CN103937767B - 一种半乳糖苷酶和编码这种酶的多核苷酸 - Google Patents

一种半乳糖苷酶和编码这种酶的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一个克隆自大理洱源65℃热泉宏基因组的β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷酶，EC？3.2.1.23)和编码这种酶的核苷酸，该半乳糖苷酶在37-55℃具有较高的催化活性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，另外该酶还具有转糖苷作用，能生成一些功能性的低聚糖，如低聚半乳糖。低聚糖几乎不被小肠消化，是一种低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纤维；低聚半乳糖作为肠道内双歧杆菌的增值因子，只能被双歧杆菌所利用，增殖的双歧杆菌竞争性地拮抗腐败菌的生长，减少毒素和酶的产生，有整肠效果。

Description

一种半乳糖苷酶和编码这种酶的多核苷酸
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种克隆于大理洱源热泉宏基因组的β-半乳糖苷酶，以及编码此酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法和应用。
背景技术
猪的乳汁中含有约3~5％的乳糖，当乳猪仔小肠粘膜绒毛β-半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足时会发生乳糖消化不良，未分解吸收的乳糖进入结肠后，被肠道存在的细菌发酵成为小分子的有机酸如醋酸、丙酸、丁酸等，并产生一些气体如甲烷、H2、CO2等，这些产物大部分可被结肠重吸收，而未被吸收者或仍未被分解的乳糖可引起肠鸣、腹胀、腹痛、排气、腹泻等症状，长期如此并会严重影响乳猪仔的生长。
豆粕是畜禽饲料中常用的植物蛋白原料，而豆粕中含有较高的乳糖，饲料中的乳糖消化不良同样会引起腹胀和腹泻等症状。β-半乳糖苷酶（β-D-半乳糖苷酶，EC.3.2.1.23）又名乳糖酶，是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，可作为乳糖降解和双糖合成的催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，具有治疗乳猪仔腹泻和提高饲料利用效率的作用。早在50年代初Aronson和Pazur就报道了此酶的转糖苷活性，乳糖酶转糖苷作用生成低聚半乳糖等功能糖。这种转移反应的产物是双糖、三糖和分子再大一些的低聚糖，是有多重组分构成的混合体系。我们所说的低聚半乳糖是以高浓度乳糖作为β-半乳糖苷酶的底物而生成的，是在乳糖分子的半乳糖残基上以β键接上1~4个半乳糖而形成的杂低聚糖。低聚糖几乎不被小肠消化，是一种低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纤维，只能被双歧杆菌所利用，双歧杆菌是肠内最有代表性的有益菌，它能调节和恢复肠道内微生态菌群的平衡、抑制肠内有害菌及病原菌的繁殖、促进肠蠕动、防治便秘及下痢、增进矿物的吸收和维生素的合成、提高机体抗病免疫功能等。功能糖是双歧杆菌、乳酸杆菌最直接、最有效的养料，它能排除消化系干扰，选择性地进入到双歧杆菌、乳酸杆菌最适宜生长的大肠，促使双歧杆菌快速生长和大量繁殖，增强机体免疫力的作用。由于微生物的快速生长和高效代谢的生物学特性，使其成为工业化酶制剂的主要来源。
发明内容
本发明旨在提供一种高温β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，本半乳糖苷酶来源于大理洱源热泉宏基因组。
本发明的另一个目的是提供含有编码β-半乳糖苷酶的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
本发明还提供一种重组载体，其含有编码β-半乳糖苷酶的多核苷酸，且其是由多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成。
本发明的有益效果如下：
本发明获得的β-半乳糖苷酶，该半乳糖苷酶在37-55℃具有较高的催化活性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，能有效治疗乳猪小肠粘膜绒毛β-半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足发生乳糖消化不良引起的腹泻，具有治疗乳猪仔腹泻和提高饲料利用效率的作用；另外该酶还具有转糖苷作用，在高浓度的乳糖作为底物时，该酶的转糖苷作用能催化一种功能低聚糖---低聚半乳糖的生成，低聚半乳糖作为肠道内双歧杆菌的增值因子，只能被双歧杆菌所利用，增殖的双歧杆菌竞争性地拮抗腐败菌（入产气荚膜梭菌）的生长，减少毒素和酶的产生，有整肠效果。
附图说明
图1为本发明β-半乳糖苷酶基因的克隆片段；
图2为本发明β-半乳糖苷酶基因保守结构域分析示意图；
图3为本发明β-半乳糖苷酶基因与表达质粒连接菌落PCR检测，图中：M为Marker，泳道1~8皆为转化后挑取的8个转化子；
图4为本发明构建成功的重组质粒双酶切图谱，图中：M为marker，泳道1~3为三个构建好的重组质粒；
图5为本发明β-半乳糖苷酶基因表达蛋白的SDS-PAGE分析检测电泳图，其分子量约为92000道尔顿，图中：M为ProteinMarker，泳道1为pET32a-GAL/Rosetta诱导前破碎上清，泳道2为pET32a-GAL/Rosetta诱导后破碎上清，泳道3为pET32a-GAL/Rosetta诱导后破碎上清过柱透过液，泳道4为30mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道5为50mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道6为80mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道7为150mM咪唑缓冲液过柱第一管，泳道8为300mM咪唑缓冲液过柱第一管；
图6为本发明温度对β-半乳糖苷酶活性的影响结果示意图；
图7为本发明β-半乳糖苷酶对温度的稳定性结果示意图；
图8为本发明pH对β-半乳糖苷酶活性的影响结果示意图；
图9为本发明β-半乳糖苷酶对pH的稳定性结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：β-半乳糖苷酶的克隆和表达
一、半乳糖苷酶的克隆表达
1、样品宏基因组DNA提取
（1）样品预处理
将65℃温泉的泥水样充分振荡，是泥水混合均匀，取30ml样品于500g离心5min，使样品中的大部分泥沙沉淀，去除沉淀的泥沙，再次将剩余的溶液于1000g离心10min，弃沉淀，目的在于进一步去除样品中携带的较为细小的杂质，最后将含有菌体的悬液于5000g离心10min，弃上清并收集沉淀的菌体。
（2）宏基因组DNA提取：采用Qiaampdnaminikit试剂盒提取DNA，方法参照试剂盒说明进行；
①用适量的TEbuffer（20mMTris-HCl、2mMEDTA、pH7.6）和ATL缓冲液悬浮菌体，使菌悬液总体积约180μL，再加入20μL浓度为20mg/ml的Lysozyme溶液，37℃孵育至少30min；
②加入20μLproteinaseK和200μl缓冲液AL，漩涡震荡混匀，56℃孵育30min，70℃孵育10min；
③加入200μL无水乙醇（96-100％）到样品中，轻摇混合15秒。混合后，短暂离心；（缓冲液AL，和乙醇充分混合，以得到均匀的溶液）。
④加入无水乙醇后，可能出现白色沉淀，将沉淀和液体全加入QIAamp吸附柱中，再将QIAamp吸附柱放入干净的2ml收集管中，8000rpm离心1min,，弃收集管中的滤液；
⑤向QIAamp吸附柱中加入500μLAW1缓冲液（尽量不要沾到管壁），8000rpm离心1min，弃滤液；
⑥向QIAamp吸附柱中加入500μLAW2缓冲液，14000rpm离心3min；
⑦将QIAamp吸附柱放入EP管，14000rpm离心1min，充分去除AW2缓冲液；
⑧将QIAamp吸附柱放入新的EP管中,加入100~150μLAE缓冲液，在室温静置2min，8000rpm离心1min收集总DNA；基因组DNA冻存于﹣80℃。
2、半乳糖苷酶基因的扩增（以宏基因组DNA为模板）
（1）半乳糖苷酶基因的扩增所用引物序列如下：
正向引物：5’-CGCGGATCCATGGGCAAGCAAGATTGGTA-3’
反向引物：5’-CCGGAATTCGTGCATAATATAAGATATA-3’
（2）扩增体系如下：
表1：扩增反应体系组分
（3）扩增条件如下：
将反应体系混匀，先在94℃预变性5min，然后在94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min。反应完后取产物2ml，在10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳分析（图1）。
3、PCR产物的胶回收纯化
①在电泳仪中灌制1.0％琼脂糖凝胶；
②将待分离纯化的PCR产物点样电泳，于适当位置停止电泳；
③在紫外灯下切下含该目的片断的凝胶，转移到1.5ml的Ep管中；
④用北京百泰克生物技术有限公司多功能DNA纯化试剂盒进行目的片段的回收，回收方法按说明书进行操作。
将基因序列提交NCBI数据库ConservedDomainDatabase蛋白质保守序列分析软件进行分析，β-半乳糖苷酶分析结果见图2。
4、重组表达载体的构建
为了把目的基因片断连接到表达载体pET32a，就需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点。
（1）脱氧尿苷焦磷酸酶基因片段的酶切鉴定
①酶切体系如下：
表2：反应体系组分
②酶切条件：37℃，3h，回收半乳糖苷酸基因片段。
（2）带有粘性末端线性载体pET32a的制备
为了将目的基因片断连接到表达载体pET32a上，就需要使目的片断带有粘性末端的片断，即带有酶切位点。同样，为了使目的片断能插入载体中，也需要使载体带有粘性末端，并且使它们的酶切位点相同。
A、质粒抽提：用北京索莱宝生物公司的小量质粒抽提试剂盒，操作步骤如下：
①菌种活化：无菌接种环蘸取-80℃冻存的菌种保存液，三线法接种于氨苄LB平板，37℃培养12-16小时；
②增菌并收集菌体：取氨苄青霉素5μl(终浓度100μg/ml)加入5mlLB培养基中；用接种环挑取阳性克隆，接种于Amp+-LB培养基中；然后放入37℃培养箱中，摇床培养，过夜。并将培养的菌液加入到5ml的离心管中，室温离心5min，5000rpm，使菌体沉淀，弃上清液；
③在离心管中加溶液Ⅰ（含RNA酶）250μl，振荡至菌体彻底悬浮，转入1.5ml的EP管中；
④在EP管加入溶液Ⅱ250μl，轻轻混匀，使溶液Ⅰ的RNA酶消化细菌中RNA；
⑤加入溶液Ⅲ350μl，温和混匀，12000rpm离心10min；
将上清液转入DNA吸附柱中，室温放置2min，混匀，12000rpm离心1min，弃收集管中废液；
⑦加入700μl漂洗液于吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液（重复一次）；
⑧室温13000rpm，2min再离心一次，吸附柱敞口放置数分钟，以去除残存的漂洗液；
⑨将吸附柱移入新的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入70μl在65℃预热的洗脱液，室温放置1min，然后12000rpm室温离心2min，再重复一次以提高回收率；将所得到的质粒取1μl电泳分析。
B、质粒pET32a酶切鉴定
酶切体系如下：
表3：反应体系组分
②反应条件：37℃，4h。
（3）重组表达载体的构建、半乳糖苷酶（GAL）的诱导表达和纯化
①将前面实验得到的带有粘性末端的线性载体pET32a和半乳糖苷酶（GAL）基因片段，通过连接转化并用菌落PCR（图3）、酶切鉴定（图4）及测序验证，即可得到重组表达载体。
②半乳糖苷酶（GAL）在大肠杆菌中的诱导表达
将构建好的重组载体RO-GAL-32a转化大肠杆菌E.ColiRosetta，含重组质粒的菌株经培养过夜，菌液按1%比例接种到30mlAmp+-LB(氨苄青霉素终浓度100μg/ml)培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.8；取出4ml菌液用作对照实验；其余菌液加入诱导剂IPTG（终浓度100μg/ml)放入37℃，80rpm摇床培养诱导表达8小时。
5、半乳糖苷酶蛋白SDS-PAGE检测
从步骤3（3）-②中的样品中取出少量诱导后菌液测OD值，根据菌液OD值不同取不同的菌液量，使其菌体量相等，5000rpm，离心10min，弃上清；加入80μl双蒸水，20μl5×上样缓冲液，振荡使菌体散开后；在98℃下放置10min，使菌体裂解，释放蛋白质；取诱导表达后的菌液，制备样品；将样品上样于电泳仪中在120V，80mA，电泳2h后，加入100mlR250考马斯亮蓝染色液染色，摇床振荡，100rpm，30min后；将染色液倒出，用清水漂洗，再加入适量脱色液100rpm，10h，最后用扫描仪扫描凝胶，检测蛋白表达情况（图5）。
6、半乳糖苷酶蛋白的纯化
利用上述方法大量诱导含重组质粒RO-dUTP-32a的BL21菌株，菌液经离心收集大肠杆菌菌体(4oC，5,000g，10min)。菌体悬浮于适量（使菌悬液的OD600达到20）缓冲液A[20mM磷酸钠，500mMNaCl，30mM咪唑，pH7.4]中，冰上超声破碎细胞，4℃，20,000g离心10min，上清用镍柱进行手工纯化，先用10倍柱体积ddH2O清洗柱子，再用10倍柱体积30mM咪唑平衡柱子，样品上柱，用10倍柱体积30mM咪唑洗脱柱子，然后用10倍柱体积150mM咪唑洗脱柱子，再用10倍柱体积500mM咪唑洗脱柱子，用10倍柱体积ddH2O清洗柱子，最后用20%无水乙醇填充柱子，用缓冲液（50mMTris-HCl，pH7.4）透析过夜，纯化的重组蛋白组分进行SDS-PAGE。
实施例2：半乳糖苷酶的活性分析方法及部分酶学性质
1、半乳糖苷酶（GAL）酶学性质及酶活性探索
将底物邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）用磷酸缓冲液（NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.27g，定容至1L，pH7.4）配成浓度为20mmol的溶液，取10μl酶液加入2mlONPG溶液，37℃水浴30min后立即取出置于冰水中冷却，同时加入4ml0.5M/L的Na2CO3溶液终止反应。空白样为向2mlONPG溶液中加入10μl经高温失活的粗酶液，37℃水浴30min后立即取出置于冰水中冷却，同时加入4ml0.5M/L的Na2CO3溶液，测定405nm处吸光度。
2、半乳糖苷酶最适反应温度
取粗酶液20μl与2ml20mmol/L的ONPG底物溶液混合，分别置于37℃、45℃、55℃、60℃、65℃、70℃中水浴30min，然后立即加入3ml0.5M/LNa2CO3溶液来终止反应，于405nm处测定OD值，测定三次取平均值，空白样为加入等量的失活后的酶液，其余相同，结果见图6。
2、半乳糖苷酶对温度的稳定性
取粗酶液20μl，分别置于50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃水浴15min，取出立即加入底物溶液2ml，然后于55℃中水浴30min，用3ml0.5M/LNa2CO3溶液来终止反应，于405nm处测吸光值，对照组为不经预处理的等量酶液，直接在55℃中反应30min，结果见图7。
3、半乳糖苷酶最适pH
用不同pH（pH3~10）的Tris-HCl缓冲液和磷酸缓冲液配制浓度为20mmol的ONPG溶液，各取2ml底物溶液于20μl酶液于55℃水浴锅中反应30min，用3ml0.5M/LNa2CO3溶液来终止反应，于405nm处测吸光值，结果见图8。
4、半乳糖苷酶对pH的稳定性
取不同pH的Tris-HCl缓冲液各500μl，向不同pH的缓冲液中分别加入酶液30μl，室温处理1h，调节各体系pH7.5，分别加入2mlONPG溶液，55℃水浴30min后立即取出置于冰水中冷却，同时加入4ml0.5M/L的Na2CO3溶液，测定405nm处吸光度，结果见图9。
5、金属离子对半乳糖苷酶活性的影响
将金属离子（Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+）及表面活性剂EDTA分别加入到β-半乳糖苷酶的反应体系中，使金属离子终浓度为2mmol/L，表面活性剂终浓度为1mmol/L，在55℃下按正常酶活体系测定酶活力。以未处理酶液的酶活力为100%计算相对酶活力，重复3次取平均值。为了排除阴离子影响，除Ca2+的阴离子为Cl－，其余为SO4 2－。将各体系于55℃中水浴30min，终止反应并测405nm处吸光值，结果见表1
表1不同金属离子及表面活性剂对β-半乳糖苷酶活性的影响
序列表
<110>昆明理工大学
<120>一种半乳糖苷酶和编码这种酶的多核苷酸
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>667
<212>PRT
<213>热泉宏基因组
<400>1
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PheLeuLysAlaLysGluMetGlyLeuAsnLeuLeuArgPheHisValLysIleProAsp
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661
<210>2
<211>2001
<212>DNA
<213>热泉宏基因组
<400>2
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ctctccaagacttgaaaactataagatgcgatattgaattttcagataac150
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caaaactttggtctttggattctccacaaatgtatacggccatagttgat300
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acactgaaaaattgtcagttatcgaggttgattatatcttatattatgca2000
c2001
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cgcggatccatgggcaagcaagattggta29
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ccggaattcgtgcataatataagatata28

Claims (2)

1.一种半乳糖苷酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.一种编码权利要求1所述半乳糖苷酶的多核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
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