CN1908158A - 一种胆盐水解酶及其生产方法与专用生产菌株 - Google Patents

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CN1908158A CN 200610112696 CN200610112696A CN1908158A CN 1908158 A CN1908158 A CN 1908158A CN 200610112696 CN200610112696 CN 200610112696 CN 200610112696 A CN200610112696 A CN 200610112696A CN 1908158 A CN1908158 A CN 1908158A
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Abstract

本发明公开了一种乳酸菌胆盐水解酶及其生产方法与专用生产菌株。该胆盐水解酶，是发酵其专用生产菌株－干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC№.1739得到的。该生产胆盐水解酶的方法，包括下述步骤：1)发酵干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC№.1739，收集菌体；2)将步骤1)得到的菌体用磷酸缓冲液悬浮，在冰浴中进行超声波破碎，收集得到粗酶液，用硫酸铵沉淀蛋白后，离心收集得到胆盐水解酶。本发明的生产胆盐水解酶的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx，发酵可产生大量的胆盐水解酶，由该菌株生产的胆盐水解酶具有很高的活性。

Description

一种胆盐水解酶及其生产方法与专用生产菌株
技术领域
本发明涉及一种胆盐水解酶及其生产方法与专用生产菌株。
背景技术
益生菌是指对人和动物机体有益的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有增强免疫的作用。益生菌制品的活菌代谢稳定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。早在1963年人们就证实乳杆菌发酵的酸奶具有降低胆固醇的能力。许多研究也表明了一些乳杆菌能够降低总胆固醇的含量和低密度脂蛋白胆固醇含量。摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌的酸奶能够降低血清胆固醇的含量。
大量的研究发现，经常食用含有益生菌(主要是乳酸菌)的发酵制品有助于血清胆固醇含量的降低。Mann和Spoerry发现非洲Massai warrios部落里的人，由于长期大量饮用由当地野生乳酸菌发酵的牛奶，血清胆固醇的含量明显比普通人群低。这一现象引起了营养学、医学、微生物学等各界人士的注意，从而掀起了乳酸菌降低胆固醇作用的研究热潮。迄今为止，大量的研究发现和证实了不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇作用的效果。
关于乳酸菌降低血清胆固醇的机理，目前尚未有明确答案。国内外研究者的观点主要集中在以下几点：(1)乳酸菌菌体细胞直接吸收胆固醇；(2)乳酸菌降解结合态胆盐转变为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共沉淀；降解后的胆盐为游离胆盐，且其在肠道的溶解度和被吸收能力均比结合态胆盐差，可以粪便的形式排出体外，由此导致了胆固醇的代谢加速，达到降低血清胆固醇水平的效果；(3)其他理论。
胆盐水解酶是乳酸菌在人体内的一种代谢产物，该酶能水解结合态胆盐，使结合胆盐降解为游离态胆盐，后者的溶解度比前者有所降低，因此能使胆固醇以沉淀的形式排出体外，其代谢产物为氨基酸，对人体无害。
Klaver等利用多株乳杆菌和双歧杆菌进行的降胆固醇研究证实：乳酸菌产生的胆盐水解酶可以使结合胆盐分解为游离胆盐，游离胆盐与胆固醇形成复合物共同沉淀下来，从而导致环境中胆固醇含量的降低。
Verstrate认为乳酸菌的高胆盐水解酶活力这一特征在降低胆固醇含量方面起着重要作用。此外，Ahn认为乳酸菌的胆盐水解酶在降低胆固醇方面具有重要作用。
国内关于干酪乳杆菌的研究主要是其降血脂、抗高血压、治疗过敏性疾病等保健功效上，如曹性根所申请的中国专利：新颖的抗幽门螺杆菌和大肠杆菌157：H7的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株的抗细菌剂(专利申请号为：CN01805665.2)；热尔韦·达诺尼公司所申请的：干酪乳杆菌在免疫刺激肽中的应用(专利申请号为：CN01810051.1)；上海光明乳业股份有限公司申请的：干酪乳杆菌Bd-II菌株及其在降低血脂方面的应用(专利申请号为：CN03128995.9)；干酪乳杆菌LC2W菌株及其在抗高血压方面的应用(专利申请号为：CN03129450.2)。此外还有景岳生物科技股份有限公司申请的：新的微生物株类干酪乳杆菌GM-080及其治疗过敏相关疾病的用途(专利申请号为：CN200410038566.X)。
国外关于干酪乳杆菌的专利也主要是集中在干酪乳杆菌作为益生菌对各种疾病的防治作用上，主要有遗传性过敏性疾病、癌症、口臭、新陈代谢综合症、益生菌疗法等，较之国内其研究的范围更广泛。干酪乳杆菌还可以作为生物保护剂，用其抑制病原菌的生长(2005024439)。Glenn；Matthew等从乳酸菌中分离得到的多肽类物质是对乳酸菌所产生的特殊功效物质的研究。而国内无任何乳酸菌产胆盐水解酶的文章报道和专利报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳酸菌胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)及其生产方法与专用生产菌株。
本发明所提供的胆盐水解酶的专用生产菌株，是干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)KTx，已于2006年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.1739。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx分离自东北普通家庭的开菲尔。在MRS培养基上，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx的菌落为乳白色或微带黄色，略有凸起。个体形态为不规则G+无芽孢杆菌，呈现杆状。
本发明所提供的胆盐水解酶，是发酵干酪乳杆菌KTx CGMCC №.1739得到的蛋白质。
本发明所提供的生产胆盐水解酶的方法，包括下述步骤：
1)发酵干酪乳杆菌KTx CGMCC №.1739，收集菌体；
2)破碎菌体，收集蛋白，得到胆盐水解酶。
所述方法中，所述步骤1)中发酵干酪乳杆菌KTx CGMCC №.1739的培养基的碳源和氮源分别为葡萄糖和大豆蛋白胨。所述培养基优选为1L中含有葡萄糖2％～4％，大豆蛋白胨0.5％～3％，MnSO40.025％，牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐温800.10％，磷酸氢二钾0.20％，乙酸钠0.50％，柠檬酸铵0.20％，硫酸镁0.058％的培养基；所述百分含量均为质量百含量。
所述培养基优选为1L中含有葡萄糖添加量2％、大豆蛋白胨添加量3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐温80 0.10％、磷酸氢二钾0.20％、乙酸钠0.50％、柠檬酸铵0.20％、硫酸镁0.058％的培养基；所述百分含量均为质量百分含量。
所述方法中，所述步骤1)中发酵干酪乳杆菌KTx CGMCC №.1739的温度可为30～40℃，发酵时间可为10～12h，发酵培养基的初始pH值可为5.0～7.0。
所述步骤1)中所述发酵干酪乳杆菌KTx CGMCC №.1739的温度优选为37℃，发酵时间优选为12h、发酵培养基的初始pH值优选为6.0。
所述方法中，还包括将步骤2)获得的胆盐水解酶采用阴离子层析法纯化，得到纯化的胆盐水解酶；所述分离条件为：以DEAE-Sepharose Fast Flow为凝胶填料，0.05mol/L NaCl作为洗脱剂，收集280nm吸收峰处样品。
本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx，发酵可产生高活性的胆盐水解酶，其产生胆盐水解酶活力可达8.85U/2×107cfu，纯化后的比活力达到1259.84U/mg。本发明的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx对人体具有可靠的安全性，制成活菌制剂，可省去常规发酵、提取等繁琐工艺。本发明的干酪乳杆菌生产的胆盐水解酶，可以作为添加剂添加到食品或药品中达到降胆固醇的目的，是高效、无毒副作用的新型生物功能添加剂；该胆盐水解酶还可以以酶制剂的方式直接食用，同样可降低胆固醇的含量。由本发明的干酪乳杆菌生产胆盐水解酶的方法，对设备要求低，操作简单，成本较低，适于工业化生产。
附图说明
图1为干酪乳杆菌KTx发酵产生的胆盐水解酶活力随pH值的变化。
图2为干酪乳杆菌KTx发酵产生的胆盐水解酶活力随温度的变化。
图3为干酪乳杆菌KTx发酵产生的胆盐水解酶活力随底物浓度的变化。
图4为干酪乳杆菌KTx发酵产生的胆盐水解酶的Km值。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx分离和鉴定
1、菌株的筛选
开菲尔滤液5ml加入45ml生理盐水(带玻璃珠)制成菌悬液，然后10倍梯度稀释106～108倍，取1ml倾注到平板(含有CaCO3的MRS琼脂平板)于37℃培养24h，挑取有溶解圈的菌落置于MRS液体管中37℃增菌培养12h，Grans染色，视其纯度，吸取增菌液以2％(体积比)的接种量接种于以胆固醇为唯一碳源的I号培养基(含有盐溶液I 1L和胆固醇1.0g的培养基；盐溶液I(g/L)：KH2PO40.25；MgSO4·7H2O 0.25；FeSO45mg；NaCl 5mg；制备时，将胆固醇溶于盐溶液I后用超声波细胞粉粹机500w震荡乳化20min；调pH值至7.0，121℃灭菌20min)中37℃培养20h，邻苯二甲醛法测胆固醇剩余量，根据I号培养基中胆固醇含量的降低，初筛获得的具有降胆固醇功能的菌株。
将初筛后获得的能降胆固醇的菌株，用牛津杯法接种于含有0.3％的牛磺胆盐、0.1％胆固醇、0.2％CaCl2的MRS琼脂培养基中(1L中含有牛肉膏10g，酵母提取物5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，吐温801mL，K2HPO42g，MnSO40.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，琼脂15g)在牛津杯中加入0.1ml的MRS培养菌液，于37℃厌氧罐中培养72h后观察牛津杯周围是否有不透明的沉淀圈产生。以不含牛磺胆盐、0.1％胆固醇、0.2％CaCl2的MRS琼脂培养基作为对照。将牛津杯周围白色沉淀物轻轻刮下，溶解于少量蒸馏水的试管中，滴加茚三酮显色液，观察是否有蓝紫色反应，以此初步确定菌株是否产生胆盐水解酶。通过实验获得一株产胆盐水解酶的菌株，命名为KTx。将茚三酮反应阳性的菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。
2、菌株KTx的鉴定
将步骤1获得的产胆盐水解酶的菌株KTx，接种于MRS液体培养基中37℃培养，进行下述鉴定。
糖醇类发酵试验，接触酶(H2O2酶)试验，硝酸盐还原试验，甲基红试验，V-P试验，耐盐试验(7.5％NaCl)，不同温度试验(10℃、30℃、40℃)。
鉴定结果如表1所示。结果表明，菌株KTx为乳杆菌属。进一步采用Biolog全自动微生物鉴定仪分析鉴定，表明，菌株KTx为Lactobacillus casei，即干酪乳杆菌。该菌株已于2006年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.1739。在MRS培养基上，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx的菌落为乳白色或微带黄色，略有凸起。个体形态为不规则G+无芽孢杆菌，呈现杆状。
         表1.菌株KTx属的鉴定指标与鉴定结果
  鉴定项目   试验结果   鉴定项目   试验结果
  革兰氏染色   +   葡萄糖   +
  硝酸盐还原   -   鼠李糖   -
  D-半乳糖   +   松二糖   +
  D-甘露醇   +   果糖   +
  棉子糖   -   蜜二糖   +
  赤藓糖   +   木糖   -
  山梨醇   -   7.5％NaCl   -
  蔗糖   +   30℃   +
  松三糖   +   40℃   +
  七叶苷   +   甲基红   -
  过氧化氢酶   -   V-P   -
注：“+”表示反应阳性，“-”表示反应阴性。
实施例2、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx的发酵条件的优化以及发酵获得的胆盐水解酶的检测
一、干酪乳杆菌(Lac tobacillus casei)KTx的发酵条件的优化
1、基本培养基的选择：将干酪乳杆菌KTx CGMCC №.1739采用2％(V/V)的接种量，分别接种在MRS液体培养基，改良MRS液体培养基(MRS培养基加质量含量为3～4‰玉米浆和质量含量为0.3～0.4‰的半胱氨酸盐酸盐)，MRS肉汤培养基(MRS-broth液体培养基)(胰蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖10g，柠檬酸三铵1g，乙酸钠2.5g，吐温800 .5mL，Na2HPO41g，MnSO40.025g，MgSO4·7H2O0.05g，蒸馏水500mL)，在37℃下培养12h后，测其生长量以及产胆盐水解酶的量，产胆盐水解酶的量按照下述胆盐水解酶的提取和检测方法测量。
胆盐水解酶的提取和检测方法：将干酪乳杆菌KTx CGMCC №.1739的发酵液在4℃下冷冻离心收集沉淀；用无菌生理盐水洗涤菌体沉淀，10000rpm(10750g)离心，收集菌体沉淀；加入到0.1mol/L pH6.5磷酸缓冲液，菌液浓度调到A600nm为1；菌体悬浮液在冰浴中进行超声波破碎，500w，3min/5ml，收集粗酶液。将0.1ml粗酶液加入1.8ml的磷酸钠缓冲液(pH6.0)和0.1ml的结合胆盐(6mmol/L牛磺胆酸钠)，振荡1min混匀，混合物在37℃培养30min加入三氯乙酸中止反应(0.5ml反应液/0.5ml的三氯乙酸)，然后4℃，10000rpm离心10min。取反应上清液1ml，加入1ml pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液和1ml茚三酮显色液，混匀后在100℃沸水浴中加热15min，冷却，室温放置5min后，加入3ml 60％乙醇稀释，摇匀后测定A570nm，生成的颜色在60min内稳定。每分钟生成1mmol的氨基酸定义为一个酶活力单位。
结果表明，MRS肉汤培养基中培养的干酪乳杆菌KTx，其生长量最大，产胆盐水解酶的量最大，表明MRS肉汤培养基(MRS-broth液体培养基)为最适宜生产胆盐水解酶的基本培养基。
2、pH值的优选：以MRS肉汤培养基为基本培养基，分别以pH值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0或7.0为初始pH值，按照接种量2％(1.0×105cfu/ml培养基)的量接种干酪乳杆菌KTx，在37℃下培养12小时后，按照步骤1所述的方法提取胆盐水解酶，并检测胆盐水解酶的活力，结果表明当初始pH为6.0时，培养干酪乳杆菌KTx获得的胆盐水解酶的活力最高。
3、温度条件的优选：以MRS肉汤培养基为基本培养基，初始pH值为6.0，接种量为2.0％(1.0×105cfu/ml培养基)分别以发酵温度为42℃、37℃、35℃、30℃或25℃培养干酪乳杆菌KTx，培养12小时后，按照步骤1所述的方法提取胆盐水解酶，并检测胆盐水解酶的活力，结果表明当发酵温度为37℃时，培养干酪乳杆菌KTx获得的胆盐水解酶的活力最高。
4、接种量的优选：以MRS肉汤培养基为基本培养基，初始pH值为6.0，接种量分别为0.5％(2.5×104cfu/ml发酵液)、1.0％(5.0×104cfu/ml发酵液)、2.0％(1.0×105cfu/ml发酵液)、3.0％(1.5×105cfu/ml发酵液)或4.0％(2.0×105cfu/ml发酵液)，在37℃培养干酪乳杆菌KTx，12小时后，按照步骤1所述的方法提取胆盐水解酶，并检测胆盐水解酶的活力，结果表明接种量为2％时，胆盐水解酶的活力最高，说明2％为最适接种量。
通过上述步骤1、2和3的试验，确定了最佳的培养温度37℃、培养基的初始pH值6.0和接种量2.0％。
5、培养基成分的确定
分别对比不同种类的碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、果糖、纤维二糖、棉籽糖和山梨醇)、氮源(大豆蛋白胨、普通蛋白胨、聚蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨)、表面活性剂(吐温80、吐温20和聚乙二醇)对胆盐水解酶活力的影响，确定最佳培养基成分。实验结果表明最佳的碳源、氮源、表面活性剂分别为葡萄糖、大豆蛋白胨、吐温80。
根据上述培养基成分选择的结果，以葡萄糖添加量、大豆蛋白胨添加量、培养温度和接种量为因素，设计四元四次正交实验(表2)，其它的因素(培养条件)根据上述实验得到的结论设置。按照表2的因素实验发酵得到的发酵液，按照步骤1所述的方法检测按照步骤1所述的方法提取胆盐水解酶粗酶液，检测胆盐水解酶的活力。
                     表2.四元四次正交设计因素水平表
  水平   因素
  葡萄糖添加量/％A   大豆蛋白胨添加量/％B   培养温度/℃C  接种量/％D
  1   1   0.5   25   1
  2   2   1   30   2
  3   3   2   37   3
  4   4   3   42   4
结果表明，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx接种于培养基为1L中含有葡萄糖添加量2％、大豆蛋白胨添加量3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐温80 0.10％、磷酸氢二钾0.20％、乙酸钠0.50％、柠檬酸铵0.20％、硫酸镁0.058％，培养温度37℃，接种量2％，初始pH值为6.0，培养12小时的条件下的发酵液(109cfu/ml发酵液)酶活最高，胆盐水解酶的酶活力为8.85U/2×107cfu，是优化前(MRS培养基37℃培养12小时，接种量2％(1.0×105cfu/ml培养基)，培养结束，胆盐水解酶活力达到0.66U/2×107cfu)的13.4倍。
将在上述最优培养条件下得到的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx发酵液，按照步骤1的方法提取得到粗酶液，将得到的粗酶液中加入固体硫酸铵，使其饱和度分别达到10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，每加完一次硫酸铵后，将粗酶液于冰箱内放置24h，然后于10000rpm，离心20min，将每次的沉淀离心分别收集，用约2倍体积的50mmol/L，pH6.5的磷酸钠缓冲液溶解后，装入透析袋中，于相同的缓冲液中透析至透析液经BaCl2无沉淀为止(每隔12h换一次缓冲液至透析完全)，分别测定酶活力与蛋白浓度，计算比活力(U/mg)，结果表明，70％硫酸铵分离沉淀效果最佳，上清液中的蛋白含量最少，说明70％的饱和硫酸铵能最大程度沉淀蛋白，合并比活力高的部分，并用聚乙二醇20000吸取透析带内的水分，达到样品浓缩1～2倍，做进一步纯化；然后采用阴离子层析柱进行纯化，所述凝胶层析法的分离条件为：以DEAE-Sepharose Fast Flow为凝胶填料，加样0.5mL，0.05mol/L NaCl作为洗脱剂，以1mL/min的流速洗脱，收集280nm吸收峰处样品，得到干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx的胆盐水解酶的纯品，采用SDS-PAGE电泳检测纯度。经检测胆盐水解酶的电泳图谱为一条带，分子量为30kDa。比活力可达到1259.84(U/mg)，纯度是原粗酶液的17倍。
二、胆盐水解酶特性研究
(1)酶的最佳反应pH
按照步骤一中的步骤1的方法测步骤一纯化获得的粗酶液的酶活，其中，将粗酶液稀释后，分别取1ml加在不同pH(pH 4.0～8.0)的缓冲液中，37℃保温30min。结果如图1所示，表明BSH的最适pH为6.0，反应条件为偏酸性。说明了酶的最适反应pH值和产酶的最适pH值相一致。
(2)酶的最适反应温度的测定
按照步骤一中的步骤1的方法测定步骤一纯化获得的粗酶液在不同反应温度下的酶活。其中，将粗酶液稀释后，分别取1ml加入到提前置于10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃的水浴中预热10min的磷酸缓冲液、结合胆盐混合液中，保温30min，即使酶反应温度分别为10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，测定酶活。结果如图2所示，表明酶的最适反应温度为30～40℃。
(3)最适底物浓度的测定
按照步骤一中的步骤1的方法测步骤一纯化获得的粗酶液的酶活。将底物牛磺胆酸钠配制成浓度分别为4mmol/L，5mmol/L，6mmol/L，7mmol/L，8mmol/L的溶液，然后每管加入1ml经稀释后的步骤一纯化获得的粗酶液，37℃保温30min，反应结束后测酶活。结果如图3所示，结果表明干酪乳杆菌KTx发酵产生的胆盐水解酶的最适底物浓度为6mmol/L。
(4)化学抑制剂对酶活性的影响
按照步骤一中的步骤1的方法测步骤一纯化获得的胆盐水解酶粗酶液的酶活。在底物中分别加入0.5％EDTA、1％SDS、4mol/L尿素，每管加入经过稀释的粗酶液1ml，以不加化学试剂的反应体系为对照，于37℃水浴保温30min，测定酶活。结果如表3所示，EDTA和SDS对干酪乳杆菌KTx发酵产生的胆盐水解酶的影响不大，而尿素的加入，完全抑制了干酪乳杆菌KTx发酵产生的胆盐水解酶的酶活。
            表3.不同抑制剂对酶活的影响
  样品   浓度/％   酶活(U)   抑制百分数(％)
  对照   0   0.15   0
  SDS   1   0.13   11.07
  EDTA   0.5   0.14   6.34
  尿素   4(mol/L)   0.0   45.21
(5)金属离子对酶活的影响
按照步骤一中的步骤1的方法测步骤一纯化获得的胆盐水解酶粗酶液的酶活。将Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、AL3+、Zn2+、Mn2+均以30mmol/L的浓度添加到反应体系(含1ml稀释的粗酶液)中，其他反应条件不变，以不加金属离子的反应液为对照，测酶活。结果如表4所示。
      表4.不同激活剂对酶活的影响
  样品   浓度(mmol/L)  酶活(U)   激活百分数(％)
  对照   0   14.82   0
  Cu2+   30   15.43   4.12
  Mg2+   30   15.79   6.55
  Ca2+   30   14.98   1.08
  Fe3+   30   15.87   7.09
  AL3+   30   17.55   18.42
  Zn2+   30   14.82   0
  Mn2+   30   15.87   7.09
(6)动力学常数的测定
按照步骤一中的步骤1的方法测步骤一纯化获得的胆盐水解酶粗酶液的酶活。在不同底物浓度(表5所示)的反应体系中，37℃反应5min，测定A570nm，以计算酶反应的初速度，1/V对1/[S](1/V是纵轴)作Lineweaver-Burk双倒数图，外推至与横轴相交，横轴截距(-X)即为1/Km值。用Michaelie-Menten方程(米氏方程)可以确定酶反应速度和底物浓度之间的定量关系，并满足双曲线的特征[汪家政、范明主编.蛋白质技术手册.科学出版社.200.4]。
测得的数据如表5所示，根据表5作图，结果如图4所示，由图4结合米氏方程，计算得到胆盐水解酶在本试验条件下的动力学常数Km为4.57mmol/L。
                                            表5.Km值的测定
  底物浓度(mmol/L)   2   3   4   5   6   7   8
  反应初速度(μmol/min)   0.0022   0.0022   0.0022   0.0022   0.0022   0.0022   0.0022
  1/[s]   0.5   0.333   0.25   0.2   0.167   0.143   0.125
  1/v   454.545   400   322.581   294.118   256.41   227.273   208.333

Claims (9)

1、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739。
2、一种胆盐水解酶，是发酵权利要求1所述的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)KTx CGMCC №.1739得到的产物。
3、一种生产胆盐水解酶的方法，包括下述步骤：
1)发酵干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739，收集菌体；
2)破碎菌体，收集蛋白，得到胆盐水解酶。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中发酵干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739的培养基的碳源和氮源分别为葡萄糖和大豆蛋白胨。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养基为1L中含有葡萄糖2％～4％，大豆蛋白胨0.5％～3％，MnSO4 0.025％，牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐温80 0.10％，磷酸氢二钾0.20％，乙酸钠0.50％，柠檬酸铵0.20％，硫酸镁0.058％的培养基；所述百分含量均为质量百分含量。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养基为1L中含有葡萄糖2％、大豆蛋白胨3％、MnSO4 0.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐温80 0.10％、磷酸氢二钾0.20％、乙酸钠0.50％、柠檬酸铵0.20％、硫酸镁0.058％的培养基；所述百分含量均为质量百分含量。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中发酵干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739的发酵温度为30～37℃，发酵时间为10～12h，发酵培养基的初始pH值为5.0～7.0。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵温度为37℃，发酵时间为12h、发酵培养基的初始pH值为6.0。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将步骤2)获得的胆盐水解酶采用阴离子层析法纯化，得到纯化的胆盐水解酶；所述分离条件为：以DEAE-Sepharose Fast Flow为凝胶填料，0.05mol/L NaCl作为洗脱剂，收集280nm吸收峰处样品。
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