CN101948857A - 重组干酪乳杆菌工程菌株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组干酪乳杆菌工程菌株及其制备方法，该干酪杆菌工程菌株携带有串联的过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因的表达载体。该工程菌株的制备方法包括如下步骤：1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和植物乳杆菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因片段；2)设计特定的限制性酶切位点，串联构建到大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒载体pSIP502上；3)通过电穿孔法将重组质粒转化到干酪乳杆菌中。通过本发明制备的重组干酪乳杆菌工程菌株能显著提高抗氧化能力和耐胆盐能力，能应用于发酵食品工业中。

Description

重组干酪乳杆菌工程菌株及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学领域，具体涉及提高抗氧化胁迫及胆盐胁迫的能力的重组干酪乳杆菌工程菌株及其制备方法。

背景技术

干酪乳杆菌广泛应用于食品工业，是乳制品发酵的常用菌种，也是最早公认的益生菌之一。干酪乳杆菌属于兼性厌氧菌，生长过程中的氧气可能对其造成危害。氧化胁迫主要来自于各种活性氧品种(Reactive oxygen spicies，ROS)，包括超氧阴离子(O₂ ^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(·OH)等，ROS能够破坏蛋白质、核酸、细胞膜等生物大分子，导致细胞衰亡。

过氧化氢酶(Catalase，CAT)能够清除H₂O₂阻止·OH的积累，保护细胞不受氧胁迫的危害。然而，在乳杆菌属中只有少数菌种含有过氧化氢酶基因，主要是植物乳杆菌和清酒乳杆菌。干酪乳杆菌染色体上不含CAT基因，抗氧化胁迫能力较弱，作为常用乳酸菌，在食品加工过程中会受到各种氧化条件的危害，造成菌体死亡及产品品质下降。

当干酪乳杆菌随食物摄入人体后，肠道内的胆盐胁迫可能会导致菌株的存活率下降，从而限制乳酸菌益生作用的发挥。胆盐水解酶(bile salt hydrolase，BSH)能够将结合态胆盐水解为游离的胆酸和氨基酸，低pH值下游离的胆酸溶解度下降发生沉淀，从而解除胆盐对菌株的危害。BSH广泛存在于肠道微生物中，其它生境中的微生物，尤其是来源于乳制品的干酪乳杆菌中鲜有发现。

近年来，通过导入外源基因的方法提高受体菌株抗胁迫能力的技术飞速发展。人们将来自于清酒乳杆菌及植物乳杆菌中的CAT基因和BSH基因转入到各种乳酸菌受体中，分别提高了这些乳酸菌的抗氧化水平和耐胆盐水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组载体，携带有细菌过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因，能够表达出过氧化氢酶和胆盐水解酶。

所述过氧化氢酶基因克隆自清酒乳杆菌；所述胆盐水解酶基因克隆自植物乳杆菌。

所述胆盐水解酶基因还包括其自身启动子。

所述PCR扩增过氧化氢酶基因的引物为5’-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3’和5’-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3’；所述PCR扩增胆盐水解酶基因的引物为5’-CGGAATTCTATATCGGTTATAAGGG-3’和5’-GGGGTACCTTAGTTAACTGCATAGT-3’。

本发明的另一个目的是提供一种重组干酪乳杆菌工程菌株，该菌株携带有能表达过氧化氢化酶和胆盐水解酶的重组载体。

本发明的另一个目的是提供一种重组干酪乳杆菌工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和植物乳杆菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因片段；

2)将扩增得到的过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因串联构建到大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒载体pSIP502(Sorvig et al.，2003)上，获得重组质粒

3)将重组质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌并提取质粒；

4)通过电穿孔法将重组质粒转化到干酪乳杆菌。

所述的干酪乳杆菌是通过常规的方法从新疆酸马奶中分离得到。

本发明的另一个目的是提供所述的重组干酪乳杆菌工程菌株在发酵食品工业上的应用。

本发明提供的含有katA和bsh1的重组载体的干酪乳杆菌工程菌株，大大提高了抗氧化和耐胆盐的能力。经测定，转入携带有katA和bsh1载体pSIPCB和不带上述两个基因的空白载体pSIPCK的干酪乳杆菌在0.1％GDCA处理3h后，存活率分别为11.38％和0.79％，含有对照载体pSIPCK的干酪乳杆菌生长明显受抑制，活菌数降低2个对数值；转入pSIPCB的干酪乳杆菌在0.5％GDCA胁迫下仍可生长，而转入对照载体pSIPCK的菌株在0.4％GDCA胁迫下全面死亡。说明转入pSIPCB的干酪乳杆菌耐受GDCA的能力明显提高。

同时经过测定，转入pSIPCB和对照载体pSIPCK的干酪乳杆菌在6mM H₂O₂处理1h后的存活率分别为63.75％和1.53％，说明其耐H₂O₂能力得到显著提高。

附图说明

图1所示重组质粒pSIPCB的构建示意图。A：大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒pSIPCK；B：含有katA基因的重组质粒pSIPCAT；C：双基因重组质粒pSIPCB。

图2所示为干酪乳杆菌中重组质粒pSIPCB双酶切鉴定。图中A为Nco I/Xho I双酶切鉴定katA基因。M，DL15000；1，PCR扩增katA基因；2，质粒pSIPCS的双酶切。B为EcoR I/Kpn I双酶切鉴定bsh1基因。M，DL15000；1，质粒pSIPCB的双酶切；2，PCR扩增bsh1基因。

图3所示为检测重组干酪乳杆菌降解过氧化氢的能力。A：受体菌干酪乳杆菌；B：转入对照质粒pSIPCK的干酪乳杆菌；C：转入katA和bsh1双基因重组质粒pSIPCB的干酪乳杆菌。

图4所示为检测重组干酪乳杆菌水解甘脱氧胆盐(GDCA)的能力。A：受体菌干酪乳杆菌；B：转入对照质粒pSIPCK的干酪乳杆菌；C：转入katA和bsh1双基因重组质粒pSIPCB的干酪乳杆菌。

图5所示为不同浓度GDCA胁迫条件下重组干酪乳杆菌生长情况。■：含有对照质粒pSIPCK的干酪乳杆菌；□：转入katA和bsh1双基因重组质粒pSIPCB的干酪乳杆菌。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1携带有目的基因katA的质粒载体的构建

1.1清酒乳杆菌基因组DNA提取

基因组提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，方法如下：

(1)取培养至对数期的清酒乳杆菌菌液5ml，12000rpm离心1分钟，弃去上清，加入200μl TES重悬一次，12000rpm离心1分钟，尽量吸去上清；

(2)加入180μl溶菌酶(20mg/ml)，37℃水浴处理1小时；

(3)加入20μl RNase(10mg/ml)，轻微震荡15秒，室温放置5分钟；

(4)加入20μl蛋白酶K溶液，轻轻混匀；

(5)加入220μl缓冲液GB，振荡15秒，70℃水浴处理10分钟，简短离心去除管盖和内壁的水珠；

(6)加入220μl无水乙醇，充分混匀15秒，简短离心；

(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀转移到吸附柱CB3中，套上收集管，12000rpm离心30秒，倒掉废液；

(8)向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液；

(9)向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，再加入500μl漂洗液PW洗涤一次；

(10)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中的残余漂洗液；

(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl经65-70℃预热的洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管，琼脂糖凝胶电泳检测提取结果，并保存于-20℃备用。

1.2PCR扩增过氧化氢酶基因片段katA

上游引物：5’-CATGCCATGGCAAATCAACTAACGACT-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAGAAAATAGGTGTCCCAAAC-3’。

上下游引物中分别引物了Nco I和Xho I酶切位点，即序列中带横线的部分。

PCR反应程序：

                                             

组分                   加量(单位：μl)

                                             

清酒乳杆菌基因组DNA    1

上游引物(10μM)        0.5

下游引物(10μM)        0.5

dNTPs(10mM each)       0.5

Ex Taq                 0.5

10×反应缓冲液         2

无菌双蒸水             15

                                            

PCR反应条件：

95℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸40s，72℃终延伸10min，共30个循环。

1.3katA连接到质粒pSIP502

PCR产物和质粒pSIP502经Nco I和Xho I双酶切，酶切体系见下表：

37℃酶切4h。经琼脂糖凝胶电泳，回收katA PCR产物的目的片段和pSIP502的载体片段。

将pSIP502载体片段和katA片段按下表体系进行连接：

                                    

组分                 加量(μl)

                                    

酶切后pSIP502        1

酶切后katA片段       5

T4DNA连接酶          1

10×反应缓冲液       1

无菌双蒸水           2

                                    

4℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α。按如下步骤进行：取大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min融化，吸取40μl感受态细胞与5μl连接产物混合，42℃热击90s，立即冰浴2min，加入1ml新鲜LB培养基，37℃复苏培养1.5h，之后取适量菌液涂布于含有红霉素(300μg/ml)的LB平板，37℃恒温培养箱培养24h后挑取单菌落，PCR鉴定重组子，重组子命名为pSIPCAT，并提取重组子的质粒。

同时，双酶切后的pSIP502进行平端化，连接，构建对照质粒pSIPCK，按如下步骤进行：

(1)双酶切后pSIP502载体粘性末端平端化

经过NcoI和XhoI双酶切后，使用DNA聚合酶I(Klenow大片段)将粘性末端补齐，形成钝端。反应体系包括：酶切后的pSIP502载体片段5μl，dNTPs 0.5μl，Klenow大片段1μl，10×反应缓冲液2μl，无菌双蒸水11.5μl，总体积20μl。反应条件为：37℃，2小时。

(2)载体平端化连接

回收平端化的载体片段，用T4DNA连接酶连接形成空载体pSIPCK。

反应体系包括：平端化的载体片段8μl，T4DNA连接酶1μl，10×反应缓冲液1μl，总体积10μl。反应条件为：4℃，连接过夜。

连接产物按实施例1的方法进行大肠杆菌DH5α的转化，得到的空载体命名为pSIPCK。

实施例2构建携带有目的基因bsh1和katA的双基因质粒载体

2.1植物乳杆菌基因组DNA提取

提取植物乳杆菌的基因组DNA，方法同实施例1。

2.2PCR扩增胆盐水解酶基因

设计特异性引物，从植物乳杆菌的基因组中扩增胆盐水解酶基因bsh1及其上游启动子序列，引物序列如下：

上游引物：5’-CGGAATTCTATATCGGTTATAAGGG-3’

下游引物：5’GGGGTACCTTAGTTAACTGCATAGT-3’

引物序列中引入了EcoR I和Kpn I酶切位点，即序列中划横线部分。

PCR反应程序同实施例1，其中模板为植物乳杆菌的基因组DNA。

PCR程序如下：

95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃终延伸10min，共30个循环。

将PCR产物和实施例1获得的重组质粒pSIPCAT用EcoR I和Kpn I进行双酶切，酶切后进行连接，转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒命名为pSIPCB(图1)。

实施例3制备重组干酪乳杆菌工程菌株

3.1制备干酪乳杆菌的感受态细胞

用MRSS(MRS，0.3M蔗糖，1％甘氨酸)培养基培养干酪乳杆菌，生长至OD₆₀₀＝0.4～0.6，取10ml菌液，于6000rpm，4℃离心8min，收集菌体；加入2ml漂洗液(0.3M蔗糖，1mM MgCl₂)重悬2次，6000rpm，4℃离心8min，弃去上清；加入2ml 30％PEG-1500重悬菌体，6000rpm，4℃离心10min，弃去上清，用200μl 30％PEG-1500重悬，40μl分装备用。

3.2重组质粒电转化干酪乳杆菌

取干酪乳杆菌的感受态细胞40μl，与2μl重组质粒pSIPCB混合，转移至2mm电转杯中，使用Bio-Rad Gene Pulser Xcell^TM型电转化仪，电转化条件为：1.5kv/cm，9ms。电击后加入1ml复苏培养基(MRS，0.3M蔗糖，0.1M MgCl₂)于37℃培养2h，取适量菌液涂布于含有红霉素(5μg/ml)的MRS平板，于37℃培养48h后筛选重组子。

3.3重组干酪乳杆菌的鉴定

含有红霉素的MRS平板上挑取单菌落，转移到含有红霉素(5μg/ml)的液体MRS培养基中，培养至稳定期，提取质粒，用NcoI、XhoI进行双酶切鉴定katA基因，用EcoR I、Kpn I进行双酶切鉴定bsh1基因(图2)。

实施例4重组干酪乳杆菌中CAT活性检测方法

4.1利用气泡法检测CAT活性

随机转接5个重组干酪乳杆菌至含有血红素(30μmol/L)的MRS培养基中，培养至对数期(OD₆₀₀～0.8)收获，取1ml菌液，12000r/min离心5min，弃去上清，用30μl TES(50mM Tris-Cl，1mM EDTA，25％(W/W)蔗糖，pH 8.0)重悬菌体，取20μl重悬液与10μl 30％过氧化氢混合；过氧化氢酶的存在会降解H₂O₂生成H₂O和O₂，产生气泡。检测结果见图3。

受体菌干酪乳杆菌与高浓度过氧化氢混合液，无气泡；转入对照质粒pSIPCK的5个克隆的干酪乳杆菌与高浓度过氧化氢混合液，无气泡；转入双基因重组质粒pSIPCB的5个克隆干酪乳杆菌与高浓度过氧化氢混合液，每个克隆的菌株就能产生大量气泡。

4.2重组CAT酶活性的测定

接5个克隆的重组干酪乳杆菌至含有血红素的MRS培养集中，培养至对数期收获，取1ml菌液，12000r/min离心5min，弃去上清，用6ml磷酸缓冲液(0.1M，pH 8.0)重悬，重悬液与4ml 0.2M H₂O₂混合，反应10min，每分钟取1ml混合液，与2ml K₂Cr₂O₇/HAc(5％K₂Cr₂O₇∶HAc＝1∶2)混合，沸水浴反应10min，冷却至室温后12000r/min离心5min，取上清于570nm测定吸光值。

用1ml不同浓度的H₂O₂与2ml K₂Cr₂O₇/HAc反应，测定570nm处吸光值，绘制吸光值-H₂O₂浓度标准曲线。

测定吸光值后，利用标准曲线计算出菌体重悬液单位时间内降解H₂O₂的量，即为酶活力，单位：μmol H₂O₂/min/10⁸CFU。

经过检测干酪乳杆菌野生型和含有对照质粒pSIPCK的干酪乳杆菌的CAT活性都为0，转入重组质粒pSIPCB的5个干酪乳杆菌的CAT活性的平均值为2.41μmol H₂O₂/min/10⁸CFU。

实施例5重组干酪乳杆菌中BSH活性检测

5.1利用含有GDCA的MRS培养基检测BSH活性

将过夜培养的重组干酪乳杆菌于含有0.05％GDCA的MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养72h。胆盐水解酶将GDCA分解为甘氨酸与去结合胆酸，去结合胆酸在低pH值条件下溶解度下降，在菌落周围产生白色沉淀。检测结果见图4。受体菌干酪乳杆菌生长于含有GDCA的固体培养基中的，无沉淀产生；转入对照质粒pSIPCK的干酪乳杆菌生长于含有GDCA的固体培养基中的，无沉淀产生；转入双基因重组质粒pSIPCB的干酪乳杆菌生长于含有GDCA的固体培养基中的，菌落周围产生大量白色沉淀。

每组试验均重复5个克隆，各个克隆之间结果一致。

5.2重组BSH酶活性测定

将重组干酪乳杆菌培养至稳定期，取4ml菌液，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体；用磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.0)洗涤两次，6000rpm，4℃离心10min，弃去上清；用含有10mM DTT的磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 7.0)重悬菌体至OD₆₀₀＝5，超声波破碎(300W，10min)，6000rpm，4℃离心10min。取100μl上清，加入1.9ml的反应液(0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.0，10mM GDCA)，37℃水浴30min；加入等体积15％(w/v)TCA混匀静置3min终止反应；12000rpm离心10min，取上清液加入等体积茚三酮反应液(5ml1％(w/v)茚三酮溶于0.5M柠檬酸缓冲液pH 5.5，12ml 30％(w/v)甘油，2ml0.5M柠檬酸缓冲液pH 5.5)；煮沸15min，冷却后于570nm处测定吸光值。

用不同浓度的甘氨酸标准液与茚三酮反应，测定570nm处吸光值，绘制吸光值-氨基酸浓度标准曲线。

测定样品吸光值后，利用标准曲线计算甘氨酸的含量。单位时间内单位体积样品每释放1μmol甘基酸的量定义为一个酶活单位，即：μmol甘氨酸/min/ml。

经检测，重组干酪乳杆菌中BSH活性为2.11μmol甘氨酸/min/ml，明显高于对照菌株。

每组试验均重复5个克隆，所得数据为各个克隆的平均值。

实施例6重组干酪乳杆菌的抗胁迫能力评价

6.1重组干酪乳杆菌耐受GDCA能力评价

重组干酪乳杆菌培养至稳定期，转接至MRS+GDCA液体培养基中，其中GDCA的终浓度为分别0％，0.05％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％。37℃培养3h，用生理盐水梯度稀释，取适当梯度涂布，培养24h后计单菌落数。

经测定，转入pSIPCB和对照载体pSIPCK的干酪乳杆菌在0.1％GDCA处理3h后，存活率分别为0.79％和11.38％，含有对照载体pSIPCK的干酪乳杆菌生长明显受抑制，活菌数降低2个对数值；转入pSIPCB的干酪乳杆菌在0.5％GDCA胁迫下仍可生长，而转入对照载体pSIPCK的菌株在0.4％GDCA胁迫下几乎全面死亡。说明转入pSIPCB的干酪乳杆菌耐受GDCA的能力明显提高(图5)。

6.2重组干酪乳杆菌耐受H₂O₂能力评价

取1ml新鲜的对数期培养液，12000r/min离心5min，弃去上清，用新鲜的培养基重悬菌体，加入6mM H₂O₂，37℃处理1h，之后用牛肝过氧化氢酶(终浓度10U/ml，Sigma)消化残余H₂O₂，用生理盐水梯度稀释，取适当梯度涂布，培养24h以后计单菌落数；以不加H₂O₂处理的菌液为参照，计算存活率。

经过测定，转入pSIPCB和对照载体pSIPCK的干酪乳杆菌在6mMH₂O₂处理1h后的存活率分别为63.75％和1.53％，说明其耐H₂O₂能力得到显著提高。

每组试验均重复5个克隆，所得数据为5个克隆的平均值。

序列说明：

SEQ ID NO1为清酒乳杆菌katA核苷酸序列；NO2为清酒乳杆菌katA氨基酸序列；NO3为植物乳杆菌bsh1核苷酸序列；NO4为植物乳杆菌bsh1氨基酸序列；NO5和NO6为扩增清酒乳杆菌katA的引物对；NO7和NO8为扩增植物乳杆菌bsh1的引物对。

Claims (7)

1.一种重组载体，其特征在于，携带有细菌过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述胆盐水解酶基因包含自身启动子。

3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述过氧化氢酶基因克隆自清酒乳杆菌。

4.根据权利要求1或所述的重组载体，其特征在于，所述胆盐水解酶基因克隆自植物乳杆菌。

5.含有权利要求1～4任一项所述的重组载体的干酪乳杆菌工程菌株。

6.权利要求5所述的重组干酪乳杆菌工程菌株的制备方法，包括如下步骤：

1)通过PCR的方法分别从清酒乳杆菌和植物乳杆菌的基因组中扩增过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因；

2)将扩增得到的过氧化氢酶基因和胆盐水解酶基因串联构建到大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒载体pSIP502上；

3)将重组质粒转化大肠杆菌，培养大肠杆菌并提取质粒；

4)通过电穿孔法将重组质粒转化到干酪乳杆菌中。

7.权利要求5所述的重组干酪乳杆菌工程菌株在发酵食品工业中的应用。

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