CN101368164A - 一种结合胆盐水解酶基因和包括该基因的干酪乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从酸马奶中分离的耐酸和耐胆盐型干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)，该菌菌株的保藏号为：CGMCC No.1697。本发明还提供了从所述干酪乳杆菌中分离的耐胆盐基因，该基因是结合胆盐水解酶基因，并且对该基因进行了克隆和测序。本发明的干酪乳杆菌可用作食品，特别是乳制品发酵用的生产菌株。本发明的耐胆盐基因可用于乳酸菌益生菌株的筛选和遗传改造。

Description

一种结合胆盐水解酶基因和包括该基因的干酪乳杆菌

技术领域

本发明涉及一种结合胆盐水解酶基因和包括该基因的干酪乳杆菌。

技术背景

胆酸是胆固醇代谢的产物，胆酸与一些氨基化合物结合，就形成了胆汁中的各种胆汁酸，如甘氨胆酸和牛磺胆酸，这些分泌物质从胆道进入十二指肠，胆汁酸在胆汁中一般以钠盐和钾盐的形式存在。胆汁酸在消化道中的大量存在，也就要求生存于这种微环境中的固有菌群具备改变这种混合物结构的能力。通常这些肠道中的固有菌群会产生一种酶类，在这些酶的作用下会发生7α或者7β位的脱羟基，6β位的脱氢作用，结合胆汁酸在到达肠道下部的过程中会被肠道中的微生物分泌的酶类水解为脱结合胆汁酸，也就是通常所说的胆酰甘氨酸水解酶(choloylglycine hydrolase)一族。这些酶类广泛的存在于微生物中，包括拟杆菌属，梭菌属，双岐杆菌属，肠球菌属，乳酸杆菌属中。

胆盐抗性一直被作为益生菌筛选的一个标准。目前对胆盐抗性机制主要存在两种假设：一种假设认为能够水解胆盐的细菌可以将牛磺酸作为电子受体，在厌养条件下获得能量，增强自身对胆盐的抗性；另一种假设认为结合胆盐水解酶将结合胆盐水解后脱结合态的胆汁酸相比结合态的胆汁酸的溶解性降低，进而降低了胆盐对细菌的毒性。在已完成测序工作的乳酸菌的基因组中也发现都有编码结合胆盐水解酶(conjugated bile salt hydrolase，CBSH)基因的存在，如：Lactobacillusjohnsonii NCC 533中含有三个，Lactobacillusplantarum WCFS 1含有四个，Lactobacillus acidphilus NCFM含有两个编码胆盐水解酶的基因。因此胆盐水解酶在微生物面对胆盐的应激时所起的作用成为了研究学者关心的问题。

因此，了解耐胆盐干酪乳杆菌中结合胆盐水解酶基因与其胆盐抗性间的关系，从功能基因的角度分析乳酸菌抗胆盐可能的分子机制，可为今后开展与胆盐的相关研究工作奠定基础。

发明内容

本发明人针对上述课题，以酸马奶中的乳酸菌为目标菌群，采用特定的筛选方法，从内蒙古民族传统乳制品——酸马奶中筛选出耐胆盐菌株，并进一步研究了该耐胆盐菌株中结合胆盐水解酶与其胆盐抗性之间的关系。

本发明的目的之一是提供一种耐胆盐型的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei Zhang)及其筛选方法。

本发明的目的之二是对耐胆盐型干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)中结合胆盐水解酶基因的部分克隆和测序。

本发明的目的之三是通过RT-PCR确定结合胆盐水解酶与干酪乳杆菌胆盐抗性之间的关系。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)已于2006年4月21日，在地址为中国北京市朝阳区大屯路，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏，保藏号：CGMCC No.1697。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种干酪乳杆菌，所述干酪乳杆菌(Lactobacillus caseiZhang)是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆盐的益生菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCCNo.1697。

本发明还提供了从所述干酪乳杆菌中分离的耐胆盐基因，该基因是结合胆盐水解酶基因，并且对该基因进行了克隆和测序。

本发明还提供了一种耐胆盐型干酪乳杆菌菌株的筛选方法，包括：

a.以天然酸马奶为样品，从中分离鉴定得到50株乳杆菌，经过分析鉴定后制成乳杆菌菌液；

b.吸取所述乳杆菌悬浮液10μl接种于5mL pH3.5的MRS液体培养基中，置于37℃条件下进行24小时培养，同时吸取乳杆菌悬浮液1.0mL与9.0mLpH3.0的人工胃液混合后，置于37℃条件下培养，分别在培养开始时间0小时和培养3小时后取样，用BCP琼脂培养基倾注培养测定活菌数；

c.将筛选出的乳杆菌培养液经离心收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将其菌体悬浮于5mL灭菌生理盐水中制成菌悬液，将乳杆菌菌悬液分别接种于含9mL过滤除菌处理的pH2.0、pH3.0和pH4.0的人工胃酸试管中各1mL，充分混匀后放置于37℃恒温箱保温，并在实验开始时间和保温1小时、2小时、3小时后分别取样，测定其活菌数；

d.无菌吸取1mL处理3小时后的不同pH值含菌人工胃液，分别接种于9mL过滤除菌的pH8.0的人工肠液中，继续置37℃恒温箱厌氧培养并分别在开始时间和培养3小时、6小时、24小时后，分别测定活菌数；

e.将各供试乳杆菌，分别按2％(v/v)接种于10％灭菌脱脂乳中，37℃培养16小时制成单菌发酵乳，分别吸取1mL接种于pH1.2、pH2.0、pH3.0、pH4.0和pH5.0的9mL过滤除菌的人工胃液中，充分混匀放置于37℃恒温箱保温，在实验开始和保温1小时、2小时、3小时后分别取样，测定其活菌数，然后无菌吸取1mL处理3小时后的不同pH值含菌人工胃液，分别接种于9mL过滤除菌的pH8.0的人工肠液中，继续置37℃恒温箱厌氧培养，分别在开始时间和培养3小时、6小时、24小时后测定各个时段的活菌数；

f.选用对人工消化液耐受性较好的乳杆菌进行实验，采用Walker和Gilliland(1993)方法测定胆盐对菌株生长的影响，即将MRS液体培养基活化的乳杆菌按1％分别接种于含胆盐的MRS液体培养基中(培养基中添加0.2％巯基乙酸钠，0.3％牛胆盐)和不含胆盐的MRS培养基中，37℃培养，每隔1小时取样于620nm测定OD值，直到OD值增加0.3个单位以上停止培养，计算菌株在含胆盐和不含胆盐的MRS培养基中生长OD值增加0.3个单位所需时间及延迟时间同时对各菌株所能耐受的最高胆盐浓度进行测定，将活化的菌株按1％的接种量接种于含不同浓度胆盐的TPY液体培养基中，37℃水浴培养，于开始时间和培养12小时分别测定吸光值，由此获得耐胆盐型干酪乳杆菌菌株。

本发明还提供了结合胆盐水解酶基因的克隆方法，包括：

a.查询GeneBank找到已公布的相关序列进行结合胆盐水解酶基因的引物设计；

b.对上述新鲜干酪乳杆菌进行PCR扩增，从而得到目的片段；

c.对目的片段进行琼脂糖凝胶回收以及基因克隆，并将克隆片段送往基因公司进行测序。

本发明还提供了结合胆盐水解酶基因在不同胆盐浓度条件下的表达方法，包括：

a.将所述干酪乳杆菌的新鲜菌液于含有0.2％的巯基乙酸钠的TPY培养基中培养；

b.在37℃条件下培养到其对数生长期以后，加入胆盐使其浓度分别达到0％，0.05％，0.2％，继续培养3个小时之后，提取RNA，进行RT-PCR；

c.扩增产物进行琼脂糖电泳检测，并根据扩增条带绘制柱状图。

本发明还提供了人工胃液和人工肠液的制备方法：

人工胃液：NaCl 0.2％、胃蛋白酶0.35％，用1mol/L HCl调整pH值为3.0后，过滤，除菌，备用。

人工肠液：将下述a液和b液以2:1混合即为人工肠液。

a.胰腺液：重碳酸钠1.1％、NaCl 0.2％、胰蛋白酶(Trypsin，sigma)0.1％，调整pH为8.0后，过滤，除菌，备用。

b.胆汁液：Bile Salts(Difco)1.8％，调整pH为8.0后，过滤，除菌，备用。

本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)对胆盐有较高的抗性。因此，可将其作为潜在的益生菌用于食品，特别是乳制品的发酵剂。

对所述干酪乳杆菌中结合胆盐水解酶基因的克隆及表达表明，在所述干酪乳杆菌中结合胆盐水解酶基因与该菌株的胆盐抗性是有一定关系的。因此，可用于乳酸菌益生菌株的筛选、遗传改造。

附图说明

图1为本发明干酪乳酸菌L.casei Zhang总基因组DNA提取流程图；

图2为本发明克隆所得目的基因片段的回收与鉴定流程图；

图3为本发明目的片段克隆所需感受态细胞的制备流程图；

图4为本发明目的片段质粒转化流程图；

图5为本发明转化菌落的PCR鉴定与培养流程图；

图6为本发明编码干酪乳杆菌L.casei Zhang中结合胆盐水解酶基因的核苷酸和编码蛋白序列；

图7为本发明干酪乳杆菌L.casei Zhang，ZL3-1总RNA提取流程图；

图8为本发明干酪乳杆菌L.casei Zhang不同循环次数扩增结合胆盐水解酶基因，GAPDH产物电泳图；

图9为本发明不同胆盐浓度条件下干酪乳杆菌结合胆盐水解酶基因RT-PCR电泳图；

图10为本发明不同胆盐浓度条件下干酪乳杆菌结合胆盐水解酶基因表达柱状图(n＝3)。

具体实施方式：

下面将结合具体实施例对本发明做更详细的说明。

实施例1：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的胆盐耐受能力分析。

从酸马奶样品中分离鉴定的50株乳杆菌中，经过pH3.5的MRS液体培养基中生长试验及在不同胆盐浓度条件下的存活率测定，筛选到1株胆盐抗性极强的乳杆菌，即干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)。

将Lactobacillus casei Zhang进行不同浓度胆盐生长实验及其所能耐受的最大胆盐浓度实验，结果见表1及表2。

表1　Lactobacillus casei Zhang对胆盐的耐受性(n＝3 x±sd)

注：在同一栏内，上标不含有相同字母的数据之间差异显著(P<0.05)

表2 Lactobacillus casei Zhang对不同浓度胆盐的耐受性(△A₆₂₀)

注：结果表示为各菌株12小时内吸光值的改变，每一数值为三次试验的平均值。

结果显示，L.casei Zhang所能耐受介质中胆盐的最大浓度为1.8％，所述干酪乳杆菌对胆盐具有较高抗性。

实施例2：L.casei Zhang中结合胆盐水解酶

1  AAGGCGAGGAGTTTGTGACCTTGGCCTTGACGACATGCAAAAATGTTGACGAAGTACGCGCT

     K  G  E   E  F  V  T L  A  L  T  T  C  K  N  V   D  E  V  R

61   TTGGCGGGTGAGTATGGCCTGCTGGATGAACCTTATGAGTTTGGCGGCCAAGGGGTGAAA

     A  L  A  G  E  Y  G  L  L  D  E  P  Y  E  F  G  G  Q  G  V

121  ATCCCATTACATTACACATTTGTTGATCCATCAGGTAAGGGGATTGTTGTCGAACCAACC

     K  I  P  L  H  Y  T  F  V  D  P  S  G  K  G  I  V  V  E  P

181  GATCACGGCGCCTTTAAGCTGTATGATAGCATCGGCGCCATGACGAATAGTCCTGAATAC

     T  D  H  G  A  F  K  L  Y  D  S  I  G  A  M  T  N  S  P  E

241  GGGTGGCATGAAACCAATTTGCGCAATTATGTCAGTCTGAATGACAATAACTATCCTAAG

     Y  G  W  H  E  T  N  L  R  N  Y  V  S  L  N  D  N  N  Y  P

301  GGGTCCGAATTAGGCGACTACCATATTGAGCCGATTGAGTTAGGCACAGGCTACGGGATG

     K  G  S  E  L  G  D  Y  H  I  E  P  I  E  L  G  T  G  Y  G

361  TTCGGTTTGCCAGGCGATTACACATCACCATCGCGGTTTCTGCGGGCAATGTTTGTTTCG

     M  F  G  L  P  G  D  Y  T  S  P  S  R  F  L  R  A  M  F  V

421  CGTAATCTTGATCCCTTCAATAGCAAAGACGGCATTCGCGTATTATACAATGCTTTCAAG

     S  R  N  L  D  P  F  N  S  K  D  G  I  R  V  L  Y  N  A  F

481  ACTGTCTTGATTCCGCAGGGGCTAGGTCGCGACCCACAACATCAGGTTTTAACGGATTAC

     K  T  V  L  I  P  Q  G  L  G  R  D  P  Q  H  Q  V  L  T  D

541   ACGCAGTACTGGTCT

      Y  T  Q  Y  W

基因(CBSH)的克隆和测序。

本发明测序得到的片段经过同源性比较为结合胆盐水解酶基因的部分编码片段。

1、实验方法

1.1 PCR引物设计与合成

PCR引物根据GeneBank提供的相关序列(Accession No：ZP00385294)采用Primer Primer 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

F：5’-AAGGCGAGGAGTTTGTGAC-3’；

R：5’-CCAGACCAGTATTGCGTGTA-3’。

1.2 干酪乳杆菌DNA的提取。

采用CTAB法提取菌株基因组DNA(图1)。

将冷冻保存的将冷冻保存的菌株L.casei Zhang接种于MRS液体培养基中，置37℃培养24小时，经MRS培养液传代培养2～3次后，取1.5ml对数生长末期的菌体培养物，5,000rpm离心1分钟收集菌体，去尽培养液。在沉淀中加入500μl的TE缓冲液，用吸管反复吹打，使之重悬。然后加入50μl10％ SDS(w/v)和10μl 10mg/ml蛋白酶K，混匀，于55℃摇床过夜消化。再加入100μl10mol/L CTAB溶液(4.1g NaCl溶于80ml水中缓慢加入CTAB10g)及100μl浓度为5mol/L NaCl溶液，混匀，65℃水浴保温10分钟，得到粗提取液。在此粗提取液中加入等体积(一般为700μl)的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v)，颠倒混匀，12,000rpm离心5分钟；取上清，并加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)，颠倒混匀，12,000离心5分钟，弃下层。在所得到的上清液中，加入500μl预冷异丙醇，轻轻混合，直到DNA沉淀下来，室温下静止10分钟，12000rpm离心5分钟，弃去上清，得到DNA沉淀。用1ml 70％的乙醇(v/v)洗涤DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA，加100μl TE缓冲液溶解DNA，于55℃保温助溶，20分钟后取出冷却。加入5μl4mg/ml RNase于37℃水浴30分钟。而后加入400μl TE缓冲液以及500μl酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，v/v)，颠倒混匀，12,000rpm离心5分钟；取上清，并加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)，颠倒混匀，12,000离心5分钟，弃下层。在所得到的上清液中，加入0.1倍体积3M NaAC，轻轻混匀后加入500μl预冷异丙醇，轻轻混合，直到DNA沉淀下来，室温下静止10分钟，12000rpm离心5分钟，弃去上清，得到DNA沉淀。用1ml 70％的乙醇(v/v)洗涤DNA沉淀1次。清除酒精，吸干DNA。最后用30～50μl灭菌去离子水溶解DNA，于55℃，保温20分钟，助溶后，置于-20℃保存。

1.3 目的片段的PCR扩增

PCR扩增体系：0.2μl Taq聚合酶(5U/μl，Takara Tokyo，Japan)，2.5μl10×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)，2μl dNTP(各2.5mM)，2μl MgCl₂(25mM)，0.2μl正向引物(50pM)，0.2μl反向引物(50pM)，1μl DNA产物和17.4μl ddH₂O。

PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 30秒，如此进行35次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

1.4 琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR产物5μl，同1μl上样缓冲液混合均匀，点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μl DL2000 Marker，120V/cm电压下电泳30分钟。电泳结束后，在凝胶成像系统GDS-8000 System(UVP Biomaging Systems)上留取照片。

1.5 目的基因片段回收与鉴定

片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行(图2)。

在紫外灯下迅速将含目的片段条带的琼脂糖块割下，放入1.5ml的离心管中。按每100mg琼脂糖加入300-600μl S1液的比例加入S1液，置55℃水浴中10分钟，使琼脂糖块完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。加入1/3S1体积的异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟。将溶化后的琼脂糖块移入吸附柱，离心1分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入450μl W1液，静置1分钟后，离心15秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。在吸附柱中加入450μl W1液，离心15秒后倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。离心1分钟。将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附柱的中央加30μl T1液，静置1分钟后，离心1分钟。最后吸取2-4μl溶液在紫外分光光度计上测定比值和浓度后，将1.5离心管中DNA贮存于-20℃中。

1.6 目的基因片段的克隆与鉴定

1.6.1 感受态细胞的制备

挑取JM 109大肠杆菌原种，LB琼脂板上划线。过夜培养后挑取新鲜单菌落，接种到100mlLB培养基中，37℃摇菌培养2-3小时(160转/分钟)，至OD₆₀₀达到0.4-0.5时将菌液移至灭菌预冷的100ml离心管中，冰浴10-15分钟。4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入20ml经过过滤除菌并经预冷的0.1 MCaCl₂，悬浮细菌沉淀。冰浴10-15分钟后于4,000rpm，4℃离心10分钟，回收细菌沉淀。加入4ml 0.1M CaCl₂悬浮细菌沉淀。该细胞可直接用于转化实验。加甘油至终浓度为15％-20％，混匀，每份分装成100μl于1.5ml EP管中，冻存于-70℃冰箱中(图3)。

1.6.2 回收片段同T载体的连接

连接用TaKaRa pMD 18-T Vector试剂盒。

操作过程如下：

首先在EP管中制备下列连接反应液：

pMD 18-T Vector(50ng/μl)              0.5μl

DNA                                   20-40ng

溶液1                                 5μl

加dH₂O至                              10μl

总计                                  10μl

将上述反应液在16℃反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。

1.6.3 质粒的转化

从-70℃冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。将100μl感受态细胞加入10μl连接产物，冰浴30分钟后于42℃水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加入400μl液体LB培养基，37℃复活50分钟后取100μl铺于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨苄青霉Amp(100mg/ml)X-gal(100μg/ml)和IPTG(1mM)。最后于37℃恒温培养10-15小时。白色菌斑应含重组质粒(图4)。

1.6.4 转化菌落的PCR鉴定与培养

用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取白色单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，进行PCR扩增。将PCR产物同标记物(Marker)一起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。得到目的片段后，用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml含0.1％(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)LB液体培养基中，37℃过夜摇菌培养，用于质粒回收和测序(图5)。

2、实验结果

经过测序得到图6所示编码结合胆盐水解酶基因的部分DNA和核苷酸序列，该序列与GeneBank中所公布的基因序列的同源性为99％。

3、结论

克隆测序得到的基因片段为结合胆盐水解酶基因的部分片段。

实施例3：胆盐胁迫对干酪乳杆菌结合胆盐水解酶基因的影响

1、实验方法

胆盐抗性一直被作为益生菌筛选的一个标准。因此，找到与益生菌胆盐抗性相关的基因在今后进行益生菌改造方面具有积极的作用。

本发明利用RT-PCR技术发现结合胆盐水解酶基因与干酪乳杆菌的胆盐抗性是有一定关系的。

1.1 PCR引物设计与合成

PCR引物根据GeneBank提供的相关序列(Accession No：ZP00385294)(Accession No：ZP00384779)采用Primer Primer 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

结合胆盐水解酶基因PCR引物：

F：5’-AAGGCGAGGAGTTTGTGAC-3’；

R：5’-CCAGACCAGTATTGCGTGTA-3’。

GAPDH基因PCR引物：

F：5’-CTTTCCCTGGTGAAGTTAG-3’；

R：5’-GTTCAGGAAGTAAGCCATT-3’。

1.2 总RNA提取

对照菌株：L.casei ZL3-1

将L.casei Zhang，L.casei ZL3-1分别同时生长于含有0.2％的巯基乙酸钠的TPY培养基中，在37℃条件下培养到其对数生长期以后，加入胆盐使其浓度分别达到0％，0.05％，0.2％，继续培养3个小时之后，加入2％溶菌酶作用20分钟后，收取约50mg菌体沉淀，按照TRIzol(Invitrogen，Lot.No.1298919，USA)试剂盒说明书抽提总RNA。总RNA提取采用Trizol法(Invetrogen，USA)，具体操作按照TRIzol试剂盒说明书进行(图7)。生物分光光度计(eppendorf AG22331 HAMBURG，Germany)测OD值，调整各细菌样总RNA浓度至500ng/μL。

1.3 确定RT-PCR反应循环次数

取同一样本cDNA分别作目的基因结合胆盐水解酶和内标基因GAPDH22，25，28，30，31，34个循环扩增，1％琼脂糖电泳产物，紫外成像分析条带灰度确定扩增平台期前的循环次数为反转录实验循环参数。反应体系为25μl。扩增条件：97℃预变性5分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环34次，最后一个循环结束后72℃延伸10分钟。

1.5 RT-PCR扩增

按大连报生物反转录试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0要求进行反转录。反转录反应液组成：1μl 10×RT缓冲液，2μl 25mmol/L MgCl₂，1μl dNTP混合物，0.25μl RNase抑制剂(40U/μl)，0.5μl AMV反转录酶XL(5U/μl)，0.5μl Oligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/μl)，1μl RNA模板，3.75μlRNase Free dH₂O，总体系为10μl。

反转录反应条件：30℃ 10分钟，42℃ 30分钟，99℃ 5分钟，5℃ 5分钟。PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 30秒，如此进行32次循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。

1.6 琼脂糖凝胶电泳检测

取每个组织样品的目的基因RT-PCR产物4μL和内标基因的RT-PCR产物2.5μL，同1μL上样缓冲液混合均匀，分别点样于琼脂糖凝胶孔中，在另一孔中加入5μL DL2000 Marker，10V/cm电压下电泳30分钟。电泳结束后，在凝胶成像系统GDS-8000 System(UVP Biomaging Systems)上留取照片。应用系统软件(Gel-Pro Analyzer 4.0)进行吸光值比较分析，确定目的基因在组织样品中表达量的相对值。

2、实验结果

为了准确反映不同胆盐浓度条件下结合胆盐水解酶基因表达，在进行半定量PCR时，要求PCR扩增不进入平台期。实验结果显示，结合胆盐水解酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶分别在30、28个循环维持相对恒定灰度。比较多次实验的结果，将30、28循环确定为结合胆盐水解酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶PCR扩增条件。(如图8所示，其中1-6泳道分别为结合胆盐水解酶扩增22、25、28、30、31、34循环，7-12泳道分别为GAPDH扩增22、25、28、30、31、34循环)。

干酪乳杆菌的结合胆盐水解酶基因，内标基因，以1μL反转录产物为模板的PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图9所示(其中1-6泳道为L.casei ZL 3-1；7-12泳道为L.casei Zhang；奇数泳道为结合胆盐水解酶；偶数泳道为GAPDH；1、2、7、8泳道为胆盐含量0％；3、4、9、10泳道为胆盐含量0.05％；5、6、11、12泳道为胆盐含量0.2％)，并根据各电泳条带的吸光值比较绘制柱状图(图10)。从图中可以看到随着干酪乳杆菌培养基中胆盐浓度的增加，结合胆盐水解酶的表达呈上升趋势。

3、结论

表明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)的结合胆盐水解酶基因同菌细胞胆盐抗性间的有一定关系。

Claims (8)

1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)，其特征在于：所述干酪乳杆菌菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.1697。

2.根据权利要求1所述的干酪乳杆菌，其特征在于：它是从酸马奶中分离的耐酸型益生菌菌株。

3.根据权利要求1所述的干酪乳杆菌，其特征在于：它是从酸马奶中分离的耐胆盐型益生菌菌株。

4.根据权利要求1所述的干酪乳杆菌，其特征在于：它包括耐胆盐基因。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的干酪乳杆菌用作食品发酵剂的用途。

6.一种耐胆盐型干酪乳杆菌菌株的筛选方法，包括：

a.以天然酸马奶为样品，从中分离鉴定得到50株乳杆菌，经过分析鉴定后制成乳杆菌菌液；

b.吸取所述乳杆菌悬浮液10μl接种于5mL pH3.5的MRS液体培养基中，置于37℃条件下进行24小时培养，同时吸取乳杆菌悬浮液1.0mL与9.0mL pH3.0的人工胃液混合后，置于37℃条件下培养，分别在培养开始时间0小时和培养3小时后取样，用BCP琼脂培养基倾注培养测定活菌数；

c.将筛选出的乳杆菌培养液经离心收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将其菌体悬浮于5mL灭菌生理盐水中制成菌悬液，将乳杆菌菌悬液分别接种于含9mL过滤除菌处理的pH2.0、pH3.0和pH4.0的人工胃酸试管中各1mL，充分混匀后放置于37℃恒温箱保温，并在实验开始时间和保温1小时、2小时、3小时后分别取样，测定其活菌数；

d.无菌吸取1mL处理3小时后的不同pH值含菌人工胃液，分别接种于9mL过滤除菌的pH8.0的人工肠液中，继续置37℃恒温箱厌氧培养并分别在开始时间和培养3小时、6小时、24小时后，分别测定活菌数；

e.将各供试乳杆菌，分别按2％接种于10％灭菌脱脂乳中，37℃培养16小时制成单菌发酵乳，分别吸取1mL接种于pH1.2、pH2.0、pH3.0、pH4.0和pH5.0的9mL过滤除菌的人工胃液中，充分混匀放置于37℃恒温箱保温，在实验开始和保温1小时、2小时、3小时后分别取样，测定其活菌数，然后无菌吸取1mL处理3小时后的不同pH值含菌人工胃液，分别接种于9mL过滤除菌的pH8.0的人工肠液中，继续置37℃恒温箱厌氧培养，分别在开始时间和培养3小时、6小时、24小时后测定各个时段的活菌数；

f.选用对人工消化液耐受性较好的乳杆菌进行实验，采用Walker和Gilliland方法测定胆盐对菌株生长的影响，即将MRS液体培养基活化的乳杆菌按1％分别接种于含胆盐的MRS液体培养基中和不含胆盐的MRS培养基中，37℃培养，每隔1小时取样于620nm测定OD值，直到OD值增加0.3个单位以上停止培养，计算菌株在含胆盐和不含胆盐的MRS培养基中生长OD值增加0.3个单位所需时间及延迟时间，同时对各菌株所能耐受的最高胆盐浓度进行测定，将活化的菌株按1％的接种量接种于含不同浓度胆盐的TPY液体培养基中，37℃水浴培养，于开始时间和培养12小时分别测定吸光值，由此获得耐胆盐型干酪乳杆菌菌株。

7.一种结合胆盐水解酶基因，其特征在于所述基因的序列如下：

1  AAGGCGAGGAGTTTGTGACCTTGGCCTTGACGACATGCAAAAATGTTGACGAAGTACGCGCT

      K   G  E  E  F  V  T  L  A  L  T  T  C  K  N  V  D  E  V  R

61   TTGGCGGGTGAGTATGGCCTGCTGGATGAACCTTATGAGTTTGGCGGCCAAGGGGTGAAA

     A  L  A  G  E  Y  G  L  L  D  E  P  Y  E  F  G  G  Q  G   V

121  ATCCCATTACATTACACATTTGTTGATCCATCAGGTAAGGGGATTGTTGTCGAACCAACC

     K  I  P  L  H  Y  T  F  V  D  P  S  G  K  G  I  V  V  E   P

181  GATCACGGCGCCTTTAAGCTGTATGATAGCATCGGCGCCATGACGAATAGTCCTGAATAC

     T  D  H  G  A  F  K  L  Y  D  S  I  G  A  M  T  N  S  P  E

241  GGGTGGCATGAAACCAATTTGCGCAATTATGTCAGTCTGAATGACAATAACTATCCTAAG

     Y  G  W  H  E  T  N  L  R  N  Y  V  S  L  N  D  N  N  Y  P

301  GGGTCCGAATTAGGCGACTACCATATTGAGCCGATTGAGTTAGGCACAGGCTACGGGATG

     K  G  S  E  L  G  D  Y  H  I  E  P  I  E  L  G  T  G  Y  G

361  TTCGGTTTGCCAGGCGATTACACATCACCATCGCGGTTTCTGCGGGCAATGTTTGTTTCG

     M  F  G  L  P  G  D  Y  T  S  P  S  R  F  L  R  A  M  F  V

421  CGTAATCTTGATCCCTTCAATAGCAAAGACGGCATTCGCGTATTATACAATGCTTTCAAG

     S  R  N  L  D  P  F  N  S  K  D  G  I  R  V  L  Y  N  A  F

481  ACTGTCTTGATTCCGCAGGGGCTAGGTCGCGACCCACAACATCAGGTTTTAACGGATTAC

     K  T  V  L  I  P  Q  G  L  G  R  D  P  Q  H  Q  V  L  T  D

541  ACGCAGTACTGGTCT

     Y  T  Q  Y  W

8.根据权利要求7所述的结合胆盐水解酶基因用于筛选和改造益生菌的用途。

Images