CN103911335B - 约氏乳酸杆菌bs15及其在预防和治疗非酒精性脂肪肝中的应用 - Google Patents
约氏乳酸杆菌bs15及其在预防和治疗非酒精性脂肪肝中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种约氏乳酸杆菌(<i>Lactobacillus？johnsonii</i>)BS15？CCTCC？NO:？M2013663在预防和治疗由高脂食物引起的非酒精性脂肪肝（NAFLD）中的应用。约氏乳酸杆菌BS15显著降低了肥胖小鼠肝脏脂肪变性的程度和肝细胞的凋亡率。
Description
技术领域
本发明涉及一株乳酸杆菌属的新菌株，及其在预防和治疗非酒精性脂肪肝中的应用。
背景技术
随着生活水平的提高，肥胖以及与肥胖相关的非酒精性脂肪肝（NAFLD）已经成为了世界卫生组织亟待解决的问题。在过去的20年中，NAFLD在成年人中的比例已经增长到20-30%，在儿童中的比例增长到3-10%。
目前，已有研究发现大黄素，VC和VE对NAFLD具有一定改善作用。然而，NAFLD是一种慢性代谢性疾病，长期服用药物治疗会对机体造成严重的伤害。因此绿色环保生物制品的开发成为了应对NAFLD重要技术手段。国内外已有大量的研究报道证实益生菌具有抗癌，增强免疫，抗肥胖等重要作用。但对益生菌尤其是约氏乳酸杆菌BS15在预防和治疗NAFLD方面的研究几乎未见报道。
发明内容
针对上述课题，本发明以阿坝州红原草原传统酸奶中的微生物菌群为研究对象，分离出了具有耐酸耐胆盐分解胆固醇的益生菌，并对其在预防和治疗NAFLD方面的功效做了进一步研究。
本发明的目的是提供一株约氏乳酸杆菌BS15 CCTCC NO: M2013663；
本发明的另一目的是公开上述约氏乳酸杆菌BS15在预防和治疗NAFLD中的应用。
具体讲，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
采集阿坝州红原草原传统酸奶，用MRS培养基进行筛选和鉴定，得到一株具有耐酸耐胆盐分解胆固醇能力的益生菌。通过PCR扩增出该菌株的16S rDNA片段，经测序获得目的基因序列。用美国生物信息学中心（NCBI）的BLAST程序对所初步获得的该菌株的16S rDNA序列进行登录，获得登录号为HM772969.1 (GenBank(Http: //ww w.ncbi.nlm.nih. gov/blast/)，与已收录的序列进行核苷酸同源性比较。经过微生物学分类鉴定，确定该分离的菌株为约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii) BS15，该菌株已于2013年12月13日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为：CCTCCNO: M2013663。
本发明约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii) BS15（以下简称为“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”）按照常规甘油冷冻方法保藏。
本发明提供含“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液的制备方法：
将活化3代的“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”菌液按2%接种量接种MRS培养液，37℃厌氧静置培养36 h后活菌计数，3000r/min离心15min保留菌泥，用PBS缓冲液（pH7.0）稀释成2×108和2×107 CFU/0.2mL，置-20℃备用，每周制备一次菌液，灌胃前将菌液置25℃温水活化后使用。
本发明也提供“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”在预防和治疗非酒精性脂肪肝中的应用。根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用雄性ICR（Institute of CancerResearch）小鼠分别饲喂普通饲料、高脂饲料和灌胃含“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液。实验分为对照组、高脂组、L-BS15组和H-BS15组，每组10只小鼠。预饲期为7d，正试期为119d，每天8:00、14:00、20:00进行投料，每天8:00进行灌胃，自由饮水。在实验后测定肝重、体重，血清中游离脂肪酸（FFA）、谷丙转氨酶（ALT），肝脏线粒体内过氧化氢酶 (CAT)、过氧化氢（H2O2）、谷胱甘肽 (GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、丙二醛(MDA) 、总超氧化物歧化酶 (T-SOD)活性，肝脏线粒体内细胞色素c、解耦连蛋白（UCP）-2、β-1 F0-ATP 合酶，肝脏细胞凋亡率及肝脏组织切片等指标来判断“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”是否具有预防和治疗非酒精性脂肪肝的作用。
附图说明
图1为本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的总DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为λ/HindIII DNA Marker，O为阴性对照；
图2为本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的16S rRNA PCR产物的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测图，其中M为D2000，O为阴性对照；
图3为对照组小鼠肝脏组织切片图；
图4为高脂组小鼠肝脏组织切片图；
图5为含低剂量本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”菌液L-BS15组小鼠肝脏组织切片图；
图6为含高剂量本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”菌液 H-BS15组小鼠肝脏组织切片图；
图7为含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠肝细胞凋亡的影响图（注：与高脂组相比，*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01表示差异极显著)。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，列举以下实施例，但其对发明的范围无任何限制。
实施例1本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的获取与鉴定
1.菌株的分离
取阿坝州红原草原传统酸奶用0.8％生理盐水等比例稀释，用PBS梯度稀释后取100uL涂布于MRS平板，37℃厌氧静置培养36h，挑取典型单菌落进行革兰氏染色观察，并划线纯化培养，再挑取单菌落于MRS肉汤扩大培养，并命名为乳酸菌BS15。
2.乳酸菌BS15的耐酸耐胆盐实验
将活化3代的乳酸菌BS15菌液按2%的接种量分别接种于pH3.0和pH6.4的MRS液体培养基，37℃厌氧培养12 h；同时按2%的接种量接种于0.3％牛胆盐的MRS液体培养基，37℃厌氧培养12 h，动态检测培养期间活菌数的变化，实验重复3次取平均值。实验结果显示，本发明乳酸菌BS15在pH6.4的缓冲液中培养12h后仍然生长优良；且在0.3％胆盐培养基中培养12h后活菌数高达2.0×107 CFU/mL（见表1）。表明本发明乳酸菌BS15具有较强的耐酸性和胆盐耐受性，能在肠道内定植且达到一定的数量。
表1乳酸菌BS15的耐酸耐胆盐实验
| 菌株 | PH 6.4 | PH 3.0 | 耐胆盐试验（CFU/mL） |
| 乳酸菌BS15 | +++ | ++ | 2×107 |
注： +++为生长优良； ++为生长良好。以已知浓度的菌体培养液（109、106、103CFU/mL）做对照，培养液无浑浊视为无生长，有浑浊度但低于103 CFU/mL视为略有生长，浑浊度在103 CFU/mL与106 CFU/mL之间视为生长一般，浑浊度在高于106 CFU/ mL低于109 CFU/mL视为生长良好，浑浊度近似于109CFU/ mL视为生长优良。
3.乳酸菌BS15的降胆固醇能力的测定
将活化3代的乳酸菌BS15菌液按2%的接种量接种于MRS-CHOL培养基中，37℃厌氧培养24 h后用邻苯二甲醛法测定菌液上清液、洗涤液、菌体破碎液中胆固醇的质量分数，以未接种乳酸菌BS10菌液的MRS-CHOL培养基作为空白对照，并根据上清液中胆固醇的质量分数计算培养基中胆固醇的脱除率，试验重复3次取平均值。实验结果显示，本发明乳酸菌BS15的上清液中胆固醇的脱除率最高，为38.75％，洗涤液的脱除率为33.22％，而细胞破碎液的脱除率最低为28.03％（见表2）。说明本发明乳酸菌BS15能发挥良好地降解胆固醇的作用。
表2乳酸菌BS15的胆固醇脱除率
| 菌株 | 细胞破碎液 | 洗涤液 | 上清液 |
| BS15 | 28.03 | 33.22 | 38.75 |
4.乳酸菌BS15的鉴定
采用QIAamp®DNA Stool Mini Kit试剂盒提取乳酸菌BS15的总DNA，用2%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA（见图1）。然后对乳酸菌BS15基因组总DNA的16S rDNA V3进行PCR扩增，产物用1.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测（见图2），纯化后送上海生物技术有限公司测序，测得乳酸菌BS15的16S rRNA序列为1099个bp，见核苷酸序列表（见序列表1）。将该乳酸菌BS15的16S rRNA序列提交美国生物信息学中心（NCBI）网站，获得登录号为HM772969.1。在Genbank里搜索出进行blast比对后，与约氏乳酸杆菌（Lactobacillus johnsonii）亲缘性最近，同源性高达98％。因此，本发明乳酸菌BS15鉴定为约氏乳酸杆菌（Lactobacillusjohnsonii），并已于2013年12月13日在位于湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏编号为：CCTCC NO: M2013663。
本发明约氏乳酸杆菌（Lactobacillus johnsonii）BS15按照常规甘油冷冻方法保藏。
实施例2本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”在预防和治疗非酒精性脂肪肝中的应用
本发明中的基础饲料购自成都达硕生物科技有限公司。
含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液按2%接种量接种MRS培养液，37℃厌氧静置培养36 h后活菌计数，3000r/min离心15min保留菌泥，用PBS缓冲液稀释为2×108和2×107 CFU/0.2mL，置-20℃备用，每周制备一次菌液，灌胃前将菌液置25℃温水活化后使用。
本发明中的高脂饲料由80%基础饲料、0.5%胆固醇、6.3%猪油、13%蛋黄粉、0.2%胆酸盐制备成颗粒饲料。
本发明根据国家保健食品管理法规的有关规定，采用40只3周龄的雄性ICR小鼠进行饲喂实验。实验分组及饲喂见表3，每组10只小鼠。预饲期为7d，正试期为119d，每天8:00、14:00、20:00进行饲料饲喂，每天8:00进行灌胃，自由饮水，动物房温度为23±2℃，控制12h光照，12h黑暗，每4d更换一次垫料。
表3 实验分组及饲喂
| 实验分组 | 日常饲喂 | 灌胃0.2mL/只/d |
| 0-35d | ||
| 对照组 | 普通饲料+水 | PBS |
| 高脂组 | 普通饲料+水 | PBS |
| L-BS15组 | 普通饲料+水 | 2×107 CFU/0.2mL菌液 |
| H-BS15组 | 普通饲料+水 | 2×108CFU/0.2mL菌液 |
| 36-119d | ||
| 对照组 | 普通饲料+水 | PBS |
| 高脂组 | 高脂饲料+水 | PBS |
| L-BS15组 | 高脂饲料+水 | 2×108 CFU/0.2mL菌液 |
| H-BS15组 | 高脂饲料+水 | 2×107CFU/0.2mL菌液 |
实验检测数据：
含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠体重和肝脏体指数的影响见表4，含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠FFA和ALT含量的影响见表5，含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠肝脏线粒体氧化应激的影响见表6，含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠线粒体呼吸链相关蛋白含量的影响见表7，含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠肝脏组织的影响见附图3、4、5、6，含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠肝细胞凋亡的影响见附图7。
表4 本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠体重和肝脏体指数的影响
| 指标 | 对照组 | 高脂组 | L-BS15组 | H-BS15组 |
| 初始体重(g) | 16.28±0.69 | 16.28±0.69 | 16.72±0.97 | 16.26＋1.15 |
| 最终体重(g) | 46.53±3.64b | 53.84±1.64 | 48.14±3.58b | 46.54±4.27b |
| 肝脏组织重/体重（mg/g） | 35.82±4.24B | 48.98±4.41 | 42.2±4.37ab | 41.75±2.1ab |
注：与对照组相比，aP＜0.05表示差异显著，AP＜0.01表示差异极显著；与高脂组相比，bP＜0.05表示差异显著，BP＜0.01表示差异极显著。下表同。
由表4可以看出，与对照组相比，小鼠体重和肝脏重在高脂组显著增加。与高脂组相比，体重在L-BS15组和H-BS15组分别降低了10.59%和13.56%，肝脏分别降低了13.84%和14.76%。说明本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”对于NAFLD的诱因有一定抑制作用。
表5含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液小鼠FFA和ALT含量的影响
| 指标 | 对照组 | 高脂组 | L-BS15组 | H-BS15组 |
| FFA(mmol/L) | 15.87±3.13* | 23.58±4.5 | 15.26±1.46* | 14.93±1.26* |
| ALT(U/L) | 17.17±1.94** | 41.33±2.73 | 19.5±2.35** | 19.33±2.07** |
注：与高脂组相比，*P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01表示差异极显著。下同。
由表5可以看出，高脂组小鼠血清FFA和ALT含量较对照组显著升高。FFA含量的升高是高脂食物诱发肥胖的显著标志，也是NAFLD的重要诱因。高脂组小鼠血清ALT的升高表明高脂食物导致了肝脏损伤。与高脂组相比，L-BS15组和H-BS15组FFA分别降低了35.28%和36.68%，差异显著；ALT分别降低了52.82%和53.23%，差异极显著。说明含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液能够有效降低FFA和ALT在血清中的含量。
表6 含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠肝脏线粒体氧化应激的影响
| 指标 | 对照组 | 高脂组 | L-BS15组 | H-BS15组 |
| CAT（U/mgprot） | 95.45±2.9BC | 19.54±5.19 | 21.4±2.99 | 44.88±4.74ABC |
| H2O2 (mmol/gprot) | 19.69±3.73B | 74.62±9.1 | 13.92±2.44B | 16.28±3.13B |
| GSH（mg/gprot） | 1.45±0.17b | 5.29±0.78 | 3.96±0.4b | 4.22±0.34b |
| GSH-Px (U/mgprot) | 876.92±61.56BC | 142.49±19.24 | 178.86±26.05 | 323.09±41.62ABC |
| MDA(nmol/mgprot) | 6.27±0.99B | 22±5.4 | 7.19±0.96B | 7.22±1.28B |
| T-SOD(NU/mgprot) | 229.87±44.98B | 68.67±6.66 | 74.04±10.53b | 115.64±12.13b |
注：与对照组相比，aP＜0.05表示差异显著，AP＜0.01表示差异极显著；与高脂组相比，bP＜0.05表示差异显著，BP＜0.01表示差异极显著。与对照组相比，aP＜0.05表示差异显著，AP＜0.01表示差异极显著; 与L-BS15相比，cP＜0.05表示差异显著，CP＜0.01表示差异极显著。
由表6可以看出，与对照组相比，高脂组小鼠线粒体内H2O2，GSH和MDA含量显著升高，CAT、GSH-Px和T-SOD活性显著降低。与高脂组相比，H2O2在L-BS15组和H-BS15组分别降低了81.34%和77.46%；GSH在L-BS15组和H-BS15组分别降低了25.14%和20.23%。MDA在L-BS15和H-BS15组分别降低了67.32%和67.18%CAT活性。CAT活性在L-BS15和H-BS15组分别升高了9.52%和129.68%。CAT、GSH-Px活性在L-BS15和H-BS15组分别升高了25.52%和126.75%。T-SOD活性在L-BS15和H-BS15组分别升高了7.82%和68.44%。说明含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液能够降低肝脏线粒体过氧化物的产生，同时能够增强抗氧化酶的活性，尤其是高浓度的含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液。
表7 含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠线粒体呼吸链相关蛋白含量的影响
| 指标 | 对照组 | 高脂组 | L-BS15组 | H-BS15组 |
| 细胞色素c (g/mL) | 31.12±2.78* | 22.94±0.7 | 29.62±1.61* | 29.96±1.54* |
| UCP-2(ng/mL) | 23.85±4.1** | 36.77±2.99 | 27.88±1.63** | 26.29±3.31** |
| β-1 F0-ATP 合酶(ng/mL) | 1.13±0.09 | 1.17±0.11 | 1.12±0.12 | 1.25±0.15 |
由表7可知，高脂组与对照组相比肝脏线粒体细胞色素c含量降低了25.47%，UCP-2的含量分别升高了54.17%。与高脂组相比，细胞色素c在L-BS15组和H-BS15组中分别升高了29.12%和30.6%；UCP-2在两组中分别降低了32.34%和29.5%。说明含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液能够有效增加肝脏线粒体内细胞色素c含量和降低UCP-2的含量。
含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠肝脏组织的影响：如图3所示对照组为正常肝脏组织切片，细胞内空泡表示脂滴在肝脏内的沉积，由图4，5，6可知，高脂组脂滴沉积比L-BS15组和H-BS15组高，脂肪变性程度严重。说明本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”明显降低了脂滴在肝脏内的沉积，改善了肝脏脂肪变性程度对NAFLD的发生具有抑制作用。
含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”的菌液对小鼠肝细胞凋亡的影响：由图7可知，高脂组与对照组相比肝细胞凋亡率升高了101.57%。与高脂组相比，L-BS15组和H-BS15组的细胞凋亡率分别下降了32.16%和37.23%。说明含本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC2013663”的菌液能够有效降低肝细胞的凋亡，抑制NAFLD的进一步发展。
从上述实施例可知，本发明“约氏乳酸杆菌CCTCC 2013663”能有效的预防和治疗非酒精性脂肪肝。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
〈110〉四川农业大学
〈120〉约氏乳酸杆菌BS15及其在预防和治疗非酒精性脂肪肝中的应用
〈160〉1
〈210〉1
〈211〉1099
〈212〉DNA
〈213〉约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii) BS15
〈400〉1
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1.一种约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii)BS15，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO:M 2013663。
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| CN101368164A (zh) * | 2007-08-13 | 2009-02-18 | 内蒙古农业大学 | 一种结合胆盐水解酶基因和包括该基因的干酪乳杆菌 |
| TW201132348A (en) * | 2010-03-25 | 2011-10-01 | Pro Md Biotech Co Ltd | Lactobacillus sp. PM308 composition and its use for treating obesity, ameliorating endomorph body type, decreasing body fat ratio and reducing cholesterol |
-
2014
- 2014-04-18 CN CN201410156594.5A patent/CN103911335B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101368164A (zh) * | 2007-08-13 | 2009-02-18 | 内蒙古农业大学 | 一种结合胆盐水解酶基因和包括该基因的干酪乳杆菌 |
| TW201132348A (en) * | 2010-03-25 | 2011-10-01 | Pro Md Biotech Co Ltd | Lactobacillus sp. PM308 composition and its use for treating obesity, ameliorating endomorph body type, decreasing body fat ratio and reducing cholesterol |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 非酒精性脂肪肝与血液中总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇的相关性研究;凌剑蓉 等;《中国医师进修杂志》;20140204;第37卷(第4期);41-42 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103911335A (zh) | 2014-07-09 |
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