CN115851630B - 一种四环素类抗生素降解酶、编码基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种四环素类抗生素降解酶、编码基因及用途，属于生物工程技术领域。降解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明采用基因工程的方法将上述编码基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，发酵液离心后取菌种进行清洗，超声波破碎，纯化得到酶液；利用该酶液分别对含不同四环素类抗生素的样品进行处理，其对四环素、氧四环素的降解效率分别可达78.9％和55.7％，对金霉素、甲烯土霉素和强力霉素也都有一定的降解效果。该酶蛋白具有生产成本低、周期短、操作简便等特点，有望应用到环境中四环素类抗生素的生物降解中。

Description

一种四环素类抗生素降解酶、编码基因及用途

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种四环素类抗生素降解酶、编码基因及用途。

背景技术

四环素类抗生素可抑制肠道细菌繁殖，促进牲畜生长，是一类被广泛使用的饲料添加剂。然而，由于缺乏完善的监管，我国四环素类抗生素的滥用情况严重，2013年的使用量为12000吨。四环素类抗生素不能被动物完全吸收，部分会随粪便排出。如未经无害化处理直接施入农田，会导致残留的四环素在土壤中累积。随雨水进入河流系统，再通过食物链进入到人体，人类和动物体内持续的抗生素选择压力基因一旦被激活，耐药性的传播风险就会增加，从而对人类健康安全构成潜在危胁。因此，如何降解环境中的四环素类抗生素已经成为焦点问题。而微生物降解是成本最低且应用前景广阔的一种方法，其本质是酶制剂对四环素类抗生素的降解。本发明提供了一种微生物体内产生的可降解四环素类抗生素的酶。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供了一种四环素类抗生素降解酶，该酶制剂具有成本低、周期短、操作简便等特点，对环境中四环素类抗生素的降解具有优良的作用。

本发明第一方面，提供一种四环素类抗生素降解酶，所述降解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明第二方面，提供一种编码所述降解酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本发明第三方面，提供一种获得所述降解酶的方法，包括以下步骤：

以克雷伯氏菌液中提取的质粒DNA为模板，以SEQ ID No.3及SEQ IDNo.4所示的序列为引物进行扩增；克雷伯氏菌保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14393；

扩增产物利用EcoRI和XhoI进行双酶切，连接入pET28(a⁺)表达载体后，转化至大肠感受态细胞，获得重组宿主细胞，发酵，纯化，得到四环素类抗生素降解酶。

优选地，PCR扩增反应体系为25μL，包括：2.5mmol/L dNTP 2μL，10×Ex TaqBuffer 2.5μL，10μmol/L SEQ ID No.3所示的引物1.0μL，10μmol/L SEQ IDNo.4所示的引物1.0μL，50ng/μL质粒DNA模板1.0μL，5U/μL Ex Taq聚合酶0.125μL，无菌水17.375μL。

优选地，PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环之后，72℃再延伸10min。

优选地，发酵的具体操作过程为：将重组宿主细胞利用0.02mmol/L的IPTG诱导表达12h。

优选地，纯化的具体操作过程为：将发酵所得发酵液离心后取菌种进行清洗，超声波破碎，采用Histrap亲和柱进行纯化。

本发明第四方面，提供一种降解四环素类抗生素的酶制剂，包括所述降解酶。

本发明第五方面，提供一种所述降解酶或所述基因或所述酶制剂在降解四环素类抗生素中的用途。

优选地，所述四环素类抗生素为四环素、氧四环素、金霉素、甲烯土霉素或强力霉素中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用克雷伯氏菌，从中获得了能够同时降解四环素和氧四环素等多种抗生素的基因及酶蛋白。将酶蛋白分别添加至含不同抗生素的样品中进行降解，对四环素和氧四环素的降解效率分别为78.9％和55.7％，对金霉素、甲烯土霉素和强力霉素也有一定的降解效果。该酶蛋白具有生产成本低、周期短、操作简便等特点，有望应用到环境中四环素类抗生素的生物降解中。

附图说明

图1为本发明提供的酶制剂纯化的SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明采用的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.TR5)已于2017年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.14393，保藏地址为：中国北京；专利号为CN201711212339.8。

所用的引物1和引物2来自无锡晟杰生物科技有限公司。

实施例1

一种四环素类抗生素降解酶的表达方法，包括以下步骤：

挑取克雷伯氏菌单菌落，接种至含LB培养基30mL的三角瓶中，37℃振荡培养过夜。采用质粒抽提试剂盒，按照质粒抽提试剂盒说明书从上述菌液中提取其质粒DNA为模板，在序列表中SEQ ID No.3表示的引物1和序列表中SEQ ID No.4表示的引物2的引导下PCR扩增目的基因。

其中，

引物1：5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGAGCTGCACATGAACCCATTCAAAGG-3’；

引物2：5’-CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCATTTCAAAAACTCTGCTTACCAGGCGCATTTCG-3’。

PCR反应体系如表1所示。

表1PCR反应体系(25μL)

PCR反应程序：95℃预变性4min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行30个循环之后，72℃再延伸10min。

从上述质粒DNA中扩增出该目的基因，获得目的基因后，对该目的基因进行测序，测序结果表明该基因具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列，相应的氨基酸序列为SEQID No.2。

随后将目的基因利用EcoRI和XhoI进行双酶切，酶切体系如表2所示。

表2酶切体系(20μL)

酶切反应条件：将上述体系置于37℃水浴反应30min，加2μL的Loading Buffer终止反应后检测。

将同样经过双酶切的pET28(a⁺)表达载体与上述基因(摩尔比1：3)，利用连接酶(TaKaRa T4 DNALigase连接酶25000U)在16℃下连接过夜后转化至大肠杆菌JM109，利用菌落PCR的方法检测。连接成功后挑取阳性单菌落与LB培液体养基内37℃培养，利用DNA抽提试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)进行质粒DNA提取，然后将5μL的重组质粒DNA与100μL宿主细胞BL21(DE3)感受态混合后冰浴30min，42℃水浴中热激60秒，然后马上置于冰上冷5min，向其中加入800μL的LB液体培养基，混合后在37℃、150r/min复苏1h，取上述转化液100μL涂布到含有50μg/mL Kan的LB固体培养基中，长出菌落后进行菌落PCR和提取质粒抽提后PCR鉴定(PCR程序与上述一致)。挑取阳性克隆于LB(含50μg/mLKan)固体培养基上划线培养24h，挑取单菌落接种至含3mL LB培养基的小试管中37℃、200r/min，培养过夜(约16h)。取300μL培养液(1％接种量)于30mLKan(加15μL，终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养，生长过程中无菌条件下测OD₆₀₀值至0.6(约2.5h)。然后在培养物中添加IPTG(终浓度为0.02mmo/L，即30mL样品中加入6μL、100mmol/L的IPTG)，25℃、200r/min继续诱导表达12h。将发酵液在10000r/min条件下离心5min，弃上清，用50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)重悬洗涤菌体，之后进行超声波破碎(300W工作20min，2s/2s)，12000r/min离心10min后取上清。采用Histrap1mL亲和柱(按照说明书进行)进行纯化得到酶液，即得四环素类抗生素降解酶。

为了说明本发明提供的四环素类抗生素降解酶的相关性能，对实施例1提供的相关样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试分析。见图1所示，其中图1中，泳道M为Marker；1为对照；2为破碎液上清；3为亲和色谱分离后样品；从图1中可知，目标基因成功在大肠杆菌中进行了表达，其分子量约为28.4KDa。

实施例2

一种四环素类抗生素降解酶制剂，包括实施例1提供的四环素类抗生素降解酶；酶制剂是将实施例1提供的四环素类抗生素降解酶用pH7.5的Tris-HCl溶液溶解而制得。

为了说明本发明提供的四环素类抗生素降解酶制剂对四环素类抗生素的降解性能，将实施例2提供的酶制剂按照100mg/L浓度分别添加至含20mmol/L浓度的不同抗生素的样品中进行降解，并监测在不同降解时长下的降解率，见表3所示，其中设对照组为含空载体的工程菌发酵液。

表3实施例2提供的酶制剂对不同抗生素的降解率

从表3中可知，本发明提供的酶制剂在24h内对四环素和氧四环素的降解效果较好，降解率分别为78.9％和55.7％，对金霉素、甲烯土霉素和强力霉素也有一定的降解效果，降解率分别为23.8％、28.1％和19.4％。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.一种四环素类抗生素降解酶在降解四环素类抗生素中的用途，所述四环素类抗生素降解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，且所述四环素类抗生素为四环素、氧四环素、金霉素、甲烯土霉素或强力霉素中的一种或几种。