度梯度可以有效清除杂蛋白，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶，缓冲液IV中咪唑浓度超过300mM时，杂蛋白又会增加。

本发明特点之三在于，本发明研究了其他因素对S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性的影响，发现S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al3+、Ca2+和EDTA影响下活性上升，在Cu2+、Ni2+、 Zn2+及甘油作用下活性下降，该结果对S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在催化反应过程中提高 反应效率具有重要的意义。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明的luxS基因来自益生菌，不必担心安全问题；(2)优化了纯化条件，能够快速分离纯化S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；(3)发现了S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的激活剂(金属离子、EDTA)，能够提高S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的催化活性。

附图说明

图1为本发明S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因PCR后的胶回收纯化片段；

图2为本发明S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因表达蛋白的SDS-PAGE分析检测电泳图,其分子量约为22KDa，图中Lane 1为Protein Marker；Lane 2为纯化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；

图3为哈氏弧菌BB170的生物发光实验，使用酶标仪检测的发光值，阴性对照为不加反应液的哈氏弧菌BB170，实验组为加反应液的哈氏弧菌BB170；

图4为纯化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在不同温度下的相对酶活性示意图，其中37℃时的酶活性设为100％。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂，基因luxS、载体pMD18-T、载体pET28a的序列均已知，宿主大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21由试剂公司购买得到。

实施例1：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因luxS的克隆、表达及纯化

1、PCR扩增S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因luxS

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取植物乳杆菌YM4-3总DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行，并以提取的DNA作为PCR的模版。根据植物乳杆菌YM4-3的全基因组测序结果设计引物luxS-F与luxS-R，引物序列、PCR扩增体系组分及扩增条件如下：

(1)引物序列：

引物1：luxS-F：5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’

引物2：luxS-R：5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’

(2)PCR扩增体系(50μL)组成如下：

(3)PCR扩增条件：

95℃预变性3min；95℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸50s；循环30次；最后72℃延伸5min。反应完成后取5μL，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

2、PCR产物的胶回收纯化

(1)制备1.0％琼脂糖凝胶；

(2)将待分离纯化的PCR产物点样电泳，于适当位置停止电泳；

(3)在紫外灯下切下含有目的片断的凝胶，转移到1.5mL的洁净的离心管中；

(4)用多功能DNA纯化试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)进行目的片段的回收，回收方法按说明书进行操作；

(5)1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

回收结果如图1所示,得到了大小正确的条带。

3、重组表达载体的构建

(1)TA克隆验证序列的准确性及酶切

使用pMD18-T载体进行TA克隆，连接体系为0.5μL pMD18-T载体，3μL纯化后的luxS基因片段与2.5μL的T4DNA连接酶，16℃连接过夜，获得重组质粒pMD18-luxS。热刺激法转化分别将两种重组质粒导入感受态细胞大肠杆菌DH5α中，涂布于Amp-LB平板37℃过夜培养，挑取单克隆PCR验证转化结果后，阳性转化子直接送测序公司，使用pMD18-T的通用引物进行测序。

(2)载体与目的片段的连接

使用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28-a载体和测序正确的PCR纯化产物进行同步酶切，分别获得5’和3’末端分别带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a载体大片段，琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收。按照目的基因：载体＝5：1(摩尔比)加样，然后加入T4DNA连接酶在16℃连接16h；向100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入10μL连接产物；混合液冰浴30min，42℃热刺激90s后冰浴2min，加入900μL的LB培养基；37℃摇床200rpm培养60min使菌体复苏；培养结束后，5000rpm离心2min，弃去大部分上清，重悬沉淀涂布在含有卡那霉素(Kan)抗性的LB平板上；37℃过夜培养，挑取单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养；PCR后测序验证转化结果；测序正确后，即得含有重组表达载体pET28a-luxS大肠杆菌。

(3)提取正确的重组质粒并导入表达载体

使用高纯质粒小量制备试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从验证成功的大肠杆菌DH5α转化子中提取重组质粒，并使用化学转化法将重组表达载体pET28a-luxS转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，具体方法为：向100μL大肠杆菌BL21感受态细胞中加入2μL重组表达载体pET28a-luxS，混合均匀；将反应混合液置于冰上30min，42℃热刺激90s后马上置于冰上2min，加入900μL的LB液体培养基；37℃摇床200rpm培养60min使菌体复苏；培养结束后，5000rpm离心2min，弃去大部分上清，重悬沉淀涂布在含有卡那霉素的LB平板上；37℃过夜培养，挑取单菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜，进行菌落PCR，测序验证。

4、S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达

挑取BL21-pET-luxS单菌落接入含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，于37℃过夜培养。将过夜培养物按照1％接种量接种于500mL含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培养基，37℃振荡(150rpm)培养，至培养物的OD600值达到0.6-0.8左右，向培养物中加入IPTG(终 浓度为1mM)，37℃，150rpm继续培养6h；5000rpm离心5min，收集菌体，用10mL的非变性镍柱 结合缓冲液(50mM NaH2PO4，500mM NaCl，20mM imidazole，pH8.0)重悬菌体，超声波破碎(超 声5s，停3s，15min)后8000rpm离心10min；SDS-PAGE检测LuxS蛋白的可溶性。通过设置未添 加诱导剂IPTG的表达产物作为阴性对照来验证诱导剂的作用及目的蛋白的表达情况。

(5)S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化条件优化

表1不同梯度洗涤/洗脱缓冲液中imidazole浓度(mM)对纯化效果的影响

采用镍亲和层析柱进行纯化。优化纯化条件：非变性镍柱结合缓冲液用于平衡纯化柱体和上样；蛋白上样量为10mL，流速为0.1mL/min，用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅰ(50mMNaH2PO4，500mM NaCl，100mM imidazole，pH 8.0)洗脱10个柱体积，非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ(50mM NaH2PO4，500mM NaCl，150mM imidazole，pH 8.0)洗脱10个柱体积，非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅲ(50mM NaH2PO4，500mM NaCl，200mM imidazole，pH 8.0)洗脱5个柱体积，去除非 特异性结合的杂蛋白。用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅳ(50mM NaH2PO4，500mM NaCl，250mMimidazole，pH 8.0)洗脱20个柱体积，收集洗脱液，SDS-PAGE检测洗脱液中样品纯度。纯化结果如图2所示。

实施例2：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性检测

1、使用核酸蛋白分析仪测得纯化后S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的浓度为LuxS3.8mg/mL。

2、通过Ellman’s实验检测S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的酶活

SRH经S-核糖基高半胱氨酸裂解酶催化生成DPD与高半胱氨酸，其中高半胱氨酸与DTNB发生反应生成黄色产物，在412nm处有最高吸收峰。通过测定反应产物在412nm处的吸光值来检测LuxS的酶活，具体操作步骤如下：

(1)制备SRH

将购买的SAH溶解于1M的盐酸中，浓度为10mg/ml。取SAH溶液100μL，沸水浴20min，加入等体积的1M的NaOH混匀，加入1M的PBS使得PBS的终浓度为100mM，即制成12mM的SRH，继续加入100mM PBS使得SRH终浓度为10mM。

(2)S-核糖基高半胱氨酸裂解酶催化SRH生成DPD与高半胱氨酸

反应体系1如下：

37℃水浴15min后，加入190μL 100mM PBS(pH 7.2，0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA))与100μL 5mM的DTNB，412nm处测量吸光值。10μL ddH2O，190μL 100mM PBS(pH 7.2，0.1mMEDTA)与100μL 5mM的DTNB混合液作为阴性对照。

结果实验组反应液变成了黄色，且在412nm处的吸光值较阴性对照要高，证明纯化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶能催化SRH生成高半胱氨酸。

3、检测AI-2的活性

Ellman’s实验仅能证明纯化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶能催化SRH生成高半胱氨酸，要验证能否生成我们需要的信号分子AI-2，需要进行生物检测，具体方法如下：

(1)配制AB培养基：0.3M NaCl，0.05M MgSO4，0.2％酪蛋白氨基酸溶于水中，使用KOH调节pH至7.5，高压蒸汽灭菌；灭菌后，每100mL加入无菌的1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)1mL，0.1M L-精氨酸1mL与50％的甘油2mL，混匀即可；

(2)将保藏的哈氏弧菌BB170在新鲜的AB培养基中活化2代，30℃，150rpm，培养14h；

(3)将活化好的哈氏弧菌BB170按比例1：5000稀释在新鲜的AB培养基中，然后按每份90μL加入白色不透明平底96孔板中；

(4)按照如下体系配制AI-2体外合成反应液

反应体系2：

将反应混合液37℃水浴15min，反应完成后加入450μL的10mM PBS(pH 8.0)，超滤管过滤除去LuxS蛋白，收集滤液。

(5)取10μL滤液加入含有90μL哈氏弧菌BB170培养液的96孔板中，30℃，60rpm培养3h，使用酶标仪测定发光值。

结果如图3显示，加入反应滤液的哈氏弧菌BB170发光值比不加滤液的阴性对照要高至少50倍，证明LuxS能催化SRH生成具有生物活性的AI-2。

4、温度对S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性的影响

按照反应体系1配制反应液，分别在20℃、30℃、37℃、45℃、55℃、65℃与75℃条件下水浴15min后进行Ellman’s实验。设定S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在37℃时的酶活力为100％计算相对酶活。

结果如图4所示，纯化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的最适反应温度为45℃。

5、金属离子对S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性的影响

首先将金属离子或表面活性剂分别与LuxS混合，在45℃条件下水浴1h。反应液中，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的终浓度为1mg/mL，金属离子浓度为1mM，EDTA浓度为1mM，表面活性剂浓度为1％，甘油浓度为10％。金属离子及表面活性剂种类及影响见表2。

反应完成后加入终浓度为1mM的SRH，继续水浴15min，完成后进行Ellman’s实验。设定没有金属离子处理的LuxS蛋白活性为100％计算相对酶活。结果如表2所示。

表2不同金属离子及有机试剂对LuxS活性的影响

从表2可知，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al3+、Ca2+和EDTA影响下活性上升，Cu2+、 Ni2+、Zn2+及10％甘油对蛋白活性有较强的抑制作用。

Claims (3)

1.一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括构建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体的步骤，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至培养物的OD₆₀₀ 值达到 0.6-0.8，向培养物中加入IPTG，继续培养5 ~7h，离心收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤如下：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用镍亲和层析柱进行纯化，先用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅰ洗脱，然后采用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ洗脱，再用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅲ洗脱，去除非特异性结合的杂蛋白；最后用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅳ，收集洗脱液，SDS-PAGE 检测洗脱液中样品纯度，得到纯化后的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；

所述缓冲液Ⅰ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，100 mM imidazole，pH 8.0；

所述缓冲液Ⅱ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，150 mM imidazole，pH 8.0；

所述缓冲液Ⅲ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，200 mM imidazole，pH 8.0；

所述缓冲液Ⅳ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，250 mM imidazole，pH 8.0；

所述LuxS基因来源于植物乳杆菌；

所述非变性镍柱结合缓冲液成分如下：50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，20 mMimidazole， pH8.0；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化中缓冲液Ⅰ洗脱9~11个柱体积，缓冲液Ⅱ洗脱9~11个柱体积，缓冲液Ⅲ洗脱4~6个柱体积，缓冲液Ⅳ洗脱18~22个柱体积。

2.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤具体操作如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素45~55 µg/ml的LB液体培养基中，将培养物按照0.8~1.2%接种量接种于500 mL含有卡拉霉素45~55 µg/ml的LB培养基，36~38℃振荡培养，至培养物的OD₆₀₀ 值达到 0.6-0.8，向培养物中加入IPTG至0.8~1.2mM，36~38℃继续培养6~8 h； 4000~6000 rpm 离心5~7 min， 收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白。

3.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al³⁺、Ca²⁺和EDTA影响下活性上升，在Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺及甘油作用下活性下降。

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