BR112012002973B1 - vetor compreendendo um promotor indúzivel por manose, seu uso, célula hospedeira, bem como método para produzir um polipeptídeo - Google Patents

Abstract

VETOR COMPREENDENDO UM PROMOTOR INDÚZIVEL POR MANOSE, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, SEU USO CÉLULA HOSPEDEIRA, BEM COMO MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO. A presente invenção refere- se a um vetor expressável no hospedeiro procariótico e uma sequência de ácido nucleico compreendendo um promotor induzível pela manose do operon da manose de Bacillus subtilis em que o vetor e a sequência de ácido nucleico, respectivamente, podem O ser apropriadamente usados para transformar uma célula hospedeira para a expressão de uma sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica um polipeptídio, em particular, na fermentação de alta densidade celular.

Description

[001] A presente invenção refere-se a vetores expressáveis em células hospedeiras procarióticas compreendendo um promotor indu- zível pela manose para a expressão heteróloga de ácidos nucleicos codificando, por exemplo, polipeptídios, tais como proteínas recombi- nantes.

[002] Particularmente, a presente invenção se refere a novos vetores para a expressão heteróloga em um hospedeiro compreendendo uma região promotora do operon da manose operavelmente ligado a uma unidade transcricional compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é heteróloga ao dito hospedeiro, enquanto que a expressão da sequência do dito ácido nucleico é controlada pela região promotora do dito operon da manose. Adicionalmente, a presente invenção se refere ao uso destes vetores para a expressão heteróloga de ácidos nucleicos que codificam, por exemplo, polipeptídios, tais como proteínas recombinantes.

[003] Muitos sistemas foram descritos para a expressão heteró- loga de ácidos nucleicos codificando, por exemplo, polipeptídios (genes estruturais) em sistemas procarióticos. Para isso, o hospedeiro é transformado com um vetor compreendendo a sequência de ácido nu- cleico do gene estrutural de interesse operavelmente ligado a um promotor que é uma sequência de ácido nucleico que permite ao gene estrutural ser transcrito. Pela indução adequada o promotor é ativado e permite a transcrição do gene estrutural. A indução pode estar sob controle positivo ou sob negativo.

[004] Na indução de controle negativo um repressor é ligado ao promotor e previne a transcrição do gene estrutural. Se um indutor adequado estiver presente, o repressor é desativado e a transcrição é permitida.

[005] Na indução de controle positivo o promotor é ativado depois da ligação de um ativador, em que a ligação do ativador ao promotor é mediada por um indutor adequado.

[006] Os indutores típicos podem ser substratos que os hospedei-rosprocarióticos necessitam de metabolismo, por exemplo, tipos diferentes de açúcar.

[007] A presente invenção se refere a sistemas positivamente induzíveis, em que na presença de um substrato adequado, isto é indutor, um ativador se liga ao promotor que inicia a transcrição do gene operavelmente ligado ao dito promotor.

[008] Até agora, os sistemas de expressão genética mais heteró- logos em sistemas hospedeiros procarióticos confiaram exclusivamente em um conjunto limitado de promotores bacterianos. Consequentemente, do mesmo modo o número de substratos, que podem ser usados como indutores, também é limitado.

[009] Adicionalmente, o rendimento de um sistema de expressão heterólogo depende do número de hospedeiros procarióticos transformadosdisponíveis. Assim, os sistemas hospedeiros procarióticos são necessários porque são capazes de crescer a uma alta densidade celular, isto é, permitir uma rápida proliferação sem perder o vetor na divisão celular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] De acordo com a presente invenção estes e outros objetivos como será evidente a partir da seguinte descrição foram atingidos fornecendo novos vetores compreendendo uma região promotora do operon da manose operavelmente ligado a uma unidade transcricional compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é heteróloga ao dito hospedeiro, enquanto que a expressão da sequência do dito ácido nucleico é controlada pela região promotora do dito operon da mano- se.

[0011] Também são fornecidos, o uso do dito novo vetor para a expressão heteróloga regulada de uma sequência de ácido nucleico em um hospedeiro procariótico; uma sequência de ácido nucleico isolada e purificada expressável em um hospedeiro compreendendo uma região promotora do operon da manose; um hospedeiro procariótico transformado com o dito vetor ou a dita sequência de ácido nucleico isolada e purificada; um método para produzir um polipeptídio em um hospedeiro usando o dito vetor ou a dita sequência de ácido nucleico isolada e purificada; bem como o uso de um hospedeiro procariótico transformado com o dito vetor ou a dita sequência de ácido nucleico isolada e purificada na fermentação, especialmente na fermentação de alta densidade celular.

[0012] Outros objetivos e vantagens ficarão evidentes para aqueles versados na técnica da revista da seguinte descrição detalhada com referência às figuras ilustrativas acompanhantes, e as reivindicações ligadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] É mostrado nas figuras:

[0014] A figura 1 mostra a sequência de ácido nucleico do B.subtilis usado no mapeamento do sítio de iniciação da transcrição do promotor manP com o início do sítio de transcrição em um nucelotídio adenina sendo destacado, as caixas -35 e -10 deduzidas em itálico, a terminação do gene manR e o início do gene lys marcado por setas e os sítios de restrição BglII, Xbal, AflII e NdeI sublinhados;

[0015] a figura 2 mostra a sequência de ácido nucleico da região promotora compreendendo promotor manR com o sítio de início da transcrição em um nucelotídio guanina sendo destacado, as caixas -10 e -35 deduzidas estando em itálico, o início do gene manR sendo indi- cado por uma seta e o sítio de restrição HindIII e a sequência putativa cre estando sublinhada;

[0016] a figura 3 mostra a sequência de ácido nucleico obtida do B.subtilis compreendendo a região promotora do promotor manR como contido em pSUN291, pSUN384.1 e pSUN385.2, respectivamente, com o início do lacZ estando indicado por uma seta e os sítios de restrição estando sublinhados;

[0017] a figura 4 mostra o mapa de plasmídio do vetor de expressão pSUN 279.2 de acordo com a presente invenção;

[0018] a figura 5 mostra as atividades da β-galactosidase do B.subtilis 3NA contendo os plasmídios pSUN 279.2, pSUN 284.1 e pSUN 291, respectivamente, de acordo com a presente invenção;

[0019] a figura 6 mostra a sequência de ácido nucleico obtida do B.subtilis compreendendo a região promotora do promotor manP do B.subtilis incluindo a extremidade da terminação C do manR, a região intergênica entre manR e manP, aqui substituído pelo gene repórter lacZ, com o início do sítio de transcrição, as caixas -35 e -10 estando escritas em negrito, a terminação do manR e o início do lacZ sendo indicado por uma seta e os sítios de restrição estando sublinhados;

[0020] a figura 7 mostra as atividades da β-galactosidase do B.subtilis 3NA contendo o plasmídio pSUN 279.2 bem como dos demais plasmídios contendo fragmentos de comprimentos diferentes da sequência de ácido nucleico mostrada na figura 6;

[0021] a figura 8 mostra as atividades de β-galactosidase do B.subtilis 3NA compreendendo dos vetores pSUN291, pSUN384.1 e pSUN345.2 com as sequências de ácido nucleico tal como mostrado na figura 3;

[0022] a figura 9 mostra o mapa de plasmídio do vetor de expressão pMW 168.1 de acordo com a presente invenção;

[0023] a figura 10 mostra um diagrama com o resultado do teste de estabilidade de plasmídio do pMW 168.1 no B.subtilis 3NA com a porção procental das células contendo o plasmídio sendo traçado pelo número de gerações;

[0024] as figuras 11 a 14 representam diagramas mostrando loga- ritmicamente a concentração da biomassa seca traçada pela duração das corridas de fermentação 1 a 4 e representam o sinal de fluorescência (RFU) traçado pela duração da fermentação das corridas de fermentação de 1 a 4; e

[0025] as figuras 15 a 16 mostram os diagramas do sinal de fluorescência traçado pela duração da fermentação de corridas de fermentação 5 e 6,

[0026] a figura 17 mostra uma estrutura esquemática da recente iniciação do promotor tal como obtido de acordo com o experimento 4a a "construção do plasmídio pMW168.1";

[0027] a figura 18 mostra o diagrama de fluxo da construção do plasmídio pMW168.1; e

[0028] a figura 19 mostra uma SDS PAGE.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] Tal como aqui utilizado, as seguintes definições são fornecidas para facilitar a compreensão da presente invenção.

[0030] Um "vetor expressável em um hospedeiro" ou "vetor de expressão" é um constructor de poliácido nucleico, recombinantemente ou sinteticamente gerado, com uma série de elementos de poliácido nucleico especificados que permitem a transcrição de uma determinada sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira. Tipicamente, este vetor inclui uma unidade transcricional compreendendo uma determinada sequência de ácido nucleico para ser operavelmente transcrito ligado a um promotor. Um vetor expressável em um hospedeiro pode ser, por exemplo, um plasmídio autônomo ou auto- replicável, um cosmídio, um fago, um vírus ou uns retrovírus.

[0031] Os termos "hospedeiro", "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante"são usadas de modo trocável aqui para indicar uma célula procariótica na qual uma ou mais os vetores ou as sequências de ácido nucleico isoladas e purificadas da invenção foram introduzidos. Entende-se que tais termos referem não só à célula do tema particular, mas também à progênie ou a progênie potencial de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou devido a influências ambientais, tal progênie podenão ser, de fato, idêntica à célula de origem, mas ainda está incluído dentro dos limites do termo tal como aqui utilizado.

[0032] O termo "compreender"é genericamente usado no tocante a incluir, isto é permitindo a presença de uma ou mais características adicionais ou componentes.

[0033] O "promotor" tal como aqui utilizado se refere a uma sequência de ácido nucleico que controla a expressão de uma unidade transcricional. Uma "região promotora"é uma região reguladora capaz de ligação da RNA polimerase em uma célula e iniciar a transcrição de uma sequência de codificação à jusante (direção 3’). Dentro da região do promotor serão encontrados domínios de ligação de proteína (sequências de consenso) responsável pela ligação do RNA polimerase, tais como a caixa -35 putativa e a caixa Pribnow (caixa -10). Adicio-nalmente, a região promotora pode compreender o início do sítio de transcrição e os sítios de ligação de proteínas reguladoras.

[0034] O "operon da manose" se refere ao operon da manose do Bacillus subtilis.

[0035] Três genes foram identificados no operon da manose (Kunst F. N. et al., "The complete genome sequence of gram-positive bacterium Bacillus subtilis", Nature 390, as páginas 249 para 256 (1997)).

[0036] O primeiro gene, manP, codifica um componente específico da enzima da manose (transportador) que pertence à família da fruto- se-permease. O segundo gene, manA, codifica um isomerase da ma- nose-6-fosfato enquanto que a função do terceiro gene, yjdF, é desconhecida.À montante e na mesma orientação destes três genes, um gene regulador, manR, está localizado codificando a ManR, o ativador do operon da manose.

[0037] O operon da manose, consistindo dos três genes manP- manA-yjdF (daqui por diante referidas em conjunto como "manP"), está sob o controle do promotor manP que é positivamente regulado por si próprio. Outro promotor, promotor manP, é responsável pela expressão do manR que é essencial para a indução dependente da manose do promotor manP.

[0038] A região promotora manRtambém compreende um sítio de ligação de proteína reguladora de catabólito (elemento responsivo ca- tabólito (cre)) do gene manR.

[0039] A "sequência cre" se refere a uma sequência de ácido nu- cleico localizada à montante (direção 5’) de genes catabólicos. A sequência cre se liga a uma proteína de controle do catabólito (CCP) evitando a expressão do gene catabólico na repressão de catabólito de carbono (CCR).

[0040] Com o termo "regiões promotoras do operon da manose" se deseja significar as regiões promotoras que regulam a expressão do manP bem como do manR com ou sem a sequência cre.

[0041] O "promotor manP" tal como mencionado aqui compreende pelo menos a região -35, a caixa Pribnow, e o sítio de ligação ManR.

[0042] O "promotor manP" tal como mencionado aqui compreende pelo menos a região -35 putativa, a caixa Pribnow, o sítio de ligação ManR e, opcionalmente, uma sequência cre.

[0043] A D-manose também referida como "manose"é um 2- epímero da glicose e presente nos polissacarídios manana e heteromanana, glicoproteínas e outros numerosos glicoconjugados.

[0044] "CcpA" significa o "proteína A de controle de catabólito"que é uma proteína reguladora global e pode ativar ou reprimir a ativação de alguns operons catabólicos. No caso do operon da manose a CcpA desempenha um papel de repressão pela ligação à sequência cre.

[0045] Um "intensificador"é uma sequência de ácido nucleico que atua para potencializar a transcrição de uma unidade transcricional independente da identidade da unidade transcricional, a posição da sequência em relação à unidade transcricional, ou da orientação da sequência. Os vetores da presente invenção opcionalmente podem incluir intensificadores.

[0046] A "unidade transcricional" tal como aqui utilizado se refere a uma sequência de ácido nucleico que é normalmente transcrita em uma molécula do RNA única. A unidade transcricional poderia conter um gene (monocistrônico) ou dois (dicistrônico) ou mais genes (policis- trônico) o que codifica moléculas de polipeptídio funcionalmente relacionadas.

[0047] Uma sequência de ácido nucleico é "operavelmente ligada" quando é colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou uma região de iniciação de transcrição, tal como um sítio de ligação de ribossoma é operavelmente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica, por exemplo, um polipeptídio se for posicionado para facilitar a tradução do polipeptídio. A vinculação pode ser realizada pela ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítiosnão existirem, os adaptadores de oligonucleotídio sintéticos ou os ligantes são usados conforme a prática convencional.

[0048] O "ácido nucleico" ou a "sequência de ácido nucleico" ou o "ácido nucleico isolado e purificado ou a sequência de ácido nucleico" tal como referido na presente invenção poderiam ser DNA, RNA, ou DNA/RNA híbrido. No caso em que o ácido nucleico ou a sequência de ácido nucleico são localizados em um vetor que é normalmente o DNA. O DNA que se refere aqui pode ser qualquer sequência de poli- desoxinucleotídio, incluindo, por exemplo, DNA de fita dupla, DNA de fita simples, DNA de fita dupla em que uma ou ambas as fitas são compostas de dois ou mais fragmentos, DNA de fita dupla em que uma ou ambas as fitas têm um cadeia principal fosfodiéster não interrompida, DNA contendo uma ou mais porções de fita simples e uma ou mais fitas duplas, DNA de fita dupla em que as fitas do DNA são do DNA totalmente complementar, de fita dupla em que as fitas do DNA são do DNA só parcialmente complementar, circular, DNA fechado por ligação covalente, DNA linear, DNA covalentemente reticulado, cDNA, DNA sintetizado por produtos químicos, DNA semi-sintético, DNA bi- ossintético, DNA naturalmente isolado, DNA digerido por enzima, DNA cisalhado, DNA marcado, tal como DNA radiomarcado e DNA marcado com fluorocromo, DNA contendo uma ou mais espécies ou ácido nu- cleico de ocorrência não natural. As sequências do DNA podem ser sintetizadas por técnicas químicas padrão, por exemplo, o método de fosfotioéster ou via métodos de síntese automatizados e métodos de PCR. A sequência do DNA purificada e isolada também pode ser produzida por técnicas enzimáticas.

[0049] RNA que se refere aqui pode ser RNA, por exemplo, de fita simples, cRNA, RNA de fita dupla, RNA de fita dupla em que uma ou ambas as fitas são compostas de dois ou mais fragmentos, RNA de fita dupla em que uma ou ambas as fitas têm um cadeia principal fos- fodiéster não interrompida, RNA contendo uma ou mais porções de fita simples e uma ou mais porções de fita dupla, RNA de fita dupla em que as fitas do RNA são RNA totalmente complementares, de fita dupla em que as fitas do RNA são só parcialmente complementares, RNA covalentementemente reticulado, RNA digerido por enzima, RNA cisalhado, mRNA, RNA quimicamente sintetizado, RNA semi-sintético, RNA biossintético, RNA naturalmente isolado, RNA marcado, tal como RNA radiomarcado e RNA marcado com fluorocromo, RNA contendo uma ou mais espécies de "ocorrência não natural" do ácido nucleico.

[0050] Com "variantes" ou "variantes de uma sequência"se deseja significar uma sequência de ácido nucleico que varia da sequência de referência por substituições de ácido nucleico conservativas, pelo que um ou mais ácidos nucleicos são substituídos por outro com as mesmascaracterísticas. As variantes abrangem também sequências degeneradas,sequências com eliminações e inserções, enquanto tais sequências modificadas expõem a mesma função (funcionalmente equivalente) como a sequência de referência.

[0051] Tal como aqui utilizado, os termos "polipeptídio", "peptídio", "proteína", os temos "polipeptídio"e "peptídico" são usados de modo trocável para denominar uma série de resíduos de aminoácido conectados a outro por ligações de peptídio entre as alfa-aminas e os grupos de carbóxi dos resíduos adjacentes.

[0052] O termo "sequência de ácido nucleico isolada e purificada" se refere ao estado no qual a sequência de ácido nucleico estará de acordo a presente invenção. A sequência de ácido nucleico será livre ou substancialmente livre de material com o qual ela naturalmente se associa, tais como outros ácidos nucleicos com os quais ela é encontrada no seu meio ambiente, ou o ambiente no qual eles estão preparados (por exemplo, cultura de células) quando tal preparação é praticada pela tecnologia recombinante in vitro ou in vivo.

[0053] Os termos "transformação", "transformado", ou "introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira" denota qualquer processo em que um ácido nucleico extracelular como um vetor, com ou sem material acompanhante, entra em uma célula hospedeira. O termo "transformado celular" ou "célula transformada" significa a célula ou a sua descendência na qual o ácido nucleico extracelular foi introduzido e abriga assim o ácido nucleico extracelular. O ácido nucleico poderia ser introduzido na célula para que o ácido nucleico seja repli- cável como uma parte integrante cromossômica ou como um elemento cromossômico extra. A transformação de células hospedeiras apropriadas com, por exemplo, um vetor de expressão pode ser realizada por métodos bem conhecidos, tais como a microinjeção, a eletroporação, bombardeamento de partícula ou por métodos químicos, tais como transformação mediada por fosfato de cálcio, descrita, por exemplo, em Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ou em et al Ausubel. 1994, Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons.

[0054] A "sequência heteróloga de ácido nucleico" ou a "sequência de ácido nucleico heteróloga a um hospedeiro" significam uma sequência de ácido nucleico que codifica, por exemplo, um produto de expressão, tal como um polipeptídio que é alheio ao hospedeiro ("expressão heteróloga"ou "produto heterólogo") isto é uma sequência de ácido nucleico que se origina de um doador diferente do hospedeiro ou uma sequência de ácido nucleico quimicamente sintetizada que codifica, por exemplo, um produto de expressão, tal como um polipeptídio que é alheio ao hospedeiro. No caso em que o hospedeiro é uma determinadaespécie procariótica, a sequência de ácido nucleico heteró- loga é preferivelmente originada de um gênero ou família diferente, mais preferível de uma ordem ou classe diferente, em particular de um filo diferente (divisão) e bem mais particularmente de um domínio diferente (reino) de organismos.

[0055] A sequência de ácido nucleico heteróloga que se origina de um doador diferente do hospedeiro pode ser modificada, antes que ela seja introduzida em uma célula hospedeira, por mutações, inserções, eliminações ou substituições ou ácidos nucleicos únicos ou uma parte da sequência heteróloga de ácido nucleico enquanto tais sequências modificadas expuserem a mesma função (funcionalmente equivalente) como a sequência de referência. Uma sequência de ácido nucleico heteróloga tal como aqui referido abrange como tal sequências nucléi- cas que também que se originam de um domínio diferente (reino) de organismos tal como de eucariotas (de origem eucariótica), tais como, por exemplo, anticorpos humanos que foram usados em bibliotecas de exposição de fago e dos quais os ácidos nucleicos únicos ou uma parte das sequências de ácido nucleico foram modificados de acordo com o "uso do códon"de um hospedeiro procariótico.

[0056] Dentro da significação da presente invenção o termo "sequência de ácido nucleico heteróloga"ou "sequência de ácido nucleico heteróloga a um hospedeiro" abrange também uma sequência de ácido nucleico que é derivada do hospedeiro e codifica para um polipep- tídio, naturalmente expressado naquele hospedeiro, em que a sequência de ácido nucleico é inserida em um vetor da presente invenção e sob controle da região promotora do operon da manose da presente invenção.

[0057] A "região de iniciação de transcrição" é uma região de sinal que promove a iniciação da transcrição e compreendendo a sequência do sítio de ligação de ribossoma, tal como a sequência de Shine Dal- garmo.

[0058] Tipicamente a região de iniciação da transcrição é localizadaà jusante ao sítio de iniciação da transcrição e é operavelmente ligado aos genes a serem expressados.

[0059] A "região de terminação de transcrição"se refere a uma sequência que faz com que a RNA polimerase termine a transcrição. A região de terminação de transcrição é normalmente parte de uma unidade transcricional que pode evitar que a transcrição ou a transcrição não desejada de outros genes próximos formem outros promotores  potenciais e possam aumentar a estabilidade do mRNA.

[0060] O "anticorpo" se refere a uma classe de proteínas plasmáti- cas produzidas pelas células B do sistema imune após a estimulação por um antígeno. Os anticorpos de mamíferos (isto é, Humano) são as imunoglobullinas das classes Ig G, M, A, E ou D. O termo "anticorpo" como usado com os objetivos da presente invenção inclui, mas não está limitado a, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, aut- anticorpos e anticorpos antiidiotípico presentes em doenças autoimu- nes, tais como diabete, esclerose múltipla e artrite reumatóide, bem como anticorpos quiméricos.

[0061] Em um aspecto, a presente invenção fornece um vetor ex- pressável em um hospedeiro compreendendo uma região promotora do operon da manose operavelmente ligado a uma unidade transcrici- onal compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é heteró- loga àquele hospedeiro, enquanto que a expressão da sequência do dito ácido nucleico é controlada pela região promotora do dito operon da manose.

[0062] O vetor de acordo com a invenção é preferivelmente um plasmídio autônomo ou autorreplicável, um cosmídio, um fago, um vírus ou um retrovírus. Uma grande variedade de combinações de hos- pedeiro/vetor pode ser empregada nas expressões das sequências de ácidos nucleicos da presente invenção.

[0063] Os vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir de segmentos de sequências cromossômicas, não-cromossômicas e/ou sintéticas de ácidos nucleicos. Os vetores adequados incluem vetores com uma faixa de variação específica de hospedeiro, tais como vetores específicos para, por exemplo, B.subtilis e E.coli, respectivamente bem como vetores com uma ampla faixa de variação de hospedeiros, tais como vetores úteis para bactérias Gram positivo e bactérias Gram negativo.

[0064] Plasmídios de "baixa cópia", a "média cópia"bem como de "alta cópia"podem ser usado.

[0065] Por exemplo, no Bacillus subtilis um plasmídio de baixa cópiaé o pAMbeta1, os plasmídios de média cópia são derivados do pBS72 e um plasmídio de alta cópia é o pUB110.

[0066] De acordo com a presente invenção a região promotora do operon da manose compreende a região promotora manR e a região promotora manP, respectivamente.

[0067] A sequência de ácido nucleico do B.subtilis que abrange a extremidade da terminação C do manR, região intergênica entre manR e o manP, seguido pelo gene da lisostafina lys como gene repórter, é dada na figura 1. A sequência de ácido nucleico da presente invenção compreende a região promotora do manP preferivelmente compreendendo a sequência de ácido nucleico da figura 1 do Bp -80 para o có- don de início da lys (SEQ ID No.1) e mais preferivelmente a sequência de ácido nucleico da figura 1 do Bp-80 e inclusivamente bp-1, isto é à montante da iniciação da transcrição situam um em bp+1 (SEQ ID No.2).

[0068] A sequência de ácido nucleico do B.subtilis que abrange a região promotora do manR, o sítio de iniciação da transcrição G em bp+1, uma sequência cre putativa, a região de iniciação da transcrição entre bp+1 e manR, bem como parte do manR, é dada na figura 2 e na figura 3, em que o manRé substituído por lacZ. A sequência de ácido nucleico que da presente invenção compreende a região promotora do manR preferivelmente compreende a sequência de ácido nucleico da figura 3 do Bp -122 ao códon de início do lacZ (SEQ ID No.3), mais preferivelmente, a sequência de ácido nucleico da figura 3 do Bp -122 e bp +7, isto é, inclusivamente a sequência putativa cre, (SEQ ID No.4), e, em particular, a sequência de ácido nucleico da figura 3 de Bp -122 e BP -1, isto é à montante do sítio de início da transcrição G em  pb+1 (SEQ ID No.5).

[0069] Tanto as regiões promotoras do manP como do manR compreendem sítios de ligação do manR. A presente invenção também abrange uma sequência complementar a qualquer uma das SEQ ID Nos.1 a 5 e variantes das mesmos.

[0070] As regiões promotoras do operon da manose, tais como a região promotora manP, a região promotora manR (com ou sem sequência cre) bem como as regiões promotoras de acordo com as sequências SEQ ID Nos. 1 a 5, uma sequência complementar dos mesmos ou variantes dos mesmos usadas na presente invenção é normalmente do operon da manose do B.subtilis ou de uma região promotora equivalente funcional de outros organismos procarióticos, em particular de organismos da família bacilaceae. Uma região promotora equivalente funcional de outros organismos procarióticos abrange uma região promotora que é induzível pela D-manose, isto é, uma região promotora possuindo uma atividade de expressão mais alta na presença do que a ausência da manose.

[0071] Em muitos organismos procarióticos, tais como Firmicutes como B.subtilis, o operon da manose está envolvido no metabolismo da D-manose.

[0072] O B. subtilis pode usar muitos diferentes açúcares como fontes de carbono. As hexoses, tais como glicose e D-manose são principalmente absorvidas via o sistema de fosfoenolpiruva- to:carboidrato fosfotransferase (PTS). No PTS, a respectiva hexose é simultaneamente fosforilada e transportada na célula durante a absorção. A absorção e a utilização de um substrato de açúcar específico estão sujeitas à repressão do catabólito de carbono (CCR). Na presença de glicose, o substrato de açúcar preferido do B.subtilis, a transcrição dos genes para absorção e utilização de outros substratos, tais como o operon da manose, é reprimido. O mecanismo CCR de- pendente da glicose no B.subtilis foi amplamente estudado e é conhecido na técnica (Stulke J. et al., "Regulation of carbon catabolism in Bacillus species", in Annu. Rev. Microbiol. 54, 2000, as páginas 849880).

[0073] A unidade transcricional de acordo com a presente invenção normalmente também compreende uma região de iniciação de tradução à montante do ponto de iniciação (códon de partida) da tradução da dita unidade transcricional, enquanto que a região de iniciação de tradução é operavelmente ligado à sequência de ácido nuclei- co. A região de iniciação de tradução é normalmente localizada à montante diretamente adjacente ao ponto de iniciação da tradução da unidade transcricional que pode ser ATG, GTG ou TTG.

[0074] A região de iniciação de tradução pode ser a região de iniciação de tradução da unidade transcricional do gene manP ou do gene manR no operon da manose. A região de iniciação de tradução do manP ou o gene manR do operon da manose podem ser parcialmente ou totalmente substituídos por outra região de iniciação de tradução. Por exemplo, podem ser usadas as regiões de iniciação de tradução do tufA (fator de alongamento Tu) e gsiB (proteína de estresse; Jurgen et al., 1998, Mol. Gen. Genet.. 258, 538-545) ambos do B.subtiliis.

[0075] As respectivas sequências de ácido nucleico do tufA e gsiB são mostradas abaixo com o códon de partida grafado em negrito, os sítios de restrição estão sublinhados e destacados na sequência Shine-25 Dalgarno. tufA: 5’- cttaBiiiSTTTTAGAATGGCTAAAGAAAAATTCqqatcc -3' Affll SD Startcodon Sam HI gsiB: 5’- cttaaqAATTAAAGGAGGAATTCAAAATGGCAGACAATAACAAAqqatcc -3’ >4/711 SD Startcodon Sa/nHI

[0076] Pela seleção adequada da região de iniciação da transcrição a estabilidade do mRNA pode ser realçada, o que é uma característica importante na expressão genética. A estabilidade do mRNA é caracterizada pela sua meia-vida específica.

[0077] Além da região de iniciação da transcrição também o ponto de iniciação da tradução bem como, opcionalmente, vários códons do gene depois do ponto de iniciação, por exemplo, aproximadamente 5 a 6 códons, podem ser substituídos, por exemplo tal como mostrado acima nas sequências de ácido nucleico do tufA e gsiB, respectivamente.

[0078] A região de iniciação de tradução pode compreender também uma sequência que codifica operavelmente a sequência de sinal ligado à sequência de ácido nucleico heteróloga da invenção. A sequência de sinal é normalmente localizada à jusante diretamente adjacente ao ponto de iniciação da tradução, que pode ser ATG, GTG ou TTG da unidade transcricional.

[0079] No caso em que é usada uma unidade transcricional dicis- trônica ou o policistrônica, podem ser aplicadas sequências de sinal diferentes ou idênticas operavelmente ligadas a cada um dos cistrons. As sequências de sinal preferivelmente diferentes são usadas em tal caso. A sequência de sinal usada pode ser uma sequência de sinal procariótica ou eucariótica. As sequências de sinal procarióticas são normalmente aplicadas.

[0080] As sequências do DNA que codificam sequências de sinal a serem empregadas nos vetores de expressão da presente invenção podem ser obtidas comercialmente ou sintetizadas quimicamente. Por exemplo, as sequências de sinal podem ser sintetizadas de acordo com o método trimestre de fosforamidite descrito, por exemplo, em Beaucage & Caruthers, 1981, Tetrahedron LeHs. 22, 1859-1862; como descrito em Van Devanter e. AL, Nucleic Acids Res. 12:6159-6168  (1984) . A purificação de oligonucleotídios pode ser executada ou por eletroforese de gel de acrilamida nativa ou por HPLC de troca iônica como descrito em Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983).

[0081] Normalmente a unidade transcricional também compreende uma região de terminação de transcrição.

[0082] Preferivelmente são usadas as regiões de terminação de transcrição forte para evitar a "leitura completa" pelo promotor fora da unidade de transcrição na sequência de plasmídio flanqueando a mesma bem como de outros promotores de plasmídio na unidade de transcrição. Adicionalmente, a estabilização do mRNA foi observada na presença de tal região de terminação de transcrição.

[0083] Um exemplo adequado de uma região de terminação de transcrição forte tem a sequência de ácido nucleico 5’- CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3’ da região 3’- do tufA do B.subtilis 168 que está comercialmente disponível.

[0084] A sequência de ácido nucleico heteróloga de acordo com a presente invenção codifica um produto de expressão que é alheio ao hospedeiro. No caso em que o hospedeiro é uma espécie procariótica, tal como B.subtilis ou E.coli a sequência de ácido nucleico de interesse pode ser mais preferivelmente de outra classe como a gama- proteobacteria tal como, por exemplo, a Burkholderia sp., em particular de um filo diferente, tal como as archae bactérias, mais particularmente de um organismo eucariótico, tal como mamíferos em particular de humanos. Contudo, a sequência de ácido nucleico heteróloga poderia ser modificada de acordo com o "uso do códon"do hospedeiro. A sequência heteróloga de acordo com a presente invenção é normalmente um gene de interesse. O gene de interesse preferivelmente cerca um polipeptídio heterólogo, tal como uma proteína estrutural, reguladora ou terapêutica, as fusões de terminação N- ou C- da proteína estrutural, reguladora ou terapêutica com outras proteínas ("Marcação"), tais como proteína fluorescente verde ou outras proteínas de fusão. A sequência heteróloga de ácido nucleico poderia codificar também um transcrito que pode ser usado na forma do RNA, tal como, por exemplo, RNA antissentido.

[0085] A proteína pode ser produzida como um agregado insolúvel ou como uma proteína solúvel que está presente no citoplasma ou no espaço periplasmático da célula hospedeira, e/ou no meio extracelular. Preferivelmente, a proteína é produzida como uma proteína solúvel que está presente no espaço periplasmático da célula hospedeira e/ou no meio extracelular.

[0086] A proteína heteróloga de interesse pode ser de origem humana, mamífera ou procariótica. Outras proteínas são antígenos, tais como glicoproteínas e carboidratos de agentes patogênicos microbianos, tanto virais como antibacteriano, e de tumores. Outras proteínas são enzimas tal como quimiosina, proteases, polimerases, desidroge- nases, nucleases, glucanases, oxidases, alfa amilases, oxirredutases, lipases, amidases, nitrilo hidratases, esterases ou nitralases.

[0087] Na presente invenção a ordem e a distância na qual a sequência de sinal e as sequências de ácido nucleico heterólogas são combinadas dentro dos vetores de expressão podem ser variadas. Em modalidades preferidas a sequência de sinal é 5’ (à montante) em relação à sequência de ácido nucleico que codifica, por exemplo, o poli- peptídio de interesse. A sequência de sinal e a sequência de ácido nu- cleico que codifica, por exemplo, o polipeptídio de interesse podem ser separadas por nulo até aproximadamente 1000 aminoácidos. Em modalidades preferidas, a sequência de sinal e a sequência de ácido nu- cleico que codifica, por exemplo, o polipeptídio de interesse são diretamente adjacentes um a outro, isto é separadas por ácidos nucleicos nulos.

[0088] Preferivelmente, o vetor da presente invenção compreende uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das sequências SEQ ID Nos 1 a 5, uma sequência complementar das mesmas e variantes das mesmas.

[0089] Também abrangido pela presente invenção está o uso de um vetor de acordo com a invenção para a expressão heteróloga regulada de uma sequência de ácido nucleico em um hospedeiro procarió- tico.

[0090] A expressão é iniciada pela adição de um indutor adequado. O indutor do operon da manose é a manose ou um derivado da mesma capaz de induzir a região promotora manR ou a região promotoramanP do operon da manose. A expressão pode ser regulada pela quantidade de indutor disponível para o hospedeiro procariótico.

[0091] Em ainda outro aspecto a invenção fornece uma sequência de ácido nucleico isolada e purificada compreendendo uma região promotora do operon da manose. Preferivelmente, a sequência de ácido nucleico isolada e purificada compreende o promotor manP e/ou o promotor manR do operon da manose. Mais preferivelmente, a sequência de ácido nucleico isolada e purificada compreende qualquer uma das SEQ ID Nos de 1 a 5. A sequência de ácido nucleico isolada e purificada compreendendo uma região promotora do operon da ma- nose pode ser operavelmente ligado a uma unidade transcricional compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um po- lipeptídio, em que a expressão da sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídio está sob controle da região promotora do operon da manose.

[0092] A sequência de ácido nucleico isolada e purificada de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência completa ou parcial do gene regulador manR.

[0093] Pelo menos a sequência de ácido nucleico isolada e purificada do promotor manR pode compreender uma sequência cre.

[0094] A sequência de ácido nucleico isolada e purificada da presente invenção pode ser isolada de acordo com protocolos de PCR padrão de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. A sequência do DNA purificada e isolada pode compreender também uma ou mais sequências reguladoras, tal como conhecido na técnica, por exemplo, um intensificador, normalmente empregado para a expressão do produto codificado pela sequência do ácido nucleico.

[0095] Para selecionar células hospedeiras com sucesso e esta- velmente transformadas com o vetor ou a sequência de ácido nucleico isolada e purificada da presente invenção, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) pode ser introduzido nas células hospedeiras junto com a sequência de ácido nucleico de interesse. O gene que codifica um marcador selecioná- vel poderia estar localizado no vetor ou na sequência de ácido nuclei- co isolada e purificada ou poderia ser opcionalmente co-introduzida em uma forma separada, por exemplo, em um vetor separado. Vários marcadores selecionáveis podem ser usados incluindo aqueles que conferem a resistência a antibióticos, tais como espectinomicina, hi- gromicina, ampicilina e tetraciclina. A quantidade do antibiótico pode ser adaptada como desejado para criar condições seletivas. Normalmenteé usado um marcador selecionável.

[0096] No caso em que o vetor é um vetor de transporte um marcador comum adequado aos hospedeiros pode ser selecionado. Por exemplo, no caso em que o vetor é um vetor de transporte replicável tanto em E.coli como no B.subtilis o gene marcador de resistência que codifica a espectinomicina - o adeniltransferase de Enterococcus fae- calis pode ser usado que confere a resistência à espectinomicina.

[0097] Do mesmo modo, os genes repórteres, tais como proteínas fluorescentes podem ser introduzidos nas células hospedeiras juntamente com a sequência de ácido nucleico de interesse, para determi-  nar a eficiência da transformação.

[0098] Os genes repórteres adequados, por exemplo, são aqueles codificando a proteína fluorescente verde melhorada (eGFP) e lacZ codificando a β-galactosidase. Tanto os genes repórteres estão comercialmentedisponíveis como são amplamente usados.

[0099] Outro aspecto relativo a presente invenção deve fornecer um hospedeiro procariótico transformado com um vetor da presente invenção em que o vetor compreende uma região promotora do ope- ron da manose. Preferivelmente o vetor compreende qualquer uma das SEQ ID Nos de 1 a 5, uma sequência complementar dos mesmos ou variantes dos mesmos.

[00100] Uma grande variedade de células hospedeiras procarióticas é útil para ser transformada com uma região promotora induzível pela manose do operon da manose de acordo com a presente invenção. Estes hospedeiros podem incluir cepas de células Gram positivo, tais como Bacillus e Streptomyces, ou células Gram-negativo, tais como E.coli e Pseudomonas. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula Gram positivo, em particular do filo Firmicutes, mais preferivelmente a célula hospedeira é um Bacillus.

[00101] Os Bacilluss que podem ser usados são, por exemplo, as cepas B.subtilis, B.amyloliquefaciens, B.licheniformis, B.natto, B.megaterium, etc. Preferivelmente, a célula hospedeira é B.subtilis, tal como B.subtilis 3NA e B.subtilis 168.

[00102] As E.coli que podem ser usadas são, por exemplo, as cepas TG1, W3110, DH1, XL1-azul e Origami, que estão comercialmente disponíveis.

[00103] As células hospedeiras adequadas estão comercialmente disponíveis, por exemplo, de coletas de cultura, tais como o DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemanha).

[00104] Por exemplo, o Bacillusé conseguível do Centro de EstoqueGenético de Bacilluss.

[00105] A célula hospedeira pode ou não metabolizar a manose. Uma célula hospedeira que é ordinariamente capaz de absorver e me- tabolizar a manose como B.subtilis poderia ser modificada para ser deficiente em uma ou mais funções referidas à absorção e/ou o metabolismo da manose. A deficiência em uma ou mais funções referentes à absorção e/ou o metabolismo da manose pode ser atingida suprimindo ou bloqueando, por exemplo, a expressão de um gene codificando uma proteína, tal como o gene codificando o manA para a ma- nose-6-fosfato-isomerase. Isto pode ser feito por uma técnica conhecida, tal como a mutagênese suportada por transposon ou mutação de nocaute.

[00106] Normalmente, o hospedeiro procariótico corresponde às sequências de sinal escolhidas, por exemplo, no caso em que são usadas as sequências de sinal do Bacillus, a célula hospedeira é normalmente membro da mesma família das bacillacea, mais preferivelmente a célula hospedeira é uma cepa de Bacillus.

[00107] Preferivelmente é usado um hospedeiro que possui um sistema de fosfoenolpiruvato:carboidrato fosfotransferase (PTS). Particularmente, o hospedeiro que possui um sistema de PTS é um microrganismo da ordem Bacillales, em particular do gênero Bacillus e mais preferivelmente da espécie Bacillus subtilis ou um microrganismo da ordem Enterobacteriales, preferivelmente do gênero Escherichia e mais preferivelmente da espécie E.coli.

[00108] O elemento primário de CCR é o proteína A de controle de catabólito (CcpA), que é capaz de se ligar à sequência cre, tal como a sequência cre putativa nas SEQ ID Nos 3 e 4. No estado ligado da transcrição CcpA do respectivo gene, aqui o manR, é reprimido.

[00109] Na ausência de glicose e na presença de um indutor, tal como D-manose, não há nenhuma repressão pela ligação de CcpA e a transcrição dos genes do operon da manose são iniciados pela ligação da proteína reguladora (ManR) aos respectivos sítios de ligação das regiões promotoras do operon da manose. Surpreendentemente foi encontrado pelos inventores presentes, que ManRnão é só a proteína reguladora da região promotora manP mas um autoregulador do própriomanR.

[00110] Também fornecido pela presente invenção é um método para produzir um polipeptídio em uma célula hospedeira, compreendendo as etapas de: a) Construção de um vetor, b) Transformação de um hospedeiro procariótico com o dito vetor, c) Permitir a expressão do dito polipeptídio em um sistema de cultura de células sob condições adequadas, d) Recuperação do dito polipeptídio do sistema de cultura de células.

[00111] O vetor usado, bem como a sua construção e a transformação de um hospedeiro procariótico são como definido acima, enquanto que a sequência heteróloga de ácido nucleico compreendida pelo vetor codifica um polipeptídio.

[00112] Como sistema de cultura de células podem ser aplicadas a cultura contínua ou descontínua, tal como cultura em batelada ou cultura em batelada alimentada, em tubos de cultura, frascos agitados ou fermentadores bacterianos.

[00113] Para o cultivo o meio convencional das células hospedeiras tal como conhecido na técnica pode ser usado, tal como um meio complexo como "meio de caldo de levedura nutriente", um glicerol contendo um meio tal como descrito por Kortz et al. 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, um meio de sal mineral tal como descrito por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1, um meio de batelada de fermentação de E.coli como descrito por Wilms et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 73, 95103 ou um meio LB tal como descrito por Bertram et al, 1051, J. Bacte- riol. 62, 293-300.

[00114] O meio compreende uma fonte de carbono adequada, por exemplo, como açúcar, tal como glicose, como um substrato da célula hospedeira a ser cultivada. A fonte de carbono usada como o substrato é diferente do indutor.

[00115] O meio poderia ser modificado conforme apropriado, por exemplo, acrescentando ingredientes adicionais, tais como tampões, sais, vitaminas, aminoácidos, antibióticos ou outros micronutrientes como são genericamente conhecidos daqueles versados na técnica.

[00116] Do mesmo modo diferentes meios ou combinações de meios podem ser usados durante o cultivo das células.

[00117] Preferivelmente, o meio usado como meio básico não deve incluir o indutor, de modo a atingir uma regulação fina das regiões promotoras de manose.

[00118] A adição do indutor pode ser iniciada após a cultura atingir um determinado parâmetro. Os exemplos de tais parâmetros de determinação são a densidade óptica (DO) indicação da concentração celular da cultura, ou concentração da fonte de carbono, que é diferente do indutor.

[00119] Por exemplo, no presente processamento o indutor pode ser acrescentado após a cultura atingir uma DO apropriada dependendo do sistema de cultura específico. Para cultura em batelada em frascos agitados um DO600 típico como determinação de parâmetro é de aproximadamente 0,3 ou mais alto.

[00120] Normalmente, a quantidade do indutor, tal como a manose, no meio da cultura do hospedeiro procariótico é ajustada para ser de aproximadamente 10 g/l, preferivelmente de aproximadamente 5 g/l,  mais preferivelmente aproximadamente 2 g/l.

[00121] Contudo, a quantidade do indutor acrescentado pode ser adaptada ás exigências de um processo de fermentação específico.

[00122] O modo de adição do indutor (regime de indução) pode ser selecionado de acordo com o sistema de cultura específico.

[00123] Pelo modo da taxa de crescimento de adição e a taxa de expressão das células hospedeiras pode ser também regulado.

[00124] Por exemplo, a manose pode ser acrescentada descontinu- amente ou continuamente durante períodos do tempo adequados. No modo descontínuo (indução de impacto) a adição pode ser de uma vez, somente no ponto de indução, ou duas vezes ou até várias vezes em intervalos adequados. O modo adequado depende do sistema de cultura e pode ser prontamente determinado por aqueles versados na técnica.

[00125] Por exemplo, no modo contínuo, a manose pode ser acrescentada em uma taxa constante ou a uma taxa decrescecnte / crescente.

[00126] A adição contínua pode estar também dentro de um intervalo de tempo selecionado da cultura, intervalo de tempo, por exemplo, selecionado durante o crescimento exponencial da cultura. Adicionalmente,é possível uma combinação do regime de indução descontínuo e contínuo.

[00127] De acordo com uma modalidade da cultura em batelada alimentada da presente invenção na fase de batelada as células são cultivadas a uma densidade celular entre 20 a 30 DO600 e, depois, o cultivo é alterado para fase alimentada com a adição de uma mistura da fonte de carbono primária e de manose. Na fase alimentada a razão da fonte de carbono primária para manose pode ser variada, as razões adequadas são de 3:1 a 1:3. Pela variação da razão fonte de carbono primária: manose, a taxa de expressão pode ser controlada.

[00128] As faixas de variação de pH apropriados são, por exemplo, de 6 a 8, preferivelmente 7- a 7,5, as temperaturas de cultura apropriadasestão entre 10 e 40°C, preferivelmente entre 30 e 37°C.

[00129] As células são incubadas normalmente enquanto elas absorvem a quantidade máxima de produto expressado e/ou de biomassa que se tenha acumulado, preferivelmente entre 1 hora e 20 dias, mais preferivelmente entre 5 horas e 3 dias.

[00130] Como o rendimento da biomassa a quantidade do produto expressado depende do sistema de cultura usado.

[00131] Na cultura em frasco agitado normalmente expressava o produto a quantidade de 0,5 g/L de meio de cultura pode ser produzida com um hospedeiro transformado com um vetor da presente invenção. Usando uma cultura em fermentador, em um modo de batelada e/ou batelada alimentada o produto é expressado em uma quantidade de normalmente mais do que 0,5 g/l caldo de fermentação, preferivelmente mais de 1 g/l, mais preferivelmente mais do que 1,3 g/l podem ser obtidos.

[00132] Adicionalmente, no processo de fermentação daqueles da presente invenção usando células hospedeiras da presente invenção altas densidades celulares podem ser obtidas de pelo menos 10 a 30 DO600, em particular de pelo menos 50 DO600, preferivelmente aproximadamente 250 DO600 ou mais, mais preferivelmente pelo menos 500 DO600 e bem mais preferível de pelo menos 1000 OD600. Particularmente, em um processo de batelada alimentada de acordo com as densidades celulares da presente invenção podem ser obtidas entre 50 DO600 até mais de 1000 DO600.

[00133] Como forma de ilustração, 1 DO600 corresponde à aproximadamente 0,322 g de massa seca por litro, em média. Consequentemente, um valor de DO600 de 100 corresponde à massa seca de 32,2 g por litro e 500 DO600 161 g de massa seca por litro.

[00134] Além disso, as células hospedeiras de acordo com a presente invenção permitem uma alta taxa de duplicação sem a perda do vetor.

[00135] Seguindo a expressão na célula hospedeira, o produto expressado, tal como um polipeptídio de interesse pode então ser recuperado da cultura de células hospedeiras. Para obter um rendimento máximo do produto expressado, as células são normalmente colhidas no fim da cultura e lisadas, tal como lise por tratamento de lisozima, ultrassom ou prensa. Assim, os polipeptídios são normalmente primeiro obtidos como o lisado bruto das células hospedeiras. Eles podem depois ser purificados por procedimentos de purificação de proteína padrão conhecidos na técnica que podem incluir a precipitação diferencial, a cromatografia em peneira molecular, a cromatografia de trocaiônica, a focagem isoelétrica, a eletroforese em gel e a cromatogra- fia de afinidade e de imunoafinidade. Estes métodos bem conhecidos e costumeiramente praticados são descritos em, por exemplo, Ausubel et al., supra., e Wu et al. (editores). Academic Press Inc, Nova York; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology. Por exemplo, para a purificação das imunoglobulinas recombinantementes produzidas, elas podem ser purificadas com a cromatografia de imunoafinida- de pela passagem através de uma coluna contendo uma resina que ligou em si própria as moléculas alvo nas quais as imunoglobulinas expressadas podem ligar especificamente.

[00136] A presente invenção também se refere a métodos e meios para a expressão heteróloga intracelular de ácidos nucleicos que codificam, por exemplo, um polipeptídio em um hospedeiro procariótico. Particularmente a presente invenção se refere a vetores e ao uso de tais vetores para a expressão intracelular de um polipeptídio heterólo- go em um hospedeiro procariótico usando o vetor da presente invenção. Na expressão intracelular o polipeptídio é expressado dentro do citoplasma e não é transportado do citoplasma para localizações não- citoplasmáticas. O polipeptídio será expressado dentro do citoplasma na forma de corpos de inclusão ou na forma solúvel. Os procedimentos para isolar e purificar polipeptídios da célula, em particular do extrato celular, também são bem conhecidos.

[00137] Os promotores da manose da presente invenção são vantajosos pelo fato de que eles podem ser finamente regulados, induzidos por um composto comum e não tóxico e, por isso, industrialmente útil.

[00138] Adicionalmente, os promotores da manose da presente invenção bem como vetores compreendendo aqueles promotores da manose são estáveis dentro das células e não são perdidos até depois de uma multiplicidade de duplicações das células. Assim, é possível a fermentação de alta densidade celular com as células hospedeiras transformadas de acordo com a presente invenção.

[00139] Aqueles versados na técnica apreciarão a invenção descrita aqui é suscetível de variações e modificações diferentes daquelas especificamente descritas. Deve-se entender que a invenção inclui todas tais variações e modificações sem fugir do espírito ou características essenciais das mesmas. A invenção também inclui todas das etapas, características, composições e compostos mencionados ou indicados no presente relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e qualquer uma e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das ditas etapas ou características. A presente divulgação, por isso, deve ser considerada em todos os aspectos ilustrados, como não restritiva; o alcance da invenção sendo indicado pelas reivindicações anexadas, e todas as modificações que estão dentro da significação e a faixa de variação de equivalência está destinada a ser abarcada pelo mesmo. Várias referências são citadas em todas as partes deste relatório descritivo, cada um dos quais é incorporado aqui pela referência em sua totalidade.

[00140] A descrição precedente será mais totalmente entendida com referência aos exemplos seguintes. Tais exemplos são, contudo, exemplos de métodos da prática da presente invenção e não estão destinados a limitar o alcance da presente invenção.

1) Isolamento e identificação de regiões promotoras do promotor manR e do promotor manP do operon da manose.

[00141] Se não afirmado de outra maneira os seguintes materiais e métodos foram usados:

Cepas bacterianas e condições de crescimento.

[00142] E. coli JM109 (Yanisch-Perron C. et al., Gene 33, 1985, 103-119) e Bacillus subtilis 3NA (Michel J. F. et al., J. Appl. Bacteriol. 33, 1970, 220-227) foram usados como hospedeiros principais de clonagem e expressão. E. coli foi cultivada no meio líquido de LB (Luria S. E. et al., Virology 12, 1960, 348-390) e as placas de agar de LB suplementadas com 100 μl / ml de ampicilina ou a espectinomicina a 37°C. O B. subtilis foi cultivado no meio de líquido de LB e meio mínimo de C ou S a 37°C (Martin-Verstraete I. et al., J. Mol. Biol. 214, 1990, 657-671). O meio líquido e as placas de agar foram complementados com 100 μl / ml espectinomicina, 10 μl / ml canamicina ou 5 μl / ml de eritromicina, respectivamente. Para a indução do promotor da manose, a D-manose filtrada ou autoclavada estéril foi acrescentado a uma concentração final 0,2 % de (p/v).

Materiais.

[00143] Todos os produtos químicos foram obtidos de Sigma- Aldrich (Taufkrichen, Alemanha), Fluka (Buchs, Alemanha) ou Merck (Darmstadt, Alemanha). Os oligonucleotídios do DNA sintéticos foram comprados da Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha). As enzimas de restrição e as enzimas de modificação do DNA foram compradas da Roche Applied Science (o Mannheim, Alemanha) ou New England Biolabs (Frankfurt am Main, Alemanha). PCRs foram corridos com polimerase de Alta Fidelidade-DNA polimerase da Fermentas (ST. Leon-Rot, Alemanha) em um miniciclador do Biozym.

Preparação e Transformação do DNA.

[00144] Isolamento do DNA de E.coli e B.subtilis ou do gel de agarose foi realizado com kits de preparação do DNA da Qiagen (Hilden, Gemrany) ou Roche (Mannheim, Alemanha) tal como descrito pelo fabricante. As técnicas moleculares padrão foram usadas em todas as partes dos exemplos.

[00145] A E.coli foi transformada com o plasmídio DNA como descrito por Chung C.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, 21722175. O B.subtilis foi transformado com o plasmídio DNA de acordo com o "método Paris" modificado (Harwood C.R. Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, John Wiley & Sons Ltd., Inglaterra).

Medição de atividade da β-galactosidase

[00146] 0,1 ml das células a serem examinadas em 0,9 ml de tam pãoZ foram tratadas com 10 ul do tolueno por 30 minutos a 37°C. A atividade da β-galactosidase foi determinada com o o-nitrofenil-3- galactopiranosídio em 22°C de acordo com o método de Miller (Miller J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, NY). Oligonucleotídios usados. Tabela 1.

Experiment to 1:

[00147] Isolamento de fragmento do DNA que transporta as regiões promotoras do operon da manose e determinação de sítios de iniciação da transcrição do promotor manR e do promotor manP.

[00148] DNA cromossômico do Bacillus subtilis 168 foi isolado usando DNeasy Blood & Tissue Kit da Qiagen (Hilden, Alemanha).

[00149] Um fragmento do DNA de aproximadamente 2,3 kb com o manR completo com o promotor manR putativo e a região intergênica entre manR e manP foi amplificado a partir do DNA obtido por PCR usando o iniciador s4693/s4694.

[00150] O fragmento do DNA obtido de aproximadamente 2,3 kb foi usado para um experimento de iniciador de extensão para determinar os sítios de iniciação da transcrição do promotor manR e do promotor manP.

[00151] Para isolamento do mRNA do iniciador de extensão um fator de transporte foi construído do vetor de E.coli plC20HE (Altenbu- chner et al., 1992, Methods Enzymol. 216, 457-466) e o vetor do B.subtilis pUB110 (MacKenzie et al., 1986, Plasmid 15, 93-103). O vetor continha o gene lys como gene repórter, codificando a forma madura da lisostafina do Staphylococcus simulans (Recsai et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1127-1131).

[00152] Nesta alta cópia do derivado pUB110 o fragmento do DNA de 2,3 kb foi clonado à montante ao gene da lisostafina. O plasmídio resultante foi denominado pSUN178.4 e introduzido no Bacillus subtilis 3NA.

[00153] Bacillus subtilis 3NA com o plasmídio pSUN178.4 foi cultivado no meio de LB com canamicina. Na fase de crescimento exponencial a cultura foi induzida com manose a 0,2%. Após crescimento de 1 hora a 37 °C as células induzidas e não-induzidas foram recolhidas. O RNA total foi isolado com o Kit Mini Qiagen-RNeasy.

[00154] Com Cy5 na extremidade 5’, os iniciadores marcados s5006, s5007, s5097 e s5098 foram usados.

[00155] Iniciador s5006 e s5007 hibridizado respectivamente de +21 a +50 e de +76 a +105 em relação ao códon de início do gene da lisos- tafina. Iniciador s5097 e s5098 hibridizado respectivamente de +81 a +101 e de +131 a +153 em relação ao códon de início do manR.

[00156] Os mesmos iniciadores foram usados para a reação de se- quenciamento do plasmídio DNA de pSUN178.4, que serviu como padrão de tamanho. O Transcriptase Reversa AMV e a polimerase T7- DNA da Roche foram usados, respectivamente, para a transcrição reversa e sequenciamento do DNA. Os produtos de transcrição reversa e sequenciamento foram analisados em um gel de sequenciamento de poliacrilamida de desnaturante (GE Healthcare). Todos outros reagentes usados foram fornecidos pelo kit AutoRead de sequenciamento da Amersham Pharmacia Biotech.

[00157] O sítio de iniciação da transcrição do promotor manP foi determinado usando iniciador s5006. As reações de sequenciamento do DNA do plasmídio pSUN 178.4 com o mesmo iniciador foram preparadas e corridas no mesmo gel desnaturante para comparação. A figura 1 mostra a sequência do DNA em volta do promotor manP com o sítio de iniciação da transcrição em um (nucelotídio adinina) sendo destacado, as caixas deduzidas -10 e -35 estão em itálico, a extremidade do gene manR e o início do gene lyssão marcados por setas, os sítios de restrição de Bgl-ll, Xbal, AfIII e Ndelestão sublinhados.

[00158] O sítio de iniciação da transcrição do promotor manR foi determinado com isolamento do RNA e sequenciamento do DNA sendo realizado como descrito acima em relação ao promotor manPexceto que o iniciador s5098 foi usado que liga no gene manR.

[00159] Nas figuras 2 e 3 a sequência do DNA da região promotora manRé mostrada com o sítio de iniciação da transcrição em G (nuce- lotídio guanina) estando destacada, as caixas deduzidas -10 e -35 em itálico, e os inícios do gene lys e do gene manR, respectivamente, sendo indicados por uma seta. Os sítios de restrição e uma sequência putativa creestão sublinhados.

[00160] A transcrição do promotor manR e em particular do promotor manP foi fortemente aumentada quando as células foram induzidas pela manose como foi visto pelos sinais muito mais fortes no experimento de iniciador de extensão.

[00161] Os iniciadores usados são mostrados na Tabela 1 acima.

Experimento 2:

[00162] O experimento de iniciador de extensão de acordo com Ex-perimento 1 localizou o sítio de iniciação da transcrição do promotor manP perto da extremidade 3’ da região intergênica entre manR e o começo do manP. Para determinar a região promotora manP mais precisamente o fragmento do DNA de 2,3 kb foi encurtado passo a passo por Amplificação com PCR, os fragmentos de sequência obtidos de diferentes comprimentos clonados de volta ao mesmo vetor de expressão básico e a expressão foram estudados.

a) Construção de vetor de expressão básico

[00163] Um vetor de expressão com sem promotor lacZ como gene repórter foi construído. O vetor de expressão foi projetado como um vetor de transporte capaz da réplica tanto no B.subtilis como em E.coli e denominou pSUN272.1.

[00164] O gene repórter lacZ foi cortado com Ndel e Xmal de pLA2 (Haldimann A. et al, 2001, J. Bacteriol. 183, 6384-6393) e ligado em pJOE5531.1, um derivado do vetor de expressão induzível rhamnose pWA21 (Wegerer et al., 2008, BMC. Biotechnol. 8, 2) que continha o terminador de transcrição de tufA do B.subtilis no sítio Xmal. Neste plasmídio um par de oligonucleotídios S4956/4957 foi inserido entre os sítios de restrição AfIII/MunI para acrescentar o mesmo terminador de transcrição de tufAà montante do lacZ. Portanto a "leitura do princípio ao fim" de promotores de plasmídio em lacZ bem como "leitura do princípio ao fim" fora de lacZ nas sequências que flanqueiam o plas- mídio foi evitada pelos terminadores. Um gene spc de resistência à espectinomicina tanto para E.coli como para B.subtilis foi amplificado a partir do plasmídio pDG1730 (Geurout-Fleury et al., 1996, Gene 180, 57-61) com oligonucleotídios S4833/4835 e inserido no plasmídio obtido acima. Além disso, a parte do vetor da E.coli foi encurtada eliminando um fragmento BspHI\HindIII. Posteriormente, um fragmento EcoRI/SphI com a região de replicação do B.subtilis pMTLBS72 (La- godich et al., 2005, Mol. Biol. (Mosk) 39, 345-348) foi ligado no plasmí- dio.

[00165] O fragmento do DNA de 2,3 kb obtido no Experimento 1 foi inserido em pSUN272.1 em frente de lacZ por digestão com AftIII e Nhel e a ligação, obtendo assim o vetor de expressão pSUN279.2 com o mapa de plasmídio tal como mostrado na figura 4.

[00166] Os iniciadores usados são mostrados na Tabela 1 acima.

b) Determinação de eficiência de expressão de vetor pSUN279.2

[00167] Os plasmídios pSUN279.2 e pSUN272.1 obtido em a) acima foram trazidos no B.subtilis 3NA. O último serviu do controle de fundo. As cepas do B.subtilis 3NA que transportam um ou outro plas- mídio foram cultivadas no meio de LB com a espectinomicina e na fase de crescimento exponencial ou 0,2% de manose, 0,2% de manose mais 0,2% de glicose ou nenhum açúcar (controle não induzido) foi acrescentado às culturas da indução. Após indução de uma hora a ati- vidade da β-galactosidase das células foi determinada através do ensaio de Miller. Os resultados são mostrados nas figuras 5 e 7.

[00168] A cultura não induzida do B.subtilis contendo pSUN279.2 mostrou já um nível basal bastante alto da atividade da β- galactosidase. A presença da manose resultou em um aumento adicional de 4 vezes da atividade da β-galactosidase enquanto que a atividade com manose e glicose foi reduzida mas foi ainda bastante acima o nível basal. Os resultados claramente indicam que a atividade do promotor vista em pSUN279.2 pode originar-se da região entre manR e manP, da região à montante do manR ou de ambos.

[00169] Por isso, a montante a região do manR bem como a maior parte de parte do manR foi ambos eliminada de pSUN279.2 cortando o fragmento do DNA de 2,3 kb de pSUN279.2 tal como mostrado na figura 4 entre Sfol e Nrul para dar o plasmídio pSUN284.1.

[00170] A sequência de ácido nucleico resultante de pSUN284.1 é mostrada na figura 6.

[00171] B.subtilis 3NA foi transformado com este plasmídio pSUN284.1 e a eficiência de expressão determinada como estabelecido acima. O resultado é mostrado na figura 5. Como pode ser visto na figura 5 esse manR eliminou o vetor pSUN284.1 no B.subtilis 3NA mostrou só aproximadamente a metade do nível basal da atividade de β-galactosidase em comparação com pSUN279.2 no B.subtilis 3NA, um aumento mesmo mais forte pela indução da manose e novamente uma redução mais forte da presença de glicose. Estes resultados comprovam que o promotor manPestá localizado entre manR e manP e mostra que a cópia cromossômica do manRé suficiente para regular todas as cópias do promotor manP nos plasmídios de baixa cópia.

c) Localização de região promotora manP

[00172] Para localizar a região promotora do manP além do fragmento do DNA encurtado de pSUN284.1 adicionais fragmentos encur- tados de sequência foram preparados do fragmento do DNA de 2,3 kb cortando em posições diferentes à montante ao sítio de iniciação da transcrição do promotor manP em sítios de restrição e por enzimas de restrição tal como mostrado na figura 6.

[00173] A eliminação abaixo de bp-81 e bp-80 à montante ao sítio de iniciação da transcrição do manP resultou em uma segunda sequência de eliminação compreendendo a SEQ ID No. 1. Uma eliminação adicional foi realizada abaixo a bp -41 e bp -40 à montante ao sítio de iniciação da transcrição do manP (terceira sequência de eliminação).

[00174] Os plasmídios compreendendo a segunda sequência de eliminação, pSUN290, e a terceira sequência de eliminação, pSUN297.5 foram construídos de um modo semelhante como plasmí- dio pSUN284.1 em 2b) acima, inserindo os produtos de PCR amplificados com iniciadores s4802/s5203 e s5262/s5203, respectivamente, em pSUN272.1 via enzimas de restrição EcoRV e Nhel.

[00175] Os plasmídios foram inseridos no B.subtilis 3NA e cultivados como estabelecido em b) acima. Após a indução de 1 hora da atividade da β-galactosidase das células, foi determinada como estabelecido em b), acima. Os resultados são mostrados na figura 7.

[00176] Tal como mostrado na figura 7 nenhuma das cepas com pSUN290 e pSUN284.1 mostrou uma diferença significante acerca da indução de lacZ pela manose. Contudo, no B.subtilis 3NA compreendendo pSUN297.5 com a terceira sequência de eliminação, a indução pela manose foi completamente abolida e o nível de expressão basal foi aproximadamente 0. Destes resultados segue que o sítio de ligação ManR da região promotora da manose manPestá localizado entre bp - 80 e -35 em relação ao sítio de iniciação da transcrição do manP.

Experimento 3: Determinação do promotor manR a) Identificação da sequência

[00177] Como a maior parte do CCR é mediado através de proteína A de controle de catabólito (CcpA) uma procura dos respectivos sítios de ligação (antes da sequência) foi realizada no operon da manose inteiro usando a função de alinhamento do DNA no programa Clone Manager. Para o alinhamento a sequência de consenso 5’- WWTGNAARCGNWWWCAWW-3’ do cre foi usada.

[00178] Só na região promotora do manR uma sequência putativa cre foi encontrada tal como mostrado nas figuras 2 e 3 sendo localizadoà jusante da caixa -10.

[00179] A SEQ ID No. 3 da presente invenção abrange a região de começo bp -122 abaixo ao códon de início do lacZ, a SEQ ID No. 4 abrange a região que começa do bp -122 a bp +7 (inclusivamente) e SEQ ID No. da presente invenção abrange a região que começa do bp -122 a bp -1 (inclusivamente) da sequência mostrada na figura 3.

b) Avaliação de eficiência de expressão do promotor manR

[00180] Para avaliar a eficiência de expressão do promotor manR um vetor de expressão como pSUN284.1 foi construído como estabelecido acima e denominado pSUN291. Para isso, um fragmento do DNA inclui o promotor manR putativo e aproximadamente 600 bp à montante do manR foram amplificados com iniciador s5208/s5209 e plasmídio pSUN279.2 do DNA linearizado como padrão e inseridos em frente de lacZ no plasmídio pSUN272.1, por digestão com Kpnl e AflIII e ligação. A sequência do DNA é mostrada na figura 3.

[00181] O plasmídio pSUN291 foi introduzido no B.subtilis 3NA e a atividade β-galactosidase foi medida como estabelecido acima nos experimentos 2 b).

[00182] O resultado é mostrado na figura 5. Aqui, a expressão basal foi já relativamente alta e foi também aumentada aproximadamente de 3 vezes pela adição de 0,2% de manose.

[00183] A adição de glicose levou à repressão da atividade da β- galactosidase a quase o nível da expressão basal.

[00184] O resultado indicou que o promotor manRnão é somente um promotor constitutivo fraco mas sujeito à manose e à regulação do CCR.

c) Localização de região promotora manR

[00185] Como no experimento 2c) para a localização adicional da região promotora do DNA manR - sequência DNA - os fragmentos de comprimentos diferentes foram preparados do DNA - sequência como contido em pSUN291 cortando em posições diferentes à montante ao sítio de iniciação da transcrição do promotor manR em sítios de restrição e por enzimas de restrição tal como mostrado na figura 3.

[00186] Uma primeira sequência de eliminação foi obtida cortando a sequência mostrada na figura 3 abaixo da bp -100 e bp -99 à montante do sítio de iniciação da transcrição G, uma segunda sequência de eliminação foi obtida reduzindo a bp -83 e bp -82 à montante do sítio de início da transcrição G.

[00187] Análogo para o experimento 2c) as primeiras e segundas sequências de eliminação obtidas foram introduzidas em pSUN272.1 e os plasmídios resultantes denominaram pSUN384.1 e pSUN385.2, respectivamente.

[00188] Cada plasmídio foi inserido no B.subtilis 3NA e cultivado como estabelecido no experimento 2b. Após uma indução de hora a atividade β-galactosidase das células foi determinada como estabelecer no experimento 2b. Os resultados são mostrados na figura 8. Não há nenhuma diferença significante acerca da indução de lacZ pela manose de pSUN384.1 em comparação com pSUN291. Contudo, no B.subtilis 3NA compreendendo pSUN385.2 com a segunda sequência de eliminação, a indução pela manose foi completamente abolida e o nível de expressão basal foi aproximadamente 0. Disto resulta o seguinte que o sítio de ligação ManR da região promotora manR está localizado entre bp-99 e bp-35 em relação ao sítio de iniciação da transcrição do manR.

II) Uso das regiões promotoras de operon da manose em fermentação de alta densidade celular. Experimento 4: Transformação

[00189] Um hospedeiro modelo que transporta a região promotora da presente invenção foi testado para sua capacidade de expressão e crescimento. Usando a sequência de ácido nucleico de acordo com a região promotora manP como introduzida no plasmídio pSUN284.1 tal como mostrado na figura 6 e como usado no experimento 2c, plasmí- dio pMW168.1 foi construído tal como estabelecido abaixo e introduzido no B.subtilis 3NA como hospedeiro por transformação.

a) Construção do plasmídio pMW168.1

[00190] Um vetor de transporte replicável tanto em E.coli como no B.subtilis foi projetado como estabelecido no Experimento 2a) com exceção de que eGFP foi usado como gene repórter em vez de lacZ. Também a região de iniciação da transcrição do manP foi substituída por aquela do gene gsiB (Proteína de stress; Jurgen et al., supra).

[00191] Adicionalmente, o códon de início do eGFP e 6 códons depois do códon de início foram substituídos.

[00192] A estrutura esquemática do promotor obtido e da região de iniciação da transcrição é mostrada na figura 17.

[00193] São mostradas a estrutura dos genes (setas) e as regiões (caixas) com os sítios de restrição relevantes.

[00194] Genericamente, o plasmídio pMW168.1 foi obtido tal como mostrado sno diagrama de fluxo no acordo com a figura 18.

[00195] No diagrama de fluxo os nomes dos DNAs do vetor, os DNAs da inserção e os oligonucleotídios complementares usados foram como indicados nas caixas, em relação aos produtos de PCR que os iniciadores e o padrão do DNA estavam como dentro dos suportes, as enzimas de restrição usadas foram indicadas nos respectivos sítios.

[00196] As etapas de clonagem foram realizadas com E.coli JM109.

[00197] Os plasmídios usados foram pUC 18 uma seleção positiva e vetor de clonagem para produtos de PCR com a resistência amp (Yanosch-Perron et al., supra); pWA21 uma expressão e vetor de clonagem para E.coli com resistência amp (Wegerer et al., 2008, BMC Biotechnol. 8,2); pSUN202.4 um pUB 110 derivado com região promotoramanP e resistência amp e kan, sendo um vetor de transporte para E.coli e B.subtilis; e pSUN266.1 um derivado pUC18 com sítio de integração entre as sequências ter- e spc e resistência de amp.

[00198] A sequência dos iniciadores usados foi como se segue:

[00199] A substituição da região de iniciação da transcrição inclusi- vamente o códon de início e os códons depois do códon de início foi realizada usando oligonucleotídios complementares e via os sítios de restrição únicos Bglll, AflII e BamHI. A construção do vetor começou com a substituição da região de iniciação da transcrição do gene T7 do vetor pWA21 (Wegerer et al., supra) pela região de iniciação de tradu- ção de tufA do B.subtilis via oligonucleotídios complementares s5019 e s5020, respectivamente. Em etapas de clonagem adicionais esta região de iniciação da transcrição foi substituída por aquele de gsiB. O plasmídio final pMW168.1 continha o gene representante inclusivamente ori+ de pUB110. O mapa de plasmídio do pMW168.1 é mostrado na figura 9.

b) Determinação de estabilidade estrutural e segregação

[00200] B.subtilis 3NA foi transformado com o vetor pMW168.1 e a estabilidade estrutural bem como a propagação estável do vetor na divisão celular (segregação) foi determinada.

[00201] B.subtilis 3NA transformado com pMW168.1 foi pré- cultivado no meio LBSpc e depois transferido para o LB0-meio sem pressão de seleção. A incubação foi realizada a 37°C. No fim da fase de crescimento exponencial cada cultura foi inoculada no LB0-meio fresco. Este procedimento foi repetido até que 100 gerações fossem obtidas calculadas baseado nos DO-valores medidos obtidos durante a transferência no meio fresco no acordo com o método modificado de et al Harwood., 1990, Molecular Biolegical Methods for Bacillus, John Wiley & Sons Ltd. O resultado é mostrado na figura 10.

[00202] Após aproximadamente as gerações mais de 99,9% das células e até após gerações aproximadamente 90% das células ainda transportavam o vetor. Só de aproximadamente a 25a geração cada vez mais as células perderam o vetor.

[00203] Para determinar a estabilidade estrutural do plasmídio, de colônias o plasmídio foi isolado após gerações. Aproximadamente 0,5 ug de cada plasmídio isolado foram comparados com pMW168.1 isolado de E.coli como controle do eletroforese de gel de agarose. Nenhuma diferença nas corridas dos plasmídios e o controle foi observada indicando que nenhuma variação estrutural tinha ocorrido.

[00204] Estes resultados mostram que o plasmídio pMW168.1 não só tem uma alta estabilidade estrutural mas também segregação estável como desejado na fermentação.

Experimento 5: Fermentação

[00205] Seis corridas de fermentação foram conduzidas com B.subtilis 3NA transformado com o plasmídio pMW168.1 compreendendo do gene repórter eGFP com regimes de indução diferentes e monitoraram online observando o sinal de fluorescência de eGFP. Como meio de fermentação o meio conhecido de fermentação de alta densidade celular de E.coli como divulgado em et al Wilms., 2001, Bio- technol. Bioeng. 73, 95-103, e tal como mostrado daqui por diante foi usado.

Materiais e métodos

[00206] Em geral, também para os experimentos de fermentação as técnicas moleculares padrão foram usadas se não declarado de outro modo.

Densidade óptica

[00207] Para determinar a densidade óptica (DO) o espectrofotôme- tro Ultrospec 1100pro da Amersham Bioscience Company foi usado em 600 nm de acordo com o protocolo do fabricante.

Determinação da concentração da biomassa seca

[00208] Para a determinação da concentração da biomassa seca cx foi usado um medidor de umidade MB 835 Halogen da Ohaus Company.

Medição espectrofotométrica de fluorescência

[00209] A expressão e a fluorescência, respectivamente, de eGFP foram analisadas pelo leitor de Multifunção GENios da empresa TE- CAN usando o software de leitura X Fluor 4 (versão V4.11) com os seguintes parâmetros de medição:

Medição de fluorescência online em fermentador

[00210] Durante a fermentação a expressão de eGFP foi monitorada online usando a sonda de fluorescência (Micropacote HPX-2000, High Power Xenon Lightsource of Ocean Optics, Inc; fibra de S2000 espec- trômetro ótico).

[00211] Os parâmetros de medição foram como se segue: o filtro de excitação 485 nm, filtro de emissão 535 nm, filtro de 0,6. Para registro e armazenamento o software de Ocean Optics SpectraSuite foi usado.

[00212] A fluorescência é indicada como unidade de fluorescência relativa (RFU). Pouco antes da obtenção de 4.000 RFU o tempo de integração de 50 ms foi modificado para 25 ms e depois para 10 ms. Nestes casos os valores de medição foram multiplicados pelo fator 2 e 5, respectivamente.

Cultivo de pré-culturas.

[00213] Uma colônia única foi colocada sobre uma placa de agar de LB e cultivada durante a noite em 5 ml de meio mínimo de Spizizens (SMM) incluindo 0,02% (p/v) de ácidos casamino (CA) e antibiótico. 1ml da cultura noturna foi acrescentado a 20 ml de SMM com 0,02% (p/v) CA e antibiótico e incubou 5 a 6 h a 37°C em um 250 ml frasco Erlenmeyer (pré-cultura 1).

[00214] 10 ml da pré-cultura 1 foram acrescentados a 200 ml do meio de batelada incluindo 5 g/l d glicose e incubado por até 8 h a 37 °C em um frasco Erlenmeyer de 1L (pré-cultura 2). Para a inoculação da pré-cultura de fermentadores 2 com DO600 entre 1.2 e 2.2 foi usado.

Fermentação

[00215] Em geral, a fermentação foi realizada no acordo com os princípios de Wilms et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103.

[00216] Logo que a glicose, fonte de carbono, foi completamente consumida o moda batelada foi trocado pelo modo de batelada alimentada.

[00217] Acrescentando as soluções de alimentos exponencialmente na fase de batelada alimentada, uma taxa de crescimento constante de u=0.10 h "1 pode ser obtida e ao mesmo tempo a repressão de ca- tabólito pela glicose é evitada, por causa do consumo imediato de glicose pelas células.

Análise de proteína

[00218] Os extratos brutos de proteína das células colhidas foram analisados por SDS-eletroforese-em-gel-de-poliacrilamida com um gel de poliacrilamida consistindo de 3% de gel de empilhamento, 12% de gel de separação com a seguinte composição:

[00219] Foi usada uma câmara de gel Twin Mini da empresa Bio- metra.

[00220] Para desnaturação 12 ul de extrato bruto da mistura de proteína foi misturado com 3 μl 5x tampão de SDS-aplicação e incubado  em Thermomixer 5438 da companhia Eppendorf por 5 minutos em 95°C. Após resfriamento à temperatura ambiente as amostras foram separadas pela centrifugação e completamente postas para o gel.

[00221] Durante a separação a corrente no gel de empilhamento foi 10 mA e foi aumentada a 20 mA após a fronteira do bromofenol ter atingido o gel de empilhamento. 1xSDS-tampão de corrida e o padrão de comprimentos ROTI ® Marca da empresa Roth foi usado para a separação. A eletroforese foi terminada logo que a fronteira do bromo- fenol correu completamente para fora do gel. Já que a detecção de bandas distintas de proteína o gel foi incubado com solução de Coo- massie que colore em 30 minutos na temperatura ambiente e foi posteriormente tratado com a solução que colore em 30 minutos adicionais na temperatura ambiente. Para remover o antecedente azulado restante fora do gel o gel foi incubado durante várias horas no ácido acético a 7,5%.

[00222] A composição de soluções tampão e da coloração bem como de coloração de soluções foi como se segue:

Com TRIS: Tris (hidroximetil) aminometano SDS: dodecilssulfato de sódio APS: persulfato de amônio TEMED: N, N, N’, N ‘-tetrametiletilenodiamina, EDTA: ácido de etilenodiaminotetracético.

Indução de expressão do gene.

[00223] Para a indução da expressão do gene os modos diferentes da adição da solução indutora (regime de indução) foram avaliados:

[00224] 1. A adição em uma porção única em um ponto dado do tempo (indução de impacto);

[00225] 2. A indução de impacto combinada com uma indução adi cional durante um intervalo de tempo em que

[00226] - a adição adicional estava em uma taxa constante com quantidades crescentes graduais ou

[00227] - a adição adicional estava em uma taxa exponencialmente crescente,

[00228] 3. Inicio da adição da solução de indutor para atingir uma dada densidade celular. Tabela 2: Meio utilizado.

*para ser autoclavado separadamente

[00229] O pH foi ajustado com NaOH de 2 m e solução de HCI de 1 m, respectivamente. Para placas de agar g/l o Euroagar da companhia BD, foram adicionalmente acrescentados.

[00230] Todo o meio foi autoclavado em 121 °C de aproximadamente o minuto.

Fermentação da Corrida 1: Indução de impacto.

[00231] A fermentação da corrida 1 foi realizada em um reator de 30L (D598 e D596 da Bioengineering). O volume da batelada foi 8L. Dependendo da DO600 200-400 ml da pré-cultura 2 foram inoculados para ajustar a DO600 da partida em 0,1. Durante a fase da batelada a temperatura foi 30°C durante a noite e após 12 h aumentou para 37°C. Pela adição de 24 % (v/v) NH4OH o pH foi ajustado à aproximadamente 7,0 durante a fermentação inteira. A taxa de aeração pode ser ajustada até 30 L/min. No início da fase de batelada a taxa de aeração foi de 10 L/min.

[00232] A composição do meio de alimentação I e II é mostrada como abaixo na Tabela 3. Tabela 3: Composição do meio de alimentação I e II

*solução de elementos traço pH=7,0

[00233] Os meios I e II foram acrescentados nas proporções aos seus volumes totais, isto é 4,2:1,0 (correspondendo a meio I de 80,8% e meio II de 19,2% da alimentação total F).

[00234] Para a indução no início da fase de batelada alimentada 0,2% (p/v) a solução de D-manose foi acrescentada em uma única porção.

[00235] A concentração da biomassa seca e o sinal de fluorescência monitorado são mostrados nas figuras 11a e 11b, respectivamente.

[00236] Na figura a concentração da biomassa seca cx é traçada logarítmicamente durante a duração da cultura. A batelada e a fase de batelada alimentada são separadas pela linha perpendicular.

[00237] O sinal de fluorescência monitorado em comprimento de onda de emissão de 535 nm é traçado durante o período de cultura. As setas indicam o ponto da indução.

[00238] De resultados da figura 11a que uma biomassa seca máxima (DM) concentração de 82.75 g DM/I foi obtida correspondendo à aproximadamente 970 DM g baseado no volume de reação de 11,7 L.

[00239] Em 71,5 g total do indutor D-manose foi consumido com 16 g na primeira adição.

[00240] A taxa de crescimento específico μ foi de 0.10 h-1 durante a fase de batelada alimentada inteira.

[00241] Tal como mostrado na figura 11b o sinal de fluorescência fortemente aumentou após a primeira adição da D-manose até um máximo de aproximadamente 2.200 RFU dentro de cinco primeiras horas da fase de batelada alimentada. Depois, o sinal continuamente diminuiu. Supõe-se que esta redução na taxa de expressão é devido ao consumo do indutor e/ou a um efeito protetor pela massa celular crescente. Uma adição de mais 0,5 % (p/v) solução da manose após 37 horas resultou em um novo aumento do sinal de fluorescência até um valor de 2.100 RFU.

Corrida de fermentação 2: indução combinada com taxa constante.

[00242] O mesmo procedimento que na corrida 1 foi repetido exceto que o modo da adição do indutor foi modificado. Como na corrida 1, 0,2 % (p/v) a solução de D-manose foi acrescentada em uma porção única no ponto de partida da fase de batelada alimentada. A adição da segunda porção do indutor foi iniciada logo que o RFU no ponto que vira da curva do sinal de fluorescência da corrida 1 fosse atingido, que foi 1.500.

[00243] Durante o segundo e etapa de adição 20% (p/v) a solução da manose foi acrescentada em uma taxa constante com quantidades crescentes graduais com uma taxa média de 0,39 g/min até que toda da segunda porção tivesse sido acrescentada.

[00244] Os resultados são mostrados nas figuras 12a e 12b mostrando a concentração da biomassa seca e a curva do sinal de fluorescência, com a detonação sendo o mesmo como nas figuras 11a e 11b. Na figura 12b os pontos da adição da primeira porção e partida e o fim da adição da segunda porção são indicados por setas.

[00245] Como consequências da figura 12a a concentração máxima da biomassa seca foi 67,6 gDM/L que correspondem à aproximadamente 804 gDM baseado em um volume de reação de 11,9L. No total (primeira e segunda adição) 70g de D-manose foram acrescentados.  O rendimento da biomassa foi reduzido em 17% em comparação com a corrida 1. Isto está em correlação com uma taxa de crescimento específica mais baixa μ=0,09 h-1 durante a "fase de batelada alimentada", enquanto que a taxa de crescimento específica durante a fase da batelada foi 0,43 h-1.

[00246] Como consequências da figura 12b o máximo do sinal de fluorescência foi atingido em aproximadamente 4.900 RFU fora do horário e continuamente reduziu à aproximadamente 2.500 RFU.

[00247] Em comparação com a corrida 1 e a corrida 2 a taxa de expressão pode ser melhorada em 120% com uma redução leve na concentração da biomassa.

Fermentação das corridas 3 e 4: a indução combinada com a taxa ex-ponencial.

[00248] Um pequeno fermentador de laboratório de 3,7L (Kleinla- borfermenter da empresa Bioengineering) foi usado nas corridas 3 e 4. O volume da batelada (meio de batelada mais o inóculo) foi de 1,5L no total. Dependendo da DO600 100 - 200 ml da pré-cultura 2 foram inoculados para ajustar a DO600 inicial à aproximadamente 0,1. A temperatura tanto na batelada como na fase de batelada alimentada foi 37 °C. Durante a fermentação o pH foi ajustado a 7,0 com 24 % (v/v) de NH4OH. A taxa de aeração foi constantemente de 2 L/min durante a fermentação. A entrada de oxigênio foi ajustada pela velocidade de rotação do agitador. A pressão de fermentação foi 1,3 bar no começo e foi depois aumentada a 1,5 bar para melhorar a entrada de oxigênio na demanda. Após o consumo completo da glicose da fonte de carbono a operação da batelada foi trocada para operação de batelada alimentada.

[00249] Diferentemente da corrida 2, nas corridas 3 e 4 a solução de indutor foi alimentada em uma taxa exponencialmente crescente. Adicionalmente, o meio contendo glicose I foi co-alimentado com o indutor contendo o meio II. A composição dos meios de alimentação I e  II foi tal como mostrado abaixo na tabela 4: Tabela 4: Composição dos meios de alimentação I e II.

[00250] Todos os componentes do meio I e II foram autoclavados separadamente o valor do pH foi ajustado a 3,3 com 85% (v/v) H3PO4 em ambos o meio por causa da solubilidade dos componentes.

[00251] A alimentação total F no tempo t foi calculada pela seguinte fórmula:

[00252] com

[00253] m = coeficiente de manutenção (0,04 g g-1H-1)

[00254] Yx/s = coeficiente de rendimento específico da biomassa relativo ao substrato (0,5 para glicose)

[00255] Cxo = concentração da biomassa no início da fase de batelada alimentada

[00256] V0 = volume de reator no início da fase de batelada alimen tada (= volume da batelada)

[00257] Cso = concentração de glicose na solução de alimentação.

[00258] Para o cálculo supôs-se que a D-manose foi consumida por B.subtilis com um coeficiente de rendimento comparável à glicose de Yx/S.

[00259] No meio KLF I e II pode ser separadamente fornecido e a razão proporcional pode ser variada.

a) Fermentação da corrida 3.

[00260] A concentração da biomassa e o sinal de fluorescência mo-nitoradosão mostrados nas figuras 13a e 13b, com a denotação das figuras que são a mesma da corrida 1.

[00261] No início da fase de batelada alimentada uma porção 0,2% de (p/v) a solução da manose (16 manose g no total) foi acrescentada e a alimentação exponencial do meio I e II começou com uma razão de 50:50 (intervalo I). Na redução da inclinação a porção do meio II contendo manose foi melhorado a 60% e a alimentação total F (meios I e II) a 125% para manter o crescimento baseado na glicose (intervalo II). Após aproximadamente 2 h novamente a diminuição da inclinação foi monitorada e a porção do meio II aumentado a 66,6% com o aumentosimultâneo da alimentação total F a 150% (intervalo III). Após o consumo de todo meio II a fermentação foi continuada com o meio de alimentação I em uma alimentação total de 100% (não mostrado na figura 10).

[00262] O progresso e os dados da corrida 3 são resumidos na Tabela 5 abaixo: Tabela 5:

[00263] Um total de 50 g de manose foram acrescentados.

[00264] A cada 12 h, 20 h e 24 h uma amostra foi tomada para a análise da expressão no SDS-gel baseado nas frações de proteína solúveis de 10 DO600 células no total.

[00265] O SDS PAGE resultante é mostrado na figura 19:

[00266] É mostrado da esquerda: (M) padrão de comprimento (ROTI ® - Marca), (1) após 12 h, não induzidos; (2) após 20 h, 8 h-indução; (3) após 24 horas, 12 h de indução.

[00267] Após 20 h e 24 h uma faixa clara aparece em aproximadamente 27 kDa a indicação de expressão do eGFP (seta)

b) Corrida de fermentação 4.

[00268] O mesmo procedimento que na corrida 3 foi repetido exceto que o volume de alimentos do meio II (manose) foi melhorado a 1,0L no total.

[00269] A concentração da biomassa seca e o sinal de fluorescência são mostrados nas figuras 14a e 12b, com a denotação sendo a mesma da corrida 1. O progresso e os dados são resumidos na Tabela 6 abaixo: Tabela 6:

[00270] No total 200 g de manose foram acrescentados.

[00271] Para compensar uma falta observada do nitrogênio após aproximadamente a duração de horas da fermentação (NH4) 2 HP04 foi alimentada adicionalmente por uma taxa constante.

[00272] No intervalo II um RFU máximo de 10000 foi atingido que dentro do curso do intervalo II reduzido a 7800 RFU.

a) Corridas de fermentação 5 e 6: Sem indução de impacto.

[00273] Ambas as fermentações foram realizadas em um fermenta- dor de 30L. Em ambas as corridas as células foram cultivadas até a alta densidade celular com a taxa de alimentos exponencialmente crescente de glicose, que, para atingir a alta densidade celular, foi substituída por uma alimentação constantes da manose.

[00274] O meio de alimentação I, II e III usados são mostrados na Tabela 7 abaixo: Tabela 7: Meio de alimentação I Meio de alimentação I Meio de alimentação III

Fermentação da corrida 5.

[00275] O meio I e II foi acrescentado na proporção aos seus volumes totais 4,2:1,0 na taxa exponencialmente crescente. Atingindo a alimentação de alta densidade celular compostos do meio I e II foi substituído por alimentos compostos do meio II e III em uma razão proporcional de 20:80 de volume constante que corresponde ao volume da última taxa de alimentação exponencial do meio I e II.

[00276] O sinal de fluorescência é mostrado na figura com a denotação sendo a mesma da corrida 1.

[00277] Supõe-se que o aumento mínimo do sinal de fluorescência na figura após aproximadamente 17 duração de fermentação h foi devido a um vazamento a curto prazo do meio III.

[00278] O progresso e os dados da corrida 5 são resumidos na Tabela 8 abaixo: Tabela 8:

b) Fermentação da corrida 6.

[00279] O mesmo procedimento da corrida 5 foi repetido exceto que um total de 600 g manose foram acrescentados com uma indução de impacto de 0,2 (p/v) solução da manose (16 g manose no total) antes da adição constante da alimentação composta dos meios II e III para atingir a alta densidade celular. O sinal de fluorescência é mostrado na figura 16, com a denotação sendo a mesma da corrida 1.

[00280] O progresso e os dados da corrida 6 são resumidos na Tabela 9 abaixo: Tabela 9:

Avaliação das corridas de a 6.

[00281] Para a avaliação no momento da fluorescência máxima a concentração da biomassa seca Cx, volumes de reator VR, a manose consumida e duração do início da indução foram determinados e resumidos na Tabela abaixo: Tabela 10:

[00282] Baseado nos dados de processo mostrados na Tabela de cada corrida a produtividade quanto à fluorescência máxima RFU por litro e hora foi calculada.

[00283] Adicionalmente, a eficiência de expressão foi expressada como fluorescência relativa calculada da fluorescência máxima baseada na biomassa absoluta (gDM) e a concentração do indutor (gman/L).

[00284] Os resultados são mostrados na Tabela 11 abaixo: Tabela 11:

[00285] Estes resultados claramente mostram que a presente invenção usando plasmídios que transportam o promotor da manose pode ser com sucesso usada em processos de fermentação de alta densidade celular e expressão positivamente controlada pela adição do indutor D-manose.

[00286] Adicionalmente, selecionando o regime de indução o foco da fermentação pode ser variado em maximizar produção em vista da biomassa, do produto de expressão e do consumo de indutor, respec-tivamente, de acordo com a necessidade.

[00287] Em vista do regime de indutor de processamento à jusante facilitado com indução de impacto combinada e alimentação exponencial de acordo com a corrida 3 são particularmente vantajosos.

[00288] Aqui, o produto de alta expressão gerado em relação à biomassa cria um processamento adicional, tal como uma etapa de purificação etc. mais eficiente e, assim, gerando economia de tempo e de custos.

Claims (16)

1. Vetor expressável em uma célula hospedeira procarióti- ca, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor induzível pela manose do operon da manose de Bacillus subtilis operavelmente ligado a uma unidade transcricional compreendendo uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um polipeptídeo, em que o promotor induzível pela manose é selecionado dentre um promotor manP e promotor manR, em que o promotor manP compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO. 1 e SEQ ID NO. 2, ou uma sequência completamente complementar à mesma, o promotor manR compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, e SEQ ID NO. 5, ou uma sequência completamente complementarà mesma.

2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende à montante da sequência heterólo- ga de ácido nucleico um elemento responsivo pelo catabólito.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende uma sequência de terminação de transcrição localizada à jusante da sequência heteróloga de ácido nucleico.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de terminação de transcrição é da região 3’ do gene tufA de Bacillus subtilis de SEQ ID NO. 32.

5. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um vetor de transporte replicável em Escherichia coli e Bacillus subtilis.

6. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende a origem de replicação do plasmídeo pUC18 e/ou do replicon pBS72 ou do gene rep em conjunto com a origem de replicação do plasmídeo pUB110.

7. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico he- teróloga codifica um anticorpo ou um fragmento do mesmo.

8. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região de início da transcrição de gene manP ou gene manRé substituída pela região de início de transcrição do gene tufA de SEQ ID NO. 32 ou do gene gsiB de SEQ ID NO. 31.

9. Célula hospedeira procariótica, caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Célula hospedeira procariótica de acordo com a reivin-dicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira procarió- tica é submetida à repressão de catabólito de carbono e compreende um sistema de fosfoenolpiruvato:carboidrato fosfotransferase.

11. Célula hospedeira procariótica de acordo com a reivin-dicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira procariótica é Gram-positiva.

12. Célula hospedeira procariótica de acordo a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira pertence ao filo Firmicutes.

13. Célula hospedeira procariótica de acordo qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizada pelo fato de que a célula hos-pedeiraprocariótica é selecionada de B. subtilis e E. coli.

14. Método para produzir um polipeptídeo em uma célula hospedeira procariótica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de construir um vetor, como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 8, transformar uma célula hospedeira procariótica com o dito vetor, permitir a expressão do dito polipeptídeo cultivando a célula hospedeira transformada em um meio de cultura de células sob condições adequadas e recuperar o polipeptídeo das células ou da cultura de células.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são cultivadas primeiramente na presença de uma fonte de carbono diferente do indutor, e depois, em uma segunda etapa, na presença do indutor.

16. Uso do vetor, como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 8, ou de uma sequência de ácido nucleico isolada e purificada de qualquer um de SEQ ID NO:1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a expressão regulada de uma sequência heteróloga de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo em uma célula hospedeira procariótica.

Images