JP5794985B2 - マンノースプロモーターを含むベクター及びマンノースプロモーター - Google Patents

Description

本発明は、例えば組み換えタンパク質などのポリペプチドをコードする核酸の異種発現のための、マンノースで誘導可能なプロモーターを含む原核性の宿主細胞において発現可能なベクターに関する。

特に、本発明は、宿主における異種発現のための新規のベクターであって、前記宿主に対して異種である核酸配列を含む転写ユニットに作動的に連結されたマンノースオペロンのプロモーター領域を含み、前記核酸配列の発現が前記マンノースオペロンのプロモーター領域によって制御されている前記ベクターに関する。更に、本発明は、これらのベクターを、例えば組み換えタンパク質などのポリペプチドをコードする核酸の異種発現のために用いる使用に関する。

原核性の系における、例えばポリペプチドをコードする核酸（構造遺伝子）の異種発現のために多くの系が記載されている。このために、宿主は、関心が持たれる構造遺伝子の核酸配列を含み、該核酸配列が構造遺伝子を転写させうる核酸配列であるプロモーターに作動的に連結されているベクターで形質転換される。好適な誘導によって、該プロモーターは活性化され、構造遺伝子の転写を可能にする。誘導は、ネガティブな制御下又はポジティブな制御下であってよい。

ネガティブな制御の誘導においては、リプレッサーが前記プロモーターに結合されて、構造遺伝子の転写を妨げる。好適なインデューサーが存在するのであれば、リプレッサーは不活性化されて、転写が許容される。

ポジティブな制御の誘導においては、プロモーターは、アクチベーターが結合されると活性化され、その際に、該アクチベーターのプロモーターへの結合は、好適なインデューサーによって媒介される。

典型的なインデューサーは、原核性の宿主が代謝のために必要な基質、例えば種々のタイプの糖類であってよい。

本発明は、好適な基質、すなわちインデューサーの存在下に、アクチベーターが、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を開始するプロモーターに結合する、ポジティブに誘導可能な系に関する。

今までに、原核性の宿主系における殆どの異種遺伝子発現系は、限られた組の細菌性プロモーターにもっぱら頼っていた。結果的に、インデューサーとして使用できる基質の数も同様に限られている。

更に、異種発現系の収率は、利用可能な形質転換された原核性の宿主の数に依存する。このように、高い細胞密度にまで増殖できる原核性の宿主系、つまり細胞分裂時にベクターを脱着することなく迅速な増殖を可能にする原核性の宿主系が必要とされる。

発明の要旨
本発明によれば、前記課題と以下の詳細な説明から明らかな課題の他の課題は、前記宿主に対して異種である核酸配列を含む転写ユニットに作動的に連結されたマンノースオペロンのプロモーター領域を含み、前記核酸配列の発現が、前記のマンノースオペロンのプロモーター領域によって制御される新規ベクターを提供することによって解決された。

また、前記の新規のベクターを原核性の宿主における核酸配列の調節された異種発現のために用いる使用；マンノースオペロンのプロモーター領域を含む、宿主において発現可能な単離され精製された核酸配列；前記のベクター又は前記の単離され精製された核酸配列で形質転換された原核性の宿主；前記のベクター又は前記の単離され精製された核酸配列を使用して宿主においてポリペプチドを産生する方法；並びに前記のベクター又は前記の単離され精製された核酸配列で形質転換された原核性の宿主を発酵において、特に高い細胞密度の発酵において用いる使用も提供される。

他の課題及び利点は、当業者には、以下の詳細な説明の検討から、関連する図面及び付属の特許請求の範囲を参照して明らかになる。

図面の簡単な説明
以下の図面に以下のことが示されている。

図１には、ｍａｎＰプロモーターの転写開始部位のマッピングにおいて使用されるＢ．サチリスからの核酸配列が示されており、その際、アデニンヌクレオチドでの転写開始部位は、強調表示され、推定−３５ボックスと推定−１０ボックスは、イタリック体で表示され、ｍａｎＲの終わりとｌｙｓ遺伝子の開始は、矢印によって印され、制限部位ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩ、ＡｆｌＩＩ及びＮｄｅＩには下線が引かれている。

図２には、ｍａｎＲプロモーターを含むプロモーター領域の核酸配列が示されており、その際、グアニンヌクレオチドでの転写開始部位は、強調表示され、推定−１０ボックスと推定−３５ボックスは、イタリック体で表示され、ｍａｎＲの開始は、矢印によって印され、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と推定ｃｒｅ配列には下線が引かれている。

図３には、それぞれｐＳＵＮ２９１、ｐＳＵＮ３８４．１及びｐＳＵＮ３８５．２に含まれるｍａｎＲプロモーターのプロモーター領域を含むＢ．サチリスから得られた核酸配列が示されており、その際、ｌａｃＺの開始は、矢印によって示されており、制限部位には下線が引かれている。

図４には、本発明による発現ベクターｐＳＵＮ２７９．２のプラスミドマップが示されている。

図５には、本発明によるプラスミドｐＳＵＮ２７９．２、ｐＳＵＮ２８４．１及びｐＳＵＮ２９１をそれぞれ含むＢ．サチリス３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。

図６には、ｍａｎＲのＣ末端を含むＢ．サチリス由来のｍａｎＰプロモーターのプロモーター領域を含むＢ．サチリスから得られる核酸配列が示されており、その際、ｍａｎＲとｍａｎＰとの間の遺伝子間領域は、ここではレポーター遺伝子ｌａｃＺによって置き換えられており、転写開始部位、推定−３５ボックスと推定−１０ボックスは、太字で表示され、ｍａｎＲの終わりとｌａｃＺの開始は、矢印によって印され、制限部位には下線が引かれている。

図７には、プラスミドｐＳＵＮ２７９．２と、図６に示される種々の長さの核酸配列の断片を含む更なるプラスミドとを含んだＢ．サチリス３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。

図８には、図３に示される核酸配列を有するベクターｐＳＵＮ２９１、ｐＳＵＮ３８４．１及びｐＳＵＮ３４５．２を含むＢ．サチリス３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。

図９には、本発明による発現ベクターｐＭＷ１６８．１のプラスミドマップが示されている。

図１０には、Ｂ．サチリス３ＮＡ中のｐＭＷ１６８．１のプラスミド安定性試験の結果に関する図が示されており、その際、該プラスミドを含んだ細胞のパーセント割合が、世代数にわたってプロットされている。

図１１〜１４には、発酵行程１〜４の期間にわたってプロットされた乾燥バイオマス濃度を対数表示した図と、発酵行程１〜４の発酵の間にわたってプロットされた蛍光シグナル（ＲＦＵ）に関する図が示されている。

図１５及び１６には、発酵行程５及び６の発酵の期間にわたってプロットされた蛍光シグナルの図が示されている。

図１７には、実験４の（ａ）プラスミドｐＭＷ１６８．１の構築に従って得られたプロモーター開始の概略構造が示されている。

図１８には、プラスミドｐＭＷ１６８．１の構築のフローチャートが示されている。

図１９には、ＳＤＳページが示されている。

本発明の詳細な説明
本願で使用される場合に、以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。

"宿主中で発現可能なベクター"又は"発現ベクター"は、宿主細胞中で特定の核酸配列の転写を可能にする一連の特定のポリ核酸エレメントを用いて組み換えにより又は合成により作成されたポリ核酸構築物である。一般に、このベクターには、転写されるべき特定の核酸配列を、プロモーターに作動的に連結されて含む転写ユニットが含まれる。宿主中で発現可能なベクターは、例えば自律複製又は自己複製をするプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス又はレトロウイルスであってよい。

用語"宿主"、"宿主細胞"及び"組み換え宿主細胞"は、本発明の１もしくはそれより多くのベクター又は単離され精製された核酸配列が導入された原核性の細胞を示すために本願では互換的に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の後代又は潜在的後代をも指すものと解される。ある程度の改変は、後の世代において、突然変異又は環境による影響のいずれかにより生ずることがあるので、かかる後代は、事実上、親細胞と同一でないかもしれないが、依然として、本願で使用される用語の範囲内に含まれる。

用語"含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）"は、一般に、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味で使用される。つまり、１つ以上の更なる特徴又は要素の存在を許容する。

本願で使用される"プロモーター"は、転写ユニットの発現を制御する核酸配列を指す。"プロモーター領域"は、細胞におけるＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、かつ下流（３′方向）のコーディング配列の転写を開始する調節領域である。プロモーター領域内に、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン、例えば推定−３５ボックス及びプリブナウボックス（−１０ボックス）が見出される。更に、プロモーター領域は、転写開始部位と、調節タンパク質のための結合部位を含んでよい。

"マンノースオペロン"は、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のマンノースオペロンを指す。

マンノースオペロンにおいて３つの遺伝子が同定された（Ｋｕｎｓｔ Ｆ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ"．Ｎａｔｕｒｅ ３９０，第２４９頁〜第２５６頁（１９９７））。

第一の遺伝子のｍａｎＰは、フルクトースパーミアーゼファミリーに属するマンノース特異的酵素成分（トランスポーター）をコードする。第二の遺伝子のｍａｎＡは、マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼをコードするが、一方で、第三の遺伝子のｙｊｄＦの機能は知られていない。上流で、前記の３つの遺伝子の同じ方向において、ＭａｎＲ、つまりマンノースオペロンのアクチベーターをコードする調節遺伝子であるｍａｎＲが位置している。

３つの遺伝子からなるマンノースオペロンｍａｎＰ−ｍａｎＡ−ｙｊｄＦ（以下にまとめて"ｍａｎＰ"と呼ぶ）は、ｍａｎＰプロモーターの制御下にあり、そのプロモーター自体は、ポジティブに調節されている。もう一つのプロモーターのｍａｎＲプロモーターは、ｍａｎＰ−プロモーターのマンノース依存性誘導のために必須のｍａｎＲの発現を担っている。

ｍａｎＲプロモーター領域は、更に、ｍａｎＲ遺伝子のカタボライト調節タンパク質結合部位（カタボライト応答エレメント（ｃｒｅ））を含む。

"ｃｒｅ配列"は、異化遺伝子の上流（５′方向）に位置する核酸配列を指す。前記のｃｒｅ配列は、カタボライト制御タンパク質（ＣＣＰ）を結合し、炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）における異化遺伝子の発現を妨げる。

"マンノースオペロンのプロモーター領域"とは、ｍａｎＰの発現と、ｃｒｅ配列を伴う又は伴わないｍａｎＲの発現を調節するプロモーター領域を意味する。

本願で呼称される"ｍａｎＰプロモーター"は、少なくとも、−３５領域、プリブナウボックス及びＭａｎＲ結合部位を含む。

本願で呼称される"ｍａｎＲプロモーター"は、少なくとも、推定−３５領域、プリブナウボックス、ＭａｎＲ結合部位及び場合によりｃｒｅ配列を含む。

Ｄ−マンノースは"マンノース"とも呼ばれ、それはグルコースの２−エピマーであって、マンナン多糖類及びヘテロマンナン多糖類、糖タンパク質類並びに多くの複合多糖類において存在する。

"ＣｃｐＡ"は、"カタボライト制御タンパク質Ａ"を意味し、それはグローバル調節タンパク質であって、幾つかの異化代謝オペロンを活性化又は抑制することができる。マンノースオペロンの場合に、ＣｃｐＡは、ｃｒｅ配列への結合によって抑制の役割を担う。

"エンハンサー"は、転写ユニットのアイデンティティー、該配列の転写ユニットに対する位置又は該配列の方向とは無関係に、転写ユニットの転写の増強作用をもたらす核酸配列である。本発明のベクターは、場合によりエンハンサーを含んでよい。

本願で使用される"転写ユニット"は、一般に単独のＲＮＡ分子へと転写される核酸配列を指す。該転写ユニットは、１つの遺伝子（モノシストロン性）又は機能的に関連したポリペプチド分子をコードする２つの遺伝子（ジシストロン性）もしくはそれより多くの遺伝子（ポリシストロン性）を含んでよい。

核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に位置している場合に、"作動可能に連結されている"とする。例えば、プロモーターがコーディング配列へと作動可能に連結されているというのは、前記プロモーターが前記配列の転写に影響を及ぼす場合であり、又はリボソーム結合部位などの転写開始領域が、例えばポリペプチドをコードする核酸配列へと作動可能に連結されているというのは、前記プロモーターが前記ポリペプチドの翻訳を促進するように配置されている場合である。連結は、適当な制限部位でのライゲーションによって達成できる。かかる部位が存在しなければ、合成型のオリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、通例に従って使用される。

本発明で呼称される"核酸"もしくは"核酸配列"又は"単離され精製された核酸又は核酸配列"は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってよい。核酸又は核酸配列がベクター上に位置している場合には、それは通常はＤＮＡである。本願で呼称されるＤＮＡは、例えば二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡであって一方のもしくは両方の鎖が２つ以上の断片から構成されているもの、二本鎖ＤＮＡであって一方のもしくは両方の鎖が中断されていないホスホジエステル骨格を有するもの、１つ以上の一本鎖部分と１つ以上の二本鎖部分とを含むＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡであってそれらのＤＮＡ鎖が完全に相補的であるもの、二本鎖ＤＮＡであってそれらのＤＮＡ鎖が部分的にのみ相補的であるもの、環状ＤＮＡ、共有結合的に閉じたＤＮＡ、鎖状ＤＮＡ、共有結合的に架橋されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、生合成ＤＮＡ、単離されたままのＤＮＡ、酵素消化されたＤＮＡ、切断されたＤＮＡ、標識されたＤＮＡ、例えば放射線標識されたＤＮＡ及び蛍光色素標識されたＤＮＡ、１つ以上の天然起源でない種類の核酸を含むＤＮＡを含んだ任意のポリデオキシヌクレオチド配列であってよい。ＤＮＡ配列は、標準的な化学的技術によって、例えばリン酸トリエステル法によって又は自動合成法及びＰＣＲ法を介して合成することができる。精製され単離されたＤＮＡ配列は、酵素的な技術によって製造することもできる。

本願で呼称されるＲＮＡは、例えば一本鎖ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡであって一方のもしくは両方の鎖が２つ以上の断片から構成されているもの、二本鎖ＲＮＡであって一方のもしくは両方の鎖が中断されていないホスホジエステル骨格を有するもの、１つ以上の一本鎖部分と１つ以上の二本鎖部分とを含むＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡであってそれらのＲＮＡ鎖が完全に相補的であるもの、二本鎖ＲＮＡであってそれらのＲＮＡ鎖が部分的にのみ相補的であるもの、共有結合的に架橋されたＲＮＡ、酵素消化されたＲＮＡ、切断されたＲＮＡ、ｍＲＮＡ、化学合成されたＲＮＡ、半合成ＲＮＡ、生合成ＲＮＡ、単離されたままのＲＮＡ、標識されたＲＮＡ、例えば放射線標識されたＲＮＡ及び蛍光色素標識されたＲＮＡ、１つ以上の天然起源でない種類の核酸を含むＲＮＡであってよい。

"変異体"又は"配列の変異体"とは、保存的な核酸置換によって参照配列とは異なる核酸配列であって、１つ以上の核酸が同じ特性を有する別のものによって置換されているものを意味する。変異体は、同様に、縮重配列、欠失及び挿入を有する配列を、かかる改変された配列が、参照配列と同じ機能（機能的に等価）を示す限りは含んでいる。

本願で使用される場合に、用語"ポリペプチド"、"ペプチド"、"タンパク質"、"ポリペプチド性"及び"ペプチド性"は、複数の一連のアミノ酸残基が隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合によって他のアミノ酸と連結されたものを示すために互換的に使用される。

用語"単離され精製された核酸配列"は、該核酸配列が本発明によるものである状態を指す。前記の核酸配列は、天然に付随している物質、例えばその天然の環境で見出される他の核酸又は調製がインビトロもしくはインビボで行われる組み換え技術によるものである場合には調製環境（例えば細胞培養）で見出される他の核酸を含まないかもしくは本質的に含まない。

用語"形質転換"、"形質転換された"又は"宿主細胞中に核酸を導入する"とは、ベクターなどの細胞外核酸が、付随する物質を伴って又は伴わずに、宿主細胞に入る任意のプロセスを示している。用語"形質転換された細胞"又は"形質転換細胞"は、細胞外核酸が導入されて、細胞外核酸を保有する細胞又はその後代を意味する。前記核酸は、その核酸が染色体内組み込み物か染色体外エレメントのいずれかとして複製可能であるように細胞内に導入されてよい。好適な宿主細胞を、例えば発現ベクターで形質転換することは、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃などのよく知られた方法によって、又は例えばＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓに記載されるリン酸カルシウムに媒介される形質転換などの化学的な方法によって達成できる。

"異種の核酸配列"又は"宿主に対して異種の核酸配列"は、宿主にとって異物であるポリペプチドなどの発現産物（"異種発現"もしくは"異種産物"）を例えばコードする核酸配列、すなわち宿主とは異なるドナーに由来する核酸配列又は宿主にとって異物であるポリペプチドなどの発現産物を例えばコードする化学合成された核酸配列を意味する。前記宿主が特定の原核生物種である場合に、異種の核酸配列は、好ましくは、異なる生物の属もしくは科に、より好ましくは、異なる生物の目もしくは綱に、特に、異なる生物の門（ディビジョン）に、最も特別には、異なる生物のドメイン（エンパイア）に由来する。

宿主とは異なるドナーに由来する異種の核酸配列は、それを宿主細胞中へと組み込む前に、前記異種の核酸配列の単一の核酸又は一部の突然変異、挿入、欠失又は置換によって、改変された配列が参照配列と同じ機能を示す（機能的に等価である）限りは改変することができる。本願で呼称される異種の核酸配列は、同様に、異なる生物のドメイン（エンパイア）に由来する、例えば真核生物に由来する（真核生物由来の）核酸配列、例えばファージディスプレイライブラリーで使用されているヒト抗体を含み、そのうち該核酸配列の単一の核酸又は一部は、原核性の宿主の"コドン使用頻度"に従って改変されている。

本発明の意味範囲内では、用語"異種の核酸配列"又は"宿主に対して異種の核酸配列"は、宿主から誘導され該宿主によって本来発現されるポリペプチドをコードする核酸配列であって該核酸配列が本発明のベクター中に挿入されかつ本発明のマンノースオペロンのプロモーター領域の制御下にあるものも含む。

"転写開始領域"は、転写開始を促進するシグナル領域であって、シャイン・ダルガーノ配列などのリボソーム結合部位のための配列を含む領域である。

一般に、転写開始領域は、転写開始部位の下流に位置しており、発現されるべき遺伝子に作動的に連結されている。

"転写終結領域"とは、ＲＮＡポリメラーゼが転写の終結を引き起こす配列を指す。該転写終結領域は、通常は、他の隣接遺伝子の望ましくない転写又は他の潜在的なプロモーターからの転写を回避でき、かつｍＲＮＡの安定性を高めることができる転写ユニットの部分である。

"抗体"とは、抗原による刺激の後に免疫系のＢ細胞によって産生される血漿タンパク質のクラスを指す。哺乳類（すなわちヒト）抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤのクラスの免疫グロブリンである。本発明の目的のために使用される用語"抗体"は、それらに制限されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体と、糖尿病、多発性硬化症及びリウマチ様関節炎などの自己免疫疾患において存在する自己抗体と、キメラ抗体とを含む。

一態様においては、本発明は、宿主に対して異種である核酸配列を含む転写ユニットに作動的に連結されたマンノースオペロンのプロモーター領域を含み、前記核酸配列の発現が、前記マンノースオペロンのプロモーター領域によって制御されている、宿主において発現可能なベクターを提供する。

本発明によるベクターは、好ましくは、自律複製又は自己複製をするプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス又はレトロウイルスである。広範囲の様々な宿主とベクターとの組み合わせを、本発明の核酸配列の発現において使用してよい。

通常の発現ベクターは、例えば、染色体の、非染色体の及び／又は合成の核酸配列のセグメントからなってよい。好適なベクターは、特定の宿主範囲を有するベクター、例えばＢ．サチリス及びＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のそれぞれに特異的なベクターなどのベクター並びに広域宿主のベクター、例えばグラム陽性細菌及びグラム陰性最近に有用なベクターを含む。"低コピー"、"中コピー"並びに"高コピー"のプラスミドを使用することができる。

例えば、バシラス・サチリスにおいて、低コピーのプラスミドは、ｐＡＭｂｅｔａ１、中コピーのプラスミドは、ｐＢＳ７２誘導体であり、かつ高コピーのプラスミドは、ｐＵＢ１１０である。

本発明によれば、マンノースオペロンのプロモーター領域は、ｍａｎＲプロモーター領域とｍａｎＰプロモーター領域のそれぞれを含む。

ｍａｎＲのＣ末端と、ｍａｎＲとｍａｎＰとの間の遺伝子間領域と、それに続いてレポーター遺伝子としてのリソスタフィン遺伝子ｌｙｓとを含むＢ．サチリスからの核酸は、図１に示されている。ｍａｎＰのプロモーター領域を含む本発明の核酸は、好ましくは、図１の核酸配列のｂｐ−８０からｌｙｓの開始コドンまで（配列番号１）を含み、より好ましくは図１の核酸配列のｂｐ−８０からｂｐ−１までを含み、すなわちｂｐ＋１の転写開始部位Ａの上流（配列番号２）を含む。

ｍａｎＲのプロモーター領域と、ｂｐ＋１の転写開始部位Ｇと、推定ｃｒｅ配列と、ｂｐ＋１とｍａｎＲとの間の転写開始領域と、ｍａｎＲの部分とを含むＢ．サチリスからの核酸配列は、図２及び図３において示されており、図３においては、ｍａｎＲはｌａｃＺによって置き換えられている。ｍａｎＲのプロモーター領域を含む本発明の核酸配列は、好ましくは、図３の核酸配列のｂｐ−１２２からｌａｃＺの開始コドンまで（配列番号３）を含み、より好ましくは、図３の核酸配列のｂｐ−１２２からｂｐ＋７まで、すなわち推定ｃｒｅ配列まで（配列番号４）を含み、特に、図３の核酸配列のｂｐ−１２２からｂｐ−１まで、すなわちｂｐ＋１の転写開始部位Ｇの上流（配列番号５）を含む。

ｍａｎＰ及びｍａｎＲのプロモーター領域の両者は、ＭａｎＲのための結合部位を含む。本発明は、また、配列番号１〜５のいずれかに相補的な配列及びそれらの変異体を含む。

本発明において使用されるマンノースオペロンのプロモーター領域、例えばｍａｎＰプロモーター領域、ｍａｎＲプロモーター領域（ｃｒｅ配列を有する又は有さない）並びに配列番号１〜５の配列によるプロモーター領域、それらに相補的な配列又はそれらの変異体は、通常は、Ｂ．サチリスのマンノースオペロンに由来するか、又は他の原核生物の、バシラス科の生物の機能的に等価なプロモーター領域に由来する。他の原核生物の機能的に等価なプロモーター領域は、Ｄ−マンノースによって誘導可能なプロモーター領域、すなわちマンノースの不在時よりもその存在時での発現活性がより高いプロモーター領域を含む。

Ｂ．サチリスのようなファーミキューテスなどの多くの原核生物において、マンノースオペロンは、Ｄ−マンノースの代謝に関与している。Ｂ．サチリスは、多くの種々の糖類を炭素源として使用できる。グルコース及びＤ−マンノースなどのヘキソースは、主に、ホスホエノールピルビン酸：炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を介して吸収される。そのＰＴＳにおいて、それぞれのヘキソースは、同時にリン酸化され、かつ取り込みの間に細胞中に輸送される。特定の糖基質の取り込みと利用は、炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）の支配下にある。グルコースの存在において、つまりＢ．サチリスの好ましい糖基質の存在において、他の基質の取り込みと利用のための遺伝子、例えばマンノースオペロンの転写は抑制される。Ｂ．サチリスにおけるグルコース依存性ＣＣＲのメカニズムは、広く研究され、当業者に知られている（Ｓｔｕｅｌｋｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ"，ｉｎ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，２０００，ｐａｇｅｓ ８４９−８８０）。

本発明による転写ユニットは、通常は更に、前記の転写ユニットの翻訳の開始点（開始コドン）の上流に翻訳開始領域を含み、該翻訳開始領域は、核酸配列に作動的に連結されている。翻訳開始領域は、通常は、ＡＴＧ、ＧＴＧ又はＴＴＧでありうる転写ユニットの翻訳の開始点の直近の上流に位置している。

翻訳開始領域は、マンノースオペロンにおけるｍａｎＰ遺伝子又はｍａｎＲ遺伝子の転写ユニットの翻訳開始領域であってよい。

マンノースオペロンのｍａｎＰ又はｍａｎＲの遺伝子の翻訳開始領域は、部分的に又は完全に、他の翻訳開始領域によって置き換えられていてよい。

例えば、ｔｕｆＡ（延長因子Ｔｕ）及びｇｓｉＢ（ストレスタンパク質；Ｊｕｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５８，５３８−５４５）の両者ともＢ．サチリス由来の翻訳開始領域を使用することができる。

ｔｕｆＡ及びｇｓｉＢのそれぞれの核酸配列は以下に示されており、そこでは、開始コドンは太字で示され、制限部位には下線が引かれており、シャインダルガーノ配列は強調表示されている。

転写開始領域の好適な選択によって、ｍＲＮＡの安定性は高められ、それは遺伝子発現における重要な特徴である。ｍＲＮＡの安定性は、その特定の半減期によって特徴付けられる。

転写開始領域に加えて、翻訳の開始点も並びに場合により開始点に続く遺伝子のコドンの数、例えば約５〜６コドンは、例えばｔｕｆＡ及びｇｓｉＢのそれぞれの核酸配列で前記に示したように置き換えられていてよい。

翻訳開始領域は、更に、本発明の異種核酸配列に作動的に連結されたシグナル配列をコードする配列を含んでよい。該シグナル配列は、通常は、ＡＴＧ、ＧＴＧ又はＴＴＧでありうる転写ユニットの翻訳の開始点の直近の上流に位置している。

ジシストロン性又はポリシストロン性の転写ユニットが使用される場合に、それぞれのシストロンに作動的に連結された異なる又は同一のシグナル配列を適用できる。好ましくは、かかる場合には異なるシグナル配列が使用される。使用されるシグナル配列は、原核性の又は真核性のシグナル配列であってよい。通常は、原核性のシグナル配列が適用される。

本発明の発現ベクターで使用されるべきシグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、市場で入手できるか、又は化学合成することができる。例えば、シグナル配列は、例えばＢｅａｕｃａｇｅ & Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ＬｅＨｓ．２２，１８５９−１８６２に記載される固相ホスホラミダイトトリエステル（ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ）法に従って、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ．Ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されるようにして合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、本来のアクリルアミドゲル電気泳動か又はアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって、Ｐｅａｒｓｏｎ & Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載されるようにして実施することができる。

通常は、転写ユニットは、更に、転写終結領域を含む。

好ましくは、強力な転写終結領域は、転写ユニットから隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）プラスミド配列への、並びに他のプラスミドプロモーターから転写ユニットへの、該プロモーターによる"読み過ごし"を避けるために使用される。ｍＲＮＡの更なる安定化は、かかる転写終結領域の存在で観察された。

強力な転写終結領域の好適な一例は、Ｂ．サチリス１６８由来のｔｕｆＡの３′領域からの核酸配列５′−ＣＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧ−３′を有し、それは市販されている。

本発明による異種核酸配列は、宿主に対して異物である発現産物をコードする。宿主がＢ．サチリス又はＥ．コリなどの原核性の種である場合に、関心が持たれる核酸配列は、より好ましくは、ガンマ−プロテオバクテリアのような他のクラスに、例えばブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種などに、特に古細菌などの異なる門に、最も特別には哺乳動物などの真核生物に、特にヒトに由来してよい。しかしながら、該異種の核酸配列は、宿主の"コドン使用頻度"に従って改変してよい。本発明による異種の配列は、通常は、関心が持たれる遺伝子である。関心が持たれる遺伝子は、好ましくは、異種のポリペプチドを、例えば構造タンパク質、調節タンパク質又は治療タンパク質を、又は構造タンパク質、調節タンパク質又は治療タンパク質と他のタンパク質（"タグ"）、例えば緑色蛍光タンパク質とのＮ末端融合もしくはＣ末端融合又は他の融合タンパク質を包括（ｅｎｃｌｏｓｅ）している。異種の核酸配列は、同様に、例えばアンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡの形態で使用できる転写物をコードしてよい。

該タンパク質は、宿主細胞の細胞質もしくはペリプラズム間隙に存在する及び／又は細胞外媒体中に存在する不溶性アグリゲートもしくは可溶性タンパク質として産生されうる。好ましくは、該タンパク質は、宿主細胞のペリプラズム間隙に存在する及び／又は細胞外媒体中に存在する可溶性タンパク質として産生される。

関心が持たれる異種のタンパク質は、ヒト由来、哺乳動物由来又は原核生物由来であってよい。他のタンパク質は、微生物病原体由来の、ウイルス性と抗菌性の両方の由来の、及び腫瘍由来の抗原、例えば糖タンパク質及び炭水化物である。他のタンパク質は、キモシン、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、グルカナーゼ、オキシダーゼ、α−アミラーゼ、オキシドレダクターゼ、リパーゼ、アミダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、エステラーゼ又はニトリラーゼのような酵素である。

本発明においては、シグナル配列及び異種の核酸配列が発現ベクター内で配置される順序と距離は様々であってよい。好ましい実施態様においては、シグナル配列は、例えば関心が持たれるポリペプチドをコードする核酸配列の５′側（上流）にある。シグナル配列と、例えば関心が持たれるポリペプチドをコードする核酸配列とは、０個〜約１０００個のアミノ酸によって分離されていてよい。好ましい実施態様においては、シグナル配列と、例えば関心が持たれるポリペプチドをコードする核酸配列とは、互いに直接的に隣接している、すなわち０個の核酸によって分離されている。

好ましくは、本発明のベクターは、配列番号１〜５の配列のいずれかによる核酸配列、それらに相補的な配列及びそれらの変異体を含む。

また、本発明に含まれるのは、本発明によるベクターを、原核性の宿主における核酸配列の調節された異種の発現のために用いる使用である。

発現は、好適なインデューサーの添加によって開始される。マンノースオペロンのインデューサーは、マンノース又はマンノースオペロンのｍａｎＲプロモーター領域もしくはｍａｎＰプロモーター領域を誘導できるその誘導体である。発現は、原核性の宿主に利用できるインデューサーの量によって調節することができる。

更にもう一つの態様においては、本発明は、マンノースオペロンのプロモーター領域を含む単離され精製された核酸配列を提供する。好ましくは、前記の単離され精製された核酸配列は、マンノースオペロンのｍａｎＰプロモーター及び／又はｍａｎＲプロモーターを含む。より好ましくは、前記の単離され精製された核酸配列は、配列番号１〜５のいずれかを含む。マンノースオペロンのプロモーター領域を含む単離され精製された核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む転写ユニットに作動的に連結されていてよく、その際、前記ポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、マンノースオペロンのプロモーター領域の制御下にある。

本発明による単離され精製された核酸配列は、調節遺伝子ｍａｎＲの完全な又は部分的な配列を含んでよい。

少なくとも、ｍａｎＲプロモーターの単離され精製された核酸配列は、ｃｒｅ配列を含む。

本発明の単離され精製された核酸配列は、標準的なＰＣＲプロトコールに従って、当業者によく知られた方法に従って単離することができる。前記の精製された単離されたＤＮＡ配列は、更に、核酸配列によりコードされる産物の発現に通常使用される当該技術分野で公知の１つ以上の調節配列、例えばエンハンサーを含んでよい。

本発明のベクター又は本発明の単離され精製された核酸配列で効果的にかつ安定的に形質転換された宿主細胞を選択するために、選択可能なマーカー（抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、関心が持たれる核酸配列と一緒に宿主細胞中に導入することができる。選択可能なマーカーをコードする遺伝子は、前記ベクター上に又は単離された精製された核酸配列上に位置してよく、又は場合により分かれた形で、例えば別個のベクター上で同時導入してよい。スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、アンピシリン及びテトラサイクリンなどの抗生物質に対する耐性を付与するものを含んだ様々な選択可能なマーカーを使用することができる。抗生物質の量は、選択条件をもたらすのに望ましいように適合することができる。通常は、１種の選択可能なマーカーが使用される。

該ベクターがシャトルベクターである場合に、複数の好適な宿主に共通のマーカーを使用してよい。例えば、前記のベクターが、Ｅ．コリとＢ．サチリスの両方で複製可能なシャトルベクターである場合に、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）のスペクチノマイシン−アデニルトランスフェラーゼをコードするスペクチノマイシンに対する耐性を付与する耐性マーカー遺伝子を使用することができる。

同様に、蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子は、形質転換の効率を測定するために、関心が持たれる核酸配列と一緒に宿主細胞中に導入することができる。

好適なレポーター遺伝子は、例えば増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺである。両者のレポーター遺伝子は市販されており、かつ広範に使用されている。

本発明のもう一つの態様は、本発明のベクターで形質転換された原核性の宿主であって、該ベクターがマンノースオペロンのプロモーター領域を含む宿主を提供することである。好ましくは、前記のベクターは、配列番号１〜５のいずれか、それらに相補的な配列又はそれらの変異体を含む。

広範な様々な原核性の宿主細胞は、本発明によるマンノースオペロンのマンノースで誘導可能なプロモーター領域で形質転換するために有用である。これらの宿主は、グラム陽性細胞の菌株、例えばバシラス及びストレプトマイセス又はグラム陰性細胞、例えばＥ．コリ及びシュードモナスを含んでよい。好ましくは、前記の宿主細胞は、グラム陽性細胞、特にファーミキューテス門のグラム陽性細胞であり、より好ましくは、前記の宿主細胞は、バシラスである。

使用できるバシラスは、例えば菌株のＢ．サチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ナットウ（Ｂ．ｎａｔｔｏ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）などである。好ましくは、前記の宿主細胞は、Ｂ．サチリス、例えばＢ．サチリス３ＮＡ及びＢ．サチリス１６８である。

使用できるＥ．コリは、例えば菌株のＴＧ１、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉであり、それらは市販されている。

好適な宿主細胞は、例えば菌株保存機関、例えばＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）、ブラウンシュバイク、ドイツ）から商業的に入手できる。例えば、バシラスは、バシラス・ジェネティック・ストック・センター（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）から得ることができる。

宿主細胞は、マンノースを代謝できても代謝できなくてもよい。通常はマンノースを取り込み代謝することができるＢ．サチリスのような宿主細胞は、マンノースの取り込み及び／又は代謝に関連する１つ以上の機能において欠落するように改変されていてよい。マンノースの取り込み及び／又は代謝に関連する１つ以上の機能における欠落は、マンノース−６−ホスフェート−イソメラーゼをコードするｍａｎＡ遺伝子などのタンパク質をコードする遺伝子の発現を例えば抑制又は遮断することによって達成できる。これは、トランスポゾンにサポートされた突然変異誘発又はノックアウト突然変異などの公知の技術によって行うことができる。

通常は、原核性の宿主は、選択されたシグナル配列に相応するものである。例えばバシラスのシグナル配列が使用される場合には、宿主細胞は、通常は、同じバシラス科のメンバーであり、より好ましくは宿主細胞は、バシラス菌株である。

好ましくは、ホスホエノールピルビン酸：炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を有する宿主が使用される。特に、ＰＴＳ系を有する宿主は、バシラス目の、特にバシラス属の、より好ましくはバシラス・サチリス種の微生物又はエンテロバクテリア目の、好ましくはエシェリキア属の、より好ましくはＥ．コリ種の微生物である。

ＣＣＲの主要なエレメントは、カタボライト制御タンパク質Ａ（ＣｃｐＡ）であり、それはｃｒｅ配列、例えば配列番号３及び４の推定ｃｒｅ配列に結合できる。それぞれの遺伝子のＣｃｐＡ転写の結合状態において、ここではｍａｎＲが抑制される。

グルコースの不在下で、かつＤ−マンノースなどのインデューサーの存在下において、ＣｃｐＡの結合による抑制はなく、かつマンノースオペロンの遺伝子の転写は、マンノースオペロンのプロモーター領域のそれぞれの結合部位に調節タンパク質（ＭａｎＲ）が結合することによって開始される。驚くべきことに、本発明者によって、ＭａｎＲは、ｍａｎＰプロモーター領域のための調節タンパク質であるのみならず、ｍａｎＲそれ自体のための自己レギュレーターであることが見出された。

更に、本発明により、宿主細胞におけるポリペプチドの生産方法であって、
ａ）ベクターを構築する工程、
ｂ）原核性の宿主を前記のベクターで形質転換する工程、
ｃ）前記ポリペプチドを細胞培養系中で好適な条件下で発現させる工程、
ｄ）前記のポリペプチドを細胞培養系から回収する工程
を含む前記方法が提供される。

使用されるベクター並びにその構築及び原核性の宿主の形質転換は前記定義の通りであり、一方で、ベクターに含まれる異種の核酸配列は、ポリペプチドをコードする。

細胞培養系として、連続的な又は不連続的な培養、例えば回分培養又は流加培養を、培養管、振盪フラスコ又は細菌発酵器で適用できる。

宿主細胞の培養のためには、当該技術分野で公知の慣用の培地、例えば"栄養酵母ブロス培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｙｅａｓｔ ｂｒｏｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）"、つまりＫｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９，５９−６５によって記載されるグリセロール含有培地、Ｋｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３５，１によって記載される無機塩培地、Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３，９５−１０３によって記載されるＥ．コリ発酵用のバッチ培地又はＢｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ，１０５１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６２，２９３−３００によって記載されるＬＢ培地のような複合培地を使用することができる。

該培地は、好適な炭素源、例えば糖、例えばグルコースを増殖されるべき宿主細胞のための基質として含む。基質として使用される炭素源は、インデューサーとは異なる。

該培地は、適宜、例えば更なる成分、例えば当業者に一般に知られる緩衝剤、塩、ビタミン、アミノ酸、抗生物質又は他の微量栄養素を添加することによって改変してよい。

同様に、細胞の培養の間に異なる培地又は培地の組合せ物を使用することができる。

好ましくは、基礎培地として使用される培地は、マンノースプロモーター領域のしっかりとした調節を達成するためにインデューサーを含むべきでない。

インデューサーの添加は、培養が測定パラメータに達した後に開始することができる。かかる測定パラメータのための例は、培養の細胞濃度を示す光学密度（ＯＤ）又はインデューサーとは異なる炭素源の濃度である。

例えば、本発明の方法において、インデューサーは、培養が特定の培養系に依存して好適なＯＤに達した後に添加することができる。振盪フラスコにおける回分培養のためには、測定パラメータとしての一般的なＯＤ₆₀₀は、約０．３以上である。

通常は、原核性の宿主の培養の培地中のマンノースなどのインデューサーの量は、約１０ｇ／ｌ、好ましくは約５ｇ／ｌ、より好ましくは約２ｇ／ｌであるように調整される。

しかしながら、添加されるインデューサーの量は、特定の発酵法の要求に適合させることができる。

インデューサーの添加の様式（誘導レジーム）は、特定の培養系に従って選択することができる。

添加の様式によって、宿主細胞の増殖速度及び発現速度は、更に調節することができる。

例えば、マンノースは、断続的に又は連続的に、好適な時間にわたって添加することができる。断続的な様式（インパクト誘導）においては、添加は、誘導の時点のみの一回であってよく、又は好適なインターバルで２回あるいは数回でさえあってもよい。好適な様式は培養系に依存し、そして当業者によって簡単に決定することができる。

例えば、連続的な様式においては、マンノースは、一定速度で、又は低下する速度／増加する速度で添加してよい。

連続的な添加は、更に選択された培養の時間インターバル内であってよく、培養の指数増殖の間の選択された時間インターバル内であってもよい。

更に、断続的及び連続的な誘導レジームの組み合わせは、可能である。

回分段階における本発明の流加培養の一実施態様によれば、細胞は、２０〜３０のＯＤ₆₀₀の細胞密度にまで増殖され、次いで培養は、第一の炭素源とマンノースの混合物の添加をもって供給段階に切り換えられる。供給段階において、第一の炭素源：マンノースの比率は様々であってよく、好適な比率は、３：１〜１：３である。第一の炭素源：マンノースの比率の変動によって、発現速度を制御できる。

好適なｐＨ範囲は、例えば６〜８であり、好ましくは７〜７．５であり、好適な培養温度は、１０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃である。

細胞は、通常は、必要である限りは、発現された産物及び／又はバイオマスの最大量が累積されるまで、好ましくは１時間から２０日まで、より好ましくは５時間から３日までインキュベートされる。

バイオマスの収量としては、発現された産物の量は、使用される培養系に依存する。

振盪フラスコ培養において、通常は、発現される産物は、培養培地１リットルあたり０．５ｇの量で、本発明のベクターで形質転換された宿主によって産生させることができる。回分様式及び／又は流加様式での発酵器での培養を使用して、発現された産物は、通常は１リットルの発酵ブロスあたり０．５ｇ超の量で、好ましくは１ｇ／ｌ超の量で、より好ましくは１．３ｇ／ｌ超の量で得ることができる。

更に、本発明の宿主細胞を使用した本発明の発酵法においては、高い細胞密度は、少なくとも１０〜３０のＯＤ₆₀₀で、特に少なくとも５０のＯＤ₆₀₀で、好ましくは約２５０以上のＯＤ₆₀₀で、より好ましくは少なくとも５００のＯＤ₆₀₀で、最も好ましくは少なくとも１０００のＯＤ₆₀₀で得ることができる。特に、本発明による流加法においては、５０のＯＤ₆₀₀以上で、１０００超のＯＤ₆₀₀までの細胞密度を得ることができる。

説明のために、１のＯＤ₆₀₀は、平均して、１リットル当たり約０．３２２ｇの乾燥質量に相当する。従って、１００のＯＤ₆₀₀値は、１リットル当たり３２．２ｇの乾燥質量に相当し、そして５００のＯＤ₆₀₀は、１リットル当たり１６１ｇの乾燥質量に相当する。

更に、本発明による宿主細胞は、ベクターの損失なくして高い複製速度を可能にする。

宿主細胞における発現の後に、発現された産物、例えば関心が持たれるポリペプチドは、宿主細胞の培養から回収することができる。発現された産物の最大の収率を得るために、それらの細胞は、通常は、培養の終わりに収穫し溶解され、例えばリソザイム処理、超音波処理もしくはフレンチプレスによって溶解される。このように、該ポリペプチドは、通常はまず、宿主細胞の粗製溶解物として得られる。次いで、それらは、当該技術分野で知られる標準的なタンパク質精製手順によって精製できる。前記手順は、分別沈殿、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー及びイムノアフィニティークロマトグラフィーを含んでよい。これらのよく知られた通常に実施される方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）及びＷｕ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。例えば、組み換え的に製造された免疫グロブリンの精製のためには、該グロブリンは、イムノアフィニティークロマトグラフィーを用いて、発現されたイムノグロブリンが特異的に結合できる標的分子が結合された樹脂を含むカラムに通すことによって精製することができる。

本発明は、また、例えば原核性の宿主におけるポリペプチドをコードする核酸の細胞内の異種発現のための方法及び手段に関する。特に、本発明は、ベクター並びにかかるベクターを、原核性の宿主における異種のポリペプチドを本発明のベクターを使用して細胞内発現させるために用いる使用に関する。細胞内発現において、該ポリペプチドは、細胞質内で発現され、細胞質から非細胞質位置へと輸送されない。該ポリペプチドは、細胞質内で、封入体又は可溶化形で発現される。細胞からの、特に細胞抽出物からのポリペプチドの単離及び精製のための手順は、またよく知られている。

本発明のマンノースプロモーターは、それらが通常の非毒性の従って産業上有用な化合物によってしっかりと調節でき、誘導できるという点で好ましい。

更に、本発明のマンノースプロモーター並びに該マンノースプロモーターを含むベクターは、細胞内で安定であり、複数回の細胞の複製の後でさえも失われない。このように、本発明により形質転換された宿主細胞を用いた高細胞密度発酵が可能である。

当業者は、本願に記載される発明は、特別に記載されたもの以外の変化及び変更が可能であると理解する。本発明は、本発明の主旨又は必須の特徴から逸脱することのない全てのかかる変化及び変更を含むと解されるべきである。本発明は、また、個別に又はまとめて本願明細書で言及され又はそこで指摘されている全ての工程、特徴、組成物及び化合物並びに任意の及び全ての組み合わせ又は前記の工程もしくは特徴の任意の２種以上を含む。従って、本願の開示は、説明される全ての態様で考慮されるべきであって、制限するものではなく、その際、本発明の範囲は、付随する特許請求の範囲によって示され、かつ均等の意味及び範囲内のあらゆる変更は、そこに含まれるものと意図される。様々な参考文献が本願明細書を通して引用されているが、そのそれぞれは、参照をもってその全内容が開示されたものとする。

図１には、ｍａｎＰプロモーターの転写開始部位のマッピングにおいて使用されるＢ．サチリスからの核酸配列が示されている。 図２には、ｍａｎＲプロモーターを含むプロモーター領域の核酸配列が示されている。 図３には、それぞれｐＳＵＮ２９１、ｐＳＵＮ３８４．１及びｐＳＵＮ３８５．２に含まれるｍａｎＲプロモーターのプロモーター領域を含むＢ．サチリスから得られた核酸配列が示されている。 図４には、本発明による発現ベクターｐＳＵＮ２７９．２のプラスミドマップが示されている。 図５には、本発明によるプラスミドｐＳＵＮ２７９．２、ｐＳＵＮ２８４．１及びｐＳＵＮ２９１をそれぞれ含むＢ．サチリス３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。 図６には、ｍａｎＲのＣ末端を含むＢ．サチリス由来のｍａｎＰプロモーターのプロモーター領域を含むＢ．サチリスから得られる核酸配列が示されている。 図７には、プラスミドｐＳＵＮ２７９．２と、図６に示される種々の長さの核酸配列の断片を含む更なるプラスミドとを含んだＢ．サチリス３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。 図８には、図３に示される核酸配列を有するベクターｐＳＵＮ２９１、ｐＳＵＮ３８４．１及びｐＳＵＮ３４５．２を含むＢ．サチリス３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。 図９には、本発明による発現ベクターｐＭＷ１６８．１のプラスミドマップが示されている。 図１０には、Ｂ．サチリス３ＮＡ中のｐＭＷ１６８．１のプラスミド安定性試験の結果に関する図が示されている。 図１１ａには、発酵行程１の期間にわたってプロットされた乾燥バイオマス濃度を対数表示した図が示されている。 図１１ｂには、発酵行程１の期間にわたってプロットされた蛍光シグナル（ＲＦＵ）に関する図が示されている。 図１２ａには、発酵行程２の期間にわたってプロットされた乾燥バイオマス濃度を対数表示した図が示されている。 図１２ｂには、発酵行程２の期間にわたってプロットされた蛍光シグナル（ＲＦＵ）に関する図が示されている。 図１３ａには、発酵行程３の期間にわたってプロットされた乾燥バイオマス濃度を対数表示した図が示されている。 図１３ｂには、発酵行程３の期間にわたってプロットされた蛍光シグナル（ＲＦＵ）に関する図が示されている。 図１４ａには、発酵行程４の期間にわたってプロットされた乾燥バイオマス濃度を対数表示した図が示されている。 図１４ｂには、発酵行程４の期間にわたってプロットされた蛍光シグナル（ＲＦＵ）に関する図が示されている。 図１５には、発酵行程５の発酵の期間にわたってプロットされた蛍光シグナルの図が示されている。 図１６には、発酵行程６の発酵の期間にわたってプロットされた蛍光シグナルの図が示されている。 図１７には、実験４の（ａ）プラスミドｐＭＷ１６８．１の構築に従って得られたプロモーター開始の概略構造が示されている。 図１８には、プラスミドｐＭＷ１６８．１の構築のフローチャートが示されている。 図１９には、ＳＤＳページが示されている。

前記の詳細な説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかしながら、かかる実施例は、本発明の実施方法の例示であって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

Ｉ） マンノースオペロンのｍａｎＲプロモーター及びｍａｎＰプロモーターのプロモーター領域の単離及び同定
特に規定されない限りは、以下の材料及び方法を使用している：
細菌菌株及び増殖条件
Ｅ．コリＪＭ１０９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３３，１９８５，１０３−１１９）及びバシラス・サチリス３ＮＡ（Ｍｉｃｈｅｌ Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３，１９７０，２２０−２２７）を、クローニング及び発現のための主要な宿主として使用した。Ｅ．コリは、ＬＢ液体培地（Ｌｕｒｉａ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２，１９６０，３４８−３９０）及びＬＢ寒天プレートであって、１００μｇ ｍｌ^-1のアンピシリン又はスペクチノマイシンを補ったものにおいて３７℃で増殖させた。Ｂ．サチリスは、ＬＢ液体培地及びＣ最少培地もしくはＳ最少培地において３７℃で増殖させた（Ｍａｒｔｉｎ−Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１４，１９９０，６５７−６７１）。液体培地及び寒天プレートには、１００μｇ ｍｌ^-1のスペクチノマイシン、１０μｇ ｍｌ^-1のカナマイシン又は５μｇ ｍｌ^-1のエリスロマイシンのそれぞれを補った。マンノースプロモーターの誘導のために、滅菌濾過した又はオートクレーブにかけたＤ−マンノースを添加して、０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度にした。

材料
全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔａｕｆｋｒｉｃｈｅｎ、ドイツ）、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ、ドイツ）又はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から入手した。合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）から入手した。制限酵素及びＤＮＡ改変酵素は、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）又はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ ａｍ Ｍａｉｎ、ドイツ）から入手した。ＰＣＲは、Ｂｉｏｚｙｍ社製のＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ上で、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製（ＳＴ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ、ドイツ）の高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。

ＤＮＡの調製と形質転換
Ｅ．コリ及びＢ．サチリスからの又はアガロースゲルからのＤＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）又はＲｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）のＤＮＡ調製キットを用いて製造元の指示に従って実施した。実施例を通じて標準的な分子的技術を使用した。

Ｅ．コリは、プラスミドＤＮＡによってＣｈｕｎｇ Ｃ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１９８９，２１７２−２１７５に記載されるようにして形質転換させた。Ｂ．サチリスは、プラスミドＤＮＡによって改変された"パリ法（Ｐａｒｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）"（Ｈａｒｗｏｏｄ Ｃ．Ｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，１９９０，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）に従って形質転換させた。

β−ガラクトシダーゼ活性測定
試験されるべき細胞０．１ｍｌをＺバッファー０．９ｍｌ中で１０μｌのトルエンで３７℃において３０分間にわたり処理した。β−ガラクトシダーゼ活性は、ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドを用いて２２℃でＭｉｌｌｅｒ法（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．，１９７２，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に従って測定した。

使用したオリゴヌクレオチド
第１表

実験１：
マンノースオペロンのプロモーター領域を有するＤＮＡ断片の単離及びｍａｎＲプロモーター及びｍａｎＰプロモーターの転写開始部位の決定
バシラス・サチリス１６８の染色体ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）のＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキットを使用することにより単離した。

推定ｍａｎＲプロモーターを有する完全なｍａｎＲと、ｍａｎＲとｍａｎＰとの間の遺伝子間領域とを有する約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、前記の得られたＤＮＡからプライマーｓ４６９３／ｓ４６９４を使用したＰＣＲによって増幅させた。

得られた約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ｍａｎＲプロモーター及びｍａｎＰプロモーターの転写開始部位の決定のためのプライマー伸長実験のために使用した。

プライマー伸長のためのｍＲＮＡの単離のために、シャトルファクター（ｓｈｕｔｔｌｅ ｆａｃｔｏｒ）を、Ｅ．コリのベクターｐＩＣ２０ＨＥ（Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６，４５７−４６６）及びＢ．サチリスのベクターｐＵＢ１１０（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ １５，９３−１０３）から構築した。それらのベクターは、レポーター遺伝子としてｌｙｓ遺伝子を含み、前記遺伝子は、スタフィロコッカス・シミュランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）由来のリソスタフィンの成熟形をコードしている（Ｒｅｃｓａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，１１２７−１１３１）。この高コピーのｐＵＢ１１０誘導体中に、前記の２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、リソスタフィン遺伝子の上流にクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＵＮ１７８．４と名付け、バシラス・サチリス３ＮＡ中に導入した。

プラスミドｐＳＵＮ１７８．４を有するバシラス・サチリス３ＮＡを、カナマイシンを有するＬＢ培地中で増殖させた。指数増殖期において、培養を０．２％のマンノースで誘導した。３７℃での１時間の増殖の後に、誘導された細胞と誘導されていない細胞を収穫した。全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ−ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットで単離した。

５′末端でＣｙ５標識されたプライマーであるｓ５００６、ｓ５００７、ｓ５０９７及びｓ５０９８を使用した。

プライマーのｓ５００６及びｓ５００７は、それぞれ、リソスタフィン遺伝子の開始コドンに対して＋２１から＋５０までと＋７６から＋１０５まででハイブリダイズした。プライマーのｓ５０９７及びｓ５０９８は、それぞれ、ｍａｎＲの開始コドンに対して＋８１から＋１０１までと＋１３１から＋１５３まででハイブリダイズした。

サイズスタンダードとしての役割を担うｐＳＵＮ１７８．４のプラスミドＤＮＡのシーケンシング反応のために同じプライマーを使用した。Ｒｏｃｈｅ社製のＡＭＶ−リバーストランスクリプターゼ及びＴ７−ＤＮＡポリメラーゼを、それぞれ逆転写とＤＮＡシーケンシングのために使用した。逆転写及びシーケンシングの産物を、変性ポリアクリルアミドシーケンシングゲル（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で解析した。使用した全ての他の試薬は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡｕｔｏＲｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットによって提供された。

ｍａｎＰプロモーターの転写開始部位は、プライマーのｓ５００６を使用することにより決定した。プラスミドｐＳＵＮ１７８．４のＤＮＡ配列反応を、同じプライマーを用いて、比較のために同じ変性ゲルで準備し行った。図１は、ｍａｎＰプロモーターの周辺のＤＮＡ配列が示されており、その際、Ａ（アデニンヌクレオチド）にある転写開始部位は強調表示されている。推定−１０ボックス及び−３５ボックスはイタリック体で示し、ｍａｎＲ遺伝子の終わりとｌｙｓ遺伝子の始まりを矢印によって表示し、Ｂｇｌ−ＩＩ、ＸｂａＩ、ＡｆｌＩＩ及びＮｄｅＩのための制限部位に下線を引いた。

ｍａｎＲプロモーターの転写開始部位は、ＲＮＡ単離とＤＮＡシーケンシングで決定した。それは、ｍａｎＲ遺伝子に結合するプライマーのｓ５０９８を使用したことを除いて、ｍａｎＰプロモーターに関して前記のように実施した。

図２及び図３において、ｍａｎＲプロモーター領域のＤＮＡ配列が示されており、その際、Ｇ（グアニンヌクレオチド）にある転写開始部位は、強調表示され、推定−１０ボックス及び−３５ボックスはイタリック体で、かつｌｙｓ遺伝子の始まりとｍａｎＲ遺伝子の始まりは、それぞれ矢印によって示されている。制限部位と推定ｃｒｅ配列に下線を引いている。

ｍａｎＲプロモーターからの転写と、特にｍａｎＰプロモーターからの転写は、マンノースにより細胞が誘導された場合には、プライマー伸長実験でより強力なシグナルによって理解されるように、大きく増加した。

使用されるプライマーは、前記の第１表に示されている。

実験２
実験１によるプライマー伸長実験により、ｍａｎＰプロモーターの転写開始部位は、ｍａｎＲとｍａｎＰの開始との間の遺伝子間領域の３′末端付近に位置づけられた。ｍａｎＰプロモーター領域をより厳密に決定するためには、前記の２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅によって段階的に短くし、得られた異なる長さの配列断片を、同じ基礎発現ベクターにクローニングし戻して発現を研究した。

ａ） 基礎発現ベクターの構築
レポーター遺伝子としてのプロモーターレスのｌａｃＺを有する発現ベクターを構築した。該発現ベクターは、Ｂ．サチリスとＥ．コリの両方で複製できるシャトルベクターとして設計され、それはｐＳＵＮ２７２．１と名付けた。

レポーター遺伝子であるｌａｃＺをｐＬＡ２（Ｈａｌｄｉｍａｎｎ Ａ．ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，６３８４−６３９３）からＮｄｅＩ及びＸｍａＩを用いて切断し、そしてｐＪＯＥ５５３１．１、つまりラムノースで誘導可能な発現ベクターｐＷＡ２１（Ｗｅｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＢＭＣ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，２）の誘導体であってＸｍａＩ部位にＢ．サチリスのｔｕｆＡ転写ターミネーターを含むものにライゲーションした。このプラスミド中に、オリゴヌクレオチド対のｓ４９５６／４９５７を、ｌａｃＺの上流に同じｔｕｆＡ転写ターミネーターを付加するために、ＡｆＩＩＩ／ＭｕｎＩ制限部位の間に挿入した。ここで、プラスミドプロモーターからのｌａｃＺへの"読み過ごし"並びにｌａｃＺから隣接するプラスミド配列への"読み過ごし"は、前記ターミネーターによって回避された。Ｅ．コリとＢ．サチリスの両方に特異的なスペクチノマイシン耐性遺伝子を、プラスミドのｐＤＧ１７３０（Ｇｅｕｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １８０，５７−６１）からオリゴヌクレオチドのｓ４８３３／４８３５を用いて増幅させ、それを前記に得られたプラスミド中に挿入した。加えて、Ｅ．コリベクターの部分を、ＢｓｐＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の欠失によって短くした。引き続き、Ｂ．サチリスのｐＭＴＬＢＳ７２（Ｌａｇｏｄｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）３９，３４５−３４８）の複製領域を有するＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ断片を前記プラスミド中にライゲーションした。

実験１で得られた２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＳＵＮ２７２．１中にｌａｃＺの前方においてＡｆＩＩＩとＮｈｅＩでの消化とライゲーションによって挿入し、それにより発現ベクターｐＳＵＮ２７９．２が得られ、該プラスミドのマップを図４に示す。使用されるプライマーは、前記の第１表に示されている。

ｂ） ベクターｐＳＵＮ２７９．２の発現効率の測定
前記のａ）で得られたプラスミドであるｐＳＵＮ２７９．２及びｐＳＵＮ２７２．１をＢ．サチリス３ＮＡ中に導入した。後者のプラスミドは、バックグラウンドコントロールとして用いた。一方のプラスミド又は他方のプラスミドを有するＢ．サチリス３ＮＡ菌株をスペクチノマイシンを有するＬＢ培地中で増殖させ、そして指数増殖期において、０．２％のマンノースを誘導のために培養に添加するか、０．２％のマンノースと０．２％のグルコースを誘導のために培養に添加するか、あるいは糖を培養に添加しない（誘導されていないコントロール）か、のいずれかとした。誘導１時間後に、細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｍｉｌｌｅｒのアッセイにより測定した。結果は、図５及び図７に示されている。

ｐＳＵＮ２７９．２を含むＢ．サチリスの誘導されていない培養は、既に相当高いβ−ガラクトシダーゼ活性の基底レベルを示した。マンノースが存在すると、β−ガラクトシダーゼ活性の更なる４倍の増加が得られ、一方で、マンノース及びグルコースにより前記活性は低減されるが、依然として基底レベルをかなり上回っていた。それらの結果は、明らかに、ｐＳＵＮ２７９．２で見られるプロモーター活性が、ｍａｎＲとｍａｎＰとの間の領域からか、ｍａｎＲの上流の領域からか、又はその両方から生じ得たことを示している。

従って、ｍａｎＲの上流領域並びにｍａｎＲの殆どの部分の両方を、ｐＳＵＮ２７９．２から、図４に示されるｐＳＵＮ２７９．２のＳｆｏＩとＮｒｕＩとの間の２．３ｋｂのＤＮＡ断片を切断することによって欠失させて、プラスミドｐＳＵＮ２８４．１を得た。

ｐＳＵＮ２８４．１の得られる核酸配列は、図６に示されている。

Ｂ．サチリス３ＮＡを、プラスミドｐＳＵＮ２８４．１で形質転換させ、そして発現効率を前記規定のように測定した。結果は図５に示されている。図５から理解できるように、Ｂ．サチリス３ＮＡにおける前記のｍａｎＲ欠失ベクターｐＳＵＮ２８４．１は、Ｂ．サチリス３ＮＡにおけるｐＳＵＮ２７９．２と比較して、ほぼたったの半分の基底レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性しか示さず、マンノース誘導によって一層強い増加を示すが、グルコースの存在で再びより大きい低減を示した。これらの結果は、ｍａｎＰプロモーターがｍａｎＲとｍａｎＰとの間に位置していることの証明であり、ｍａｎＲの染色体コピーが、低コピープラスミドにおいて全てのｍａｎＰプロモーターコピーを調節するのに十分であることを示している。

ｃ） ｍａｎＰプロモーター領域の位置決め
ｐＳＵＮ２８４．１の短くされたＤＮＡ断片に加えてｍａｎＰのプロモーター領域を局在化するために、更に短くされた配列断片を、前記の２．３ｋｂのＤＮＡ断片から、ｍａｎＰプロモーターの転写開始部位の上流にある種々の位置の制限部位でかつ図６に示される制限酵素によって切断することによって調製した。

ｍａｎＰの転写開始部位の上流のｂｐ−８１とｂｐ−８０へと下る欠失により、配列番号１を含む第二の欠失配列をもたらした。更なる欠失を、ｍａｎＰの転写開始部位の上流のｂｐ−４１とｂｐ−４０へと下って実施した（第三の欠失配列）。

第二の欠失配列を含むプラスミドであるｐＳＵＮ２９０及び第三の欠失配列を含むプラスミドであるｐＳＵＮ２９７．５を、前記の２ｂ）でのプラスミドｐＳＵＮ２８４．１と同様にして、プライマーｓ４８０２／ｓ５２０３及びｓ５２６２／ｓ５２０３のそれぞれを用いて増幅されたＰＣＲ産物をｐＳＵＮ２７２．１中に制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＮｈｅＩを介して挿入することによって構築した。

それらのプラスミドを、Ｂ．サチリス３ＮＡ中に挿入し、前記のｂ）で示したように培養し、１時間の誘導後に、該細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を、前記のｂ）で示したように測定した。それらの結果は、図７に示されている。

図７に示されているように、ｐＳＵＮ２９０及びｐＳＵＮ２８４．１を有する菌株のいずれも、マンノースによるｌａｃＺの誘導に関して大きな差異を示さなかった。しかしながら、ｐＳＵＮ２９７．５を含む第三の欠失配列を有するＢ．サチリス３ＮＡにおいて、マンノースによる誘導を完全に廃止したところ、基底発現レベルはほぼ０であった。これらの結果から、ｍａｎＰマンノースプロモーター領域のＭａｎＲ結合部位は、ｍａｎＰの転写開始部位に対してｂｐ−８０とｂｐ−３５の間に位置している。

実験３： ｍａｎＲプロモーターの決定
ａ） ｃｒｅ配列の同定
殆どのＣＣＲはカタボライト制御タンパク質Ａ（ＣｃｐＡ）を通じて媒介されるので、各々の結合部位（ｃｒｅ配列）の調査は、マンノースオペロン全体で、Ｃｌｏｎｅ ＭａｎａｇｅｒプログラムにおけるＤＮＡアラインメント機能を使用して実施した。該アラインメントのために、ｃｒｅコンセンサス配列５′−ＷＷＴＧＮＡＡＲＣＧＮＷＷＷＣＡＷＷ−３′を使用した。

ｍａｎＲのプロモーター領域だけで、１つの推定ｃｒｅ配列が、図２及び３に示されるように見出され、それは−１０ボックスの下流に位置している。

本発明の配列番号３は、ｂｐ−１２２から始まってｌａｃＺの開始コドンにまで下る領域を含み、配列番号４は、ｂｐ−１２２から始まってｂｐ＋７（含む）までの領域を含み、そして本発明の配列番号５は、図３に示される配列のｂｐ−１２２から始まってｂｐ−１（含む）までの領域を含む。

ｂ） ｍａｎＲプロモーターの発現効率の評価
ｍａｎＲプロモーターの発現効率を評価するために、ｐＳＵＮ２８４．１のような発現ベクターを、前記のように構築し、それをｐＳＵＮ２９１と名付けた。このために、推定ｍａｎＲプロモーターとｍａｎＲの上流の約６００ｂｐを含むＤＮＡ断片を、プライマーｓ５２０８／ｓ５２０９と、直鎖化したプラスミドＤＮＡのｐＳＵＮ２７９．２を鋳型として用いて増幅させ、それをｌａｃＺの前方でプラスミドのｐＳＵＮ２７２．１中に、ＫｐｎＩ及びＡｆｌＩＩＩでの消化とライゲーションとによって挿入した。該ＤＮＡ配列は、図３に示されている。

プラスミドのｐＳＵＮ２９１を、Ｂ．サチリス中に導入し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性を、実験２ｂ）で示したようにして測定した。

結果は図５に示されている。ここで、基底発現は既に比較的高く、かつ０．２％のマンノースの添加によって約３倍だけさらに高められた。

グルコースの添加によって、ほぼ基底発現レベルまでのβ−ガラクトシダーゼ活性の抑制がもたらされた。

その結果は、ｍａｎＲプロモーターがまさに弱い構成的プロモーターではなく、マンノースとＣＣＲの調節を受けやすいプロモーターであることを示している。

ｃ） ｍａｎＲプロモーター領域の位置決め
実験２ｃ）と同様に、ｍａｎＲのＤＮＡ配列のプロモーター領域の更なる位置決めのために、種々の長さのＤＮＡ断片を、ｐＳＵＮ２９１に含まれるＤＮＡ配列から、ｍａｎＲプロモーターの転写開始位置の上流の種々の位置で制限部位で、かつ図３に示される制限酵素によって切断することによって調製した。第一の欠失配列は、図３に示される配列を、転写開始部位Ｇの上流のｂｐ−１００及びｂｐ−９９にまで下って切断することによって得られ、第二の欠失配列は、転写開始部位Ｇの上流のｂｐ−８３及びｂｐ−８２にまで下って切断することによって得られた。

実験２ｃ）と同様にして、得られた第一の及び第二の欠失配列を、ｐＳＵＮ２７２．１中に導入し、そして得られたプラスミドを、ｐＳＵＮ３８４．１とｐＳＵＮ３８５．２とそれぞれ名付けた。

各プラスミドを、Ｂ．サチリス３ＮＡ中に挿入し、実験２ｂに示されるようにして培養した。誘導１時間後に、細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を、実験２ｂ）に示されるようにして測定した。それらの結果は、図８に示されている。ｐＳＵＮ３８４．１のマンノースによるｌａｃＺの誘導に関して、ｐＳＵＮ２９１と比較して大きな差異はない。しかしながら、ｐＳＵＮ３８５．２を含む第二の欠失配列を有するＢ．サチリス３ＮＡにおいて、マンノースによる誘導を完全に廃止したところ、基底発現レベルはほぼ０であった。これらの結果から、ｍａｎＲプロモーター領域のＭａｎＲ結合部位は、ｍａｎＲの転写開始部位に対してｂｐ−９９とｂｐ−３５の間に位置している。

ＩＩ） 高い細胞密度発酵におけるマンノースオペロンのプロモーター領域の使用
実験４： 形質転換
本発明のプロモーター領域を有するモデル宿主を、その増殖と発現能力について試験した。図６に示される実験２ｃで使用されるプラスミドｐＳＵＮ２８４．１に導入されるｍａｎＰプロモーター領域による核酸配列を使用して、プラスミドｐＭＷ１６８．１を、以下に示されるように構築し、宿主としてのＢ．サチリス３ＮＡ中に形質転換によって導入した。

ａ） プラスミドｐＭＷ１６８．１の構築
Ｅ．コリとＢ．サチリスの両方で複製可能なシャトルベクターは、実験２ａ）に示されるようにして設計したが、但し、ｌａｃＺの代わりにレポーター遺伝子としてｅＧＦＰを使用した。また、ｍａｎＰの転写開始領域を、遺伝子ｇｓｉＢ（ストレスタンパク質；Ｊｕｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記）の転写開始領域で置き換えた。

更に、ｅＧＦＰの開始コドンと開始コドン後の６つのコドンを置き換えた。

得られたプロモーター領域及び転写開始領域の概略的構造は、図１７に示されている。

遺伝子（矢印）及び領域（ボックス）の配置が関連の制限部位と一緒に示されている。

一般に、プラスミドｐＭＷ１６８．１は、図１８によるフローチャートに示されるようにして得られた。

該フローチャートにおいて、使用されるベクターＤＮＡ、挿入ＤＮＡ及び相補的オリゴヌクレオチドの名称はボックス中に示される通りであって、ＰＣＲの産物に関して、プライマーと鋳型ＤＮＡは、括弧内にある通りであり、使用された制限酵素は、それぞれの部位で指摘されている。

クローニング工程は、Ｅ．コリＪＭ１０９を用いて実施した。使用されるプラスミドは、ｐＵＣ１８、つまりａｍｐ耐性を有するＰＣＲ産物用の陽性選択及びクローニングのベクター（Ｙａｎｏｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記）；ｐＷＡ２１、つまりａｍｐ耐性を有するＥ．コリ用の発現及びクローニングのベクター（Ｗｅｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，２）；ｐＳＵＮ２０２．４、つまりｍａｎＰプロモーター領域とａｍｐ耐性及びｋａｎ耐性を有するｐＵＢ１１０誘導体（これは、Ｅ．コリとＢ．サチリスのためのシャトルベクターである）；並びにｐＳＵＮ２６６．１、つまりｔｅｒ配列とｓｐｃ耐性及びａｍｐ耐性との間に組み込み部位を有するｐＵＣ１８誘導体であった。

使用されるプライマーの配列は、以下の通りであった：

開始コドンと開始コドンに続く複数のコドンを含む転写開始領域の置き換えを、相補的オリゴヌクレオチドを使用して、単独の制限部位ＢｇｌＩＩ、ＡｆｌＩＩ及びＢａｍＨＩを介して実施した。ベクターの構築は、ベクターｐＷＡ２１（Ｗｅｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記）のＴ７遺伝子１０の転写開始領域の置き換えと一緒に、Ｂ．サチリス由来のｔｕｆＡの翻訳開始領域によって、相補的ヌクレオチドｓ５０１９及びｓ５０２０のそれぞれを介して開始した。更なるクローニング工程において、この転写開始領域を、ｇｓｉＢの転写開始領域によって置き換えた。この最終的なプラスミドｐＭＷ１６８．１は、ｐＵＢ１１０由来のｏｒｉ⁺を含むｒｅｐ遺伝子を含んでいた。ｐＭＷ１６８．１のプラスミドマップは、図９に示されている。

ｂ） 構造安定性と分配の測定
Ｂ．サチリス３ＮＡを、ベクターｐＭＷ１６８．１で形質転換させ、そして該ベクターの細胞分裂における構造安定性並びに安定な伝播（分配）を測定した。

ｐＭＷ１６８．１で形質転換されたＢ．サチリス３ＮＡをＬＢ_Spc培地中で前培養し、次いで選択圧を有さないＬＢ₀培地中に移した。インキュベーションは、３７℃で実施した。指数増殖期の終わりに、それぞれの培養を新たなＬＢ₀培地中に接種した。この手順を、新たな培地中に移す間に得られる測定されたＯＤ値に基づいて計算して１００世代目が得られるまで、Ｈａｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．の改変された方法に従って繰り返した。結果は図１０に示されている。

約１５世代の後で、細胞の９９．９％超が前記ベクターを依然として有しており、２０世代後でさえも、細胞の約９０％が前記ベクターを依然として有している。ほぼ第２５世代以降にのみ、ますます細胞がベクターを失っていく。

プラスミドの構造安定性の測定のために、２０個のコロニーからプラスミドを１５世代の後に単離した。それぞれ単離されたプラスミド約０．５μｇを、コントロールとしてのＥ．コリから単離したｐＭＷ１６８．１と、アガロースゲル電気泳動によって比較した。プラスミドとコントロールのランにおいて差異は観察されず、それは構造の変動が生じなかったことを示している。

これらの結果は、プラスミドｐＭＷ１６８．１が高い構造安定性を有するだけでなく、発酵に望ましい安定的な分配をも有することを示している。

実験５： 発酵
６つの発酵行程を、レポーター遺伝子ｅＧＦＰを含むプラスミドｐＭＷ１６８．１で形質転換されたＢ．サチリス３ＮＡで、異なる誘導レジームを用いて実施し、ｅＧＦＰの蛍光シグナルの観察によってオンラインでモニタリングした。発酵培地としては、Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３，９５−１０３に開示されるＥ．コリの高細胞密度発酵用の以下に示されるような公知の培地を使用した。

材料及び方法
一般に、発酵実験のためにも、特に記載がない限りは、標準的な分子的技術を使用した。

光学密度
光学密度（ＯＤ）の測定のために、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣｏｍｐａｎｙのスペクトロフォトメーターＵｌｔｒｏｓｐｅｃ １１００ｐｒｏを、製造元のプロトコールに従って６００ｎｍで使用した。

乾燥バイオマス濃度の測定
乾燥バイオマス濃度ｃ_xの測定のために、Ｏｈａｕｓ ＣｏｍｐａｎｙのモイスチャーメーターＭＢ８３５Ｈａｌｏｇｅｎを使用した。

蛍光の分光測光的な測定
ｅＧＦＰの発現と蛍光のそれぞれを、ＴＥＣＡＮ Ｃｏｍｐａｎｙの多機能リーダーＧＥＮｉｏｓによってリーダーソフトウェアＸ Ｆｌｕｏｒ ４（バージョンＶ４．１１）を使用して以下の測定パラメータで解析した：

発酵器におけるオンライン蛍光測定
発酵の間に、ｅＧＦＰの発現を、蛍光プローブ（Ｍｉｃｒｏｐａｃｋ ＨＰＸ−２０００，Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｘｅｎｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｓ２０００ ｆｉｂｅｒ ｏｐｔｉｃ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用してオンラインでモニタリングした。

測定パラメータは以下の通り：励起フィルタ４８５ｎｍ、発光フィルタ５３５ｎｍ、フィルタ０．６）。記録と記憶のために、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ ＳｐｅｃｔｒａＳｕｉｔｅソフトウェアを使用した。

蛍光は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示される。４．０００ＲＦＵが得られる直前に、５０ｍｓの積分時間を、２５ｍｓに変更し、次いで１０ｍｓに変更した。これらの場合に、測定値を、それぞれ２倍及び５倍に乗算した。

前培養の培養
１つのシングルコロニーをＬＢ寒天プレート上に置き、０．０２％（ｗ／ｖ）のカザミノ酸（ＣＡ）と抗生物質を含む５ｍｌのＳｐｉｚｉｚｅｎｓの最少培地（ＳＭＭ）中で一晩培養した。１ｍｌのオーバーナイト培養を、０．０２％（ｗ／ｖ）のＣＡと抗生物質を有する２０ｍｌのＳＭＭに添加し、そして２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で３７℃で５〜６時間インキュベートした（前培養１）。

１０ｍｌの前培養１を、５ｇ／ｌのグルコースを含む２００ｍｌのバッチ培地に添加し、そして１ｌのエルレンマイヤーフラスコ中で３７℃で８時間までインキュベートした（前培養２）。

発酵器の接種のために、１．２〜２．２のＯＤ₆₀₀を有する前培養２を使用した。

発酵
一般に、発酵は、Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３，９５−１０３の原理に従って実施した。

炭素源のグルコースが完全に消費されたらすぐに、回分様式を流加様式に切り換えた。

流加段階において指数的に供給溶液を添加することによって、μ＝０．１０ｈ^-1の一定の増殖速度を得ることができ、そして同時にグルコースによるカタボライト抑制が回避される。それというのも、グルコースは細胞によって直ちに消費されるからである。

タンパク質分析
収穫した細胞の粗製タンパク質抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、以下の組成を有する３％のスタッキングゲル及び１２％の分離ゲルからなるポリアクリルアミドゲルを用いて分析した：

Ｂｉｏｍｅｔｒａ ｃｏｍｐａｎｙのＴｗｉｎ Ｍｉｎｉ ｇｅｌチャンバーを使用した。

変性のために、タンパク質混合物の粗製抽出物１２μｌを、５×ＳＤＳアプリケーションバッファー３μｌと混合し、そしてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｃｏｍｐａｎｙのＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ５４３８で９５℃で５分間にわたりインキュベートした。室温に冷却した後に、試料を遠心分離によって分離し、完全にゲルに載せた。

スタッキングゲル中での分離の間に電流は１０ｍＡであり、ブロモフェノールの最前線がスタッキングゲルに達した後に２０ｍＡに高めた。１×ＳＤＳランニングバッファー及びＲｏｔｈ ｃｏｍｐａｎｙの長さスタンダードＲＯＴＩ（Ｃ）−Ｍａｒｋを分離のために使用した。電気泳動は、ブロモフェノールの最前線がゲルの外に出て行ったらすぐに終了させた。明確なタンパク質バンドの検出のために、ゲルをクーマシーブルー染色溶液と一緒に室温で３０分にわたりインキュベートし、引き続き室温で更に３０分にわたって脱色溶液で処理した。残りの帯青色のバックグラウンドをゲルから取り除くために、ゲルを７．５％酢酸中で数時間にわたりインキュベートした。

バッファー溶液の組成及び染色溶液並びに脱色溶液の組成は以下の通りであった：

ＴＲＩＳ： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＳＤＳ： ドデシル硫酸ナトリウム
ＡＰＳ： 過硫酸アンモニウム
ＴＥＭＥＤ： Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン
ＥＤＴＡ： エチレンジアミン四酢酸

遺伝子発現の誘導
遺伝子発現の誘導のために、インデューサー溶液の様々な様式の添加（誘導レジーム）を評価した：
１． 所定の時点での単一部での添加（インパクト誘導）
２． インパクト誘導と、ある時間インターバルにわたる更なる誘導との組み合わせ、その際、
− 更なる添加は、一定速度で段階的に増加する量で、又は
− 更なる添加は、指数関数的に増加する速度で
３． 所定の細胞密度に達した後にインデューサー溶液の添加の開始

第２表： 使用される培地

^* 別個にオートクレーブされるべき

ｐＨは、２ＭのＮａＯＨと１ＭのＨＣｌ溶液のそれぞれで調整した。寒天プレートのために、ＢＤ ｃｏｍｐａｎｙ社製の１５ｇ／ｌのＥｕｒｏａｇａｒを更に添加した。全ての培地を１２１℃で約３０分間にわたりオートクレーブにかけた。

発酵行程１： インパクト誘導
発酵行程１を、３０ｌのリアクター（ＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇのＤ５９８及びＤ５９６）中で実施した。回分容量は８ｌであった。ＯＤ₆₀₀に応じて、２００〜４００ｍｌの前培養２を接種して、０．１の開始ＯＤ₆₀₀に調整した。

回分段階の間に、温度を３０℃で一晩であり、１２時間後に３７℃に高めた。２４％（ｖ／ｖ）のＮＨ₄ＯＨの添加によって、全発酵の間、ｐＨを約７．０に調整した。エアレーション速度は、３０ｌ／分までに調整できた。回分段階の開始時に、エアレーション速度は、１０ｌ／分であった。

供給培地Ｉ及びＩＩの組成は、第３表で以下のように示される。

第３表： 供給培地Ｉ及びＩＩの組成

培地Ｉ及びＩＩを、それらの全容量との割合で、すなわち４．２：１．０で添加した（全供給Ｆの８０．８％の培地Ｉ及び１９．２％の培地ＩＩに相当する）。

流加段階の開始時の誘導のために、０．２％（ｗ／ｖ）のＤ−マンノース溶液を一回で添加した。

乾燥バイオマス濃度及びモニタリングされた蛍光シグナルは、図１１ａ及び図１１ｂのそれぞれに示されている。

該図面において、乾燥バイオマスの濃度ｃ_xが、培養の期間にわたって対数的にプロットされている。回分段階と流加段階とは、垂線によって分離されている。

５３５ｎｍの発光波長でのモニタリングされた蛍光シグナルは、培養期間にわたってプロットされている。矢印は、誘導の時点を示している。

図１１ａの結果から、最大乾燥バイオマス（ＤＭ）濃度８２．７５ｇのＤＭ／ｌが得られ、それは１１．７ｌの反応容量に対して約９７０ｇのＤＭに相当する。

全体で７１．５ｇのインデューサーのＤ−マンノースは、最初の添加において１６ｇで消費された。

比増殖速度μは、全流加段階の間に０．１０ｈ^-1であった。

図１１ｂに示されるように、Ｄ−マンノースの最初の添加の後に、流加段階の最初の５時間以内で約２，２００のＲＦＵの最大値まで蛍光シグナルは大きく増大した。次いで、該シグナルは連続的に減少した。この発現速度の低下は、インデューサーの消費によるもの及び／又は細胞質量の増加による遮蔽効果によるものであると推測される。３７時間後の更なる０．５％（ｗ／ｖ）のマンノース溶液の添加は、蛍光シグナルの新たな増加を２，１００ＲＦＵの値にまでもたらした。

発酵行程２： 一定速度との組み合わされた誘導
発酵行程１と同様の手順を繰り返すが、インデューサーの添加の様式を変更した。発酵行程１と同様に、０．２％（ｗ／ｖ）のＤ−マンノース溶液を単一部で流加段階の開始時点に添加した。インデューサーの第二部の添加は、発酵行程１の蛍光シグナルの曲線の転換点の１，５００のＲＦＵに達したらすぐに開始した。

第二の添加工程の間に、２０％（ｗ／ｖ）のマンノース溶液を、一定の速度で、平均速度０．３９ｇ／分で段階的に増加する量で、第二部の全てが添加されるまで添加した。

それらの結果は、図１２ａ及び図１２ｂに示されており、それは、乾燥バイオマス濃度と蛍光シグナルの曲線を示しており、その際、表示は、図１１ａ及び図１１ｂのものと同じである。図１２ｂにおいては、第一部の添加の時点と、第二部の添加の開始と終わりが、矢印によって示されている。

図１２ａから結論されるように、乾燥バイオマスの最大濃度は、６７．６ｇＤＭ／ｌであり、それは、１１．９ｌの反応容量に基づいて約８０４ｇのＤＭに相当する。全体で（第一の添加と第二の添加）、７０ｇのＤ−マンノースを添加した。バイオマスの収率は、発酵行程１と比較して１７％だけ低下した。これは、流加段階の間の低い比増殖速度μ＝０．０９ｈ^-1と相関するが、回分段階の間の比増殖速度は、０．４３ｈ^-1であった。

図１２ｂから結論されるように、蛍光シグナルの最大値は、２５時間後に約４，９００ＲＦＵで到達し、連続的に約２５００ＲＦＵに減少した。

発酵行程１と比較して、発酵行程２においては、発現速度は、バイオマス濃度の僅かな低下に伴い１２０％だけ高めることができた。

発酵行程３及び４： 指数関数的速度と組み合わされた誘導
３．７ｌの小さい研究室用の発酵器（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙの小さい研究室用発酵器）を、発酵行程３及び４で使用した。回分容量（バッチ培地と接種物とを足したもの）は、全体で１．５ｌであった。ＯＤ₆₀₀に応じて、１００〜２００ｍｌの前培養２を接種して、約０．１に開始ＯＤ₆₀₀を調整した。回分段階と流加段階の両方の温度は、３７℃であった。発酵の間に、ｐＨを、２４％（ｖ／ｖ）のＮＨ₄ＯＨによって７．０に調整した。エアレーション速度は、発酵の間に一定で２ｌ／分であった。酸素導入は、撹拌機の回転速度によって調整した。発酵圧力は開始時に１．３バールであり、次いで必要に応じて酸素導入を高めるために１．５バールに高めた。炭素源であるグルコースの完全な消費の後に、回分運転を流加運転に切り換えた。

発酵行程２とは異なり、発酵行程３及び４においては、インデューサー溶液は、指数関数的に増大させた速度で供給した。更に、グルコース含有培地Ｉを、インデューサー含有培地ＩＩと一緒に同時供給した。供給培地Ｉ及びＩＩの組成は、第４表で以下のように示される：
第４表： 供給培地Ｉ及びＩＩの組成

培地Ｉ及びＩＩの全ての成分は、個別にオートクレーブにかけ、成分の溶解性のため、ｐＨ値は、８５％（ｖ／ｖ）のＨ₃ＰＯ₄を用いて両方の培地において３．３に調整した。

時間ｔにおける全供給Ｆは、以下の式：

［式中、
ｍは、維持係数・（０．０４ｇ ｇ^-1 Ｈ^-1）であり、
Ｙ_x/sは、基質に関連したバイオマスの比収率係数（グルコースについては０．５）であり、
Ｃ_x0は、流加段階の開始時のバイオマス濃度であり、
Ｖ₀は、流加段階の開始時のリアクター容量（＝回分容量）であり、
Ｃ_s0は、供給溶液におけるグルコース濃度である］によって計算した。

計算のために、Ｄ−マンノースは、Ｂ．サチリスによって、匹敵する収率係数Ｙ_x/sのグルコースで消費されると仮定した。

ＫＬＦにおいて、培地Ｉ及びＩＩを別個に供給し、割合比率を変更できた。

ａ） 発酵行程３
バイオマス濃度及びモニタリングされた蛍光シグナルは、図１３ａ及び１３ｂに示されており、その際、図面の表示は、発酵行程１と同じである。

流加段階の開始時に、０．２％（ｗ／ｖ）のマンノース溶液の部分（全体で１６ｇのマンノース）を添加し、そして培地Ｉ及びＩＩの指数関数的供給を、５０：５０の比率で開始した（インターバルＩ）。傾斜の減少において、マンノース含有培地ＩＩの部分が６０％まで高められ、そして全体の供給Ｆ（培地Ｉ及びＩＩ）は、グルコースを基礎とする増殖を維持するために１２５％まで高められた（インターバルＩＩ）。約２時間後に、再び傾斜の低下がモニタリングされ、そして培地ＩＩの部分が６６．６％にまで増大し、同時に全体の供給Ｆが１５０％にまで高まった（インターバルＩＩＩ）。培地ＩＩの全体の消費の後に、発酵を、供給培地Ｉを用いて１００％の全供給で継続した（図１０に示さず）。

発酵行程３の進行とデータを、以下に第５表でまとめる：
第５表：

全体で５０ｇのマンノースが添加された。

１２時間の時点と、２０時間の時点と、２４時間の時点のそれぞれで、試料を採取し、全体で１０のＯＤ₆₀₀の細胞の可溶性タンパク質フラクションを基礎としてＳＤＳゲルでの発現を解析した。

得られたＳＤＳページは、図１９に示されている。

左から、（Ｍ）は長さスタンダード（ＲＯＴＩ（登録商標）−Ｍａｒｋ）を示し、（１）は、１２時間後の非誘導を示し、（２）は２０時間後の８時間の誘導を示し、（３）は２４時間後の１２時間の誘導を示す。２０時間後と２４時間後に、約２７ｋＤａにｅＧＦＰの発現を示す（矢印）明らかなレーンが現れる。

ｂ） 発酵行程４
発酵行程３と同じ手順を繰り返すが、培地ＩＩ（マンノース）の供給容量を全体で１．０ｌにまで高めた。

乾燥バイオマス濃度及び蛍光シグナルは、図１４ａ及び１２ｂに示されており、その際、表示は、発酵行程１と同じである。進行とデータは、以下の第６表にまとめられている：
第６表：

全体で２００ｇのマンノースが添加された。

約１５時間の発酵期間の後に観察される窒素不足を補うために、（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄を一定速度で追加供給した。インターバルＩＩにおいて、１００００の最大ＲＦＵに達し、それはインターバルＩＩの期間内に７８００ＲＦＵに低下した。

ａ） 発酵行程５及び６： インパクト誘導なし
両方の発酵は、３０ｌの発酵器中で実施した。

両方の発酵行程において、細胞を高細胞密度までグルコースの供給速度を指数関数的に増大させつつ増殖させ、高細胞密度に達した後に、それをマンノースの一定供給に置き換えた。

使用される供給培地Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩを、以下の第７表に示す：
第７表：

発酵行程５
培地Ｉ及びＩＩを、それらの全体容量に対する割合４．２：１．０で指数関数的に増大する速度で添加した。高細胞密度に達したら、培地Ｉ及びＩＩから構成される供給物を、培地ＩＩ及びＩＩＩから構成される供給物によって２０：８０の割合比率で、培地Ｉ及びＩＩの最後の指数関数的な供給速度の容量に相当する一定容量で置き換えた。

蛍光シグナルは、図１５に示されており、その際、表示は、発酵行程１と同じである。

約１７時間の発酵期間の後の図１５における蛍光シグナルの最小の増加は、培地ＩＩＩの短期間漏洩によるものであったと推測される。

発酵行程５の進行とデータを、以下に第８表でまとめる：
第８表：

ｂ） 発酵行程６
発酵行程５と同じ手順を繰り返したが、全体で６００ｇのマンノースを０．２（ｗ／ｖ）マンノース溶液（全体で１６ｇのマンノース）のインパクト誘導で添加し、それから高細胞密度に達したら培地ＩＩ及びＩＩＩから構成される供給物の一定の添加を行った。

蛍光シグナルは、図１６に示されており、その際、表示は、発酵行程１と同じである。

発酵行程６の進行とデータを、以下に第９表でまとめる：
第９表：

発酵行程１〜６の評価
最大蛍光の時点での評価のために、乾燥バイオマス濃度ｃ_x、反応器容量Ｖ_R、消費されたマンノース及び誘導開始からの期間を測定し、以下の第１０表にまとめた。

第１０表：

各発酵行程についての第１０表に示されるプロセスデータに基づき、１リットル及び１時間当たりの最大蛍光ＲＦＵに関する生産性を計算した。更に、発現効率を、絶対バイオマス（ｇＤＭ）とインデューサー濃度（ｇｍａｎ／Ｌ）を基礎として最大蛍光から計算された相対蛍光として表現した。それらの結果を、以下の第１１表に示す：
第１１表：

これらの結果は、明らかに、マンノースプロモーターを有するプラスミドを使用した本発明は、高細胞密度発酵法で効率的に使用でき、かつインデューサーであるＤ−マンノースの添加によるポジティブに制御される発現において効率的に使用できることを示している。

更に、誘導レジームの選択によって、発酵の焦点は、必要に応じて、バイオマス、発現産物及びインデューサー消費のそれぞれの観点で出力を最大にするように変更してよい。

下流のプロセシングの促進の点で、インパクト誘導と指数関数的供給が組み合わされた発酵行程３による誘導レジームが特に好ましい。

ここでは、バイオマスに対して高い生成された発現産物は、精製工程などの更なる処理をより効率的にし、こうして時間と費用が削減される。

Claims (21)

1. バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のマンノースオペロンのマンノースで誘導可能なプロモーターを含み、
   該プロモーターがポリペプチドをコードする異種の核酸配列を含む転写ユニットに作動的に連結されており、かつｍａｎＰプロモーターであるか、又はｍａｎＲプロモーターである、
   原核性の宿主細胞において発現可能なベクター。
2. 調節遺伝子ｍａｎＲの完全な配列又は部分的な配列を含む、請求項１に記載のベクター。
3. ｍａｎＰプロモーターが、配列番号１及び配列番号２から選択される配列又はそれらに相補的な配列を含む、請求項１または２に記載のベクター。
4. ｍａｎＲプロモーターが、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から選択される配列又はそれらに相補的な配列を含む、請求項１に記載のベクター。
5. 異種の核酸配列の上流にカタボライト応答エレメントを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載のベクター。
6. 転写終結配列を含み、それが異種の核酸配列から下流に位置している、請求項１から５までのいずれか１項に記載のベクター。
7. 転写終結配列が、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｔｕｆＡ遺伝子の３′領域から得られる、請求項６に記載のベクター。
8. エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で複製可能なシャトルベクターである、請求項１から７までのいずれか１項に記載のベクター。
9. プラスミドｐＵＣ１８及び／又はｐＢＳ７２レプリコン又はｒｅｐ遺伝子の複製起点と一緒に、プラスミドｐＵＢ１１０の複製起点を含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載のベクター。
10. 異種の核酸配列が、抗体又はそのフラグメントをコードする、請求項１から９までのいずれか１項に記載のベクター。
11. ｍａｎＰ遺伝子又はｍａｎＲ遺伝子の転写開始領域が、別の遺伝子の転写開始領域によって置き換えられている、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のベクター。
12. ｍａｎＰ遺伝子又はｍａｎＲ遺伝子の転写開始領域が、ｔｕｆＡ遺伝子又はｇｓｉＢ遺伝子の転写開始領域によって置き換えられている、請求項１１に記載のベクター。
13. バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のマンノースオペロンのマンノースで誘導可能なプロモーター領域の単離され精製された核酸またはそれらに相補的な核酸であって、該プロモーター領域がｍａｎＰプロモーターであるかまたはｍａｎＲプロモーターである、前記核酸。
14. 前記核酸が、配列番号１から５のいずれからなるか、又はそれらに相補的な配列からなる、請求項１３に記載の単離され精製された核酸。
15. 請求項１から１２までのいずれか１項に記載のベクター又は請求項１３又は１４に記載の核酸で形質転換された原核性の宿主細胞。
16. 原核性の宿主細胞が、炭素カタボライト抑制の支配下にあり、かつホスホエノールピルビン酸：炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系を含む、請求項１５に記載の原核性の宿主細胞。
17. 原核性の宿主細胞が、グラム陽性である、請求項１５又は１６に記載の原核性の宿主細胞。
18. 宿主細胞が、ファーミキューテス門に属する、請求項１６又は１７に記載の原核性の宿主細胞。
19. 原核性の宿主細胞においてポリペプチドを生産する方法であって、請求項１から１２までのいずれか１項に記載のベクターを構築する工程と、前記ベクターで原核性の宿主細胞を形質転換する工程と、好適な条件下で細胞培養培地中で前記形質転換された宿主細胞を増殖させることによって前記ポリペプチドを発現させる工程と、前記細胞又は細胞培養からポリペプチドを回収する工程とを含む前記方法。
20. 宿主細胞を、まずインデューサーとは異なる炭素源の存在下で増殖させ、次いで第二工程で、インデューサーの存在下で増殖させる、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１から１２までのいずれか１項に記載のベクター又は請求項１３及び１４のいずれかに記載の単離され精製された核酸を、原核性の宿主細胞におけるポリペプチドをコードする異種の核酸の調節された発現のために用いる使用。

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