CN102586137B

CN102586137B - 一种产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂的制备方法

Info

Publication number: CN102586137B
Application number: CN 201210005533
Authority: CN
Inventors: 刘慧�; 张红星; 谢远红; 贾慧; 钟思琼; 熊利霞; 高秀芝
Original assignee: Beijing University of Agriculture
Current assignee: Beijing Beinong Hongze Biotechnology Co ltd
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-01-10
Also published as: CN102586137A

Abstract

本发明涉及一种产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂的制备方法，适用于功能性酸奶及益生菌制剂等发酵乳制品干粉发酵剂的生产。本发明利用筛选自藏灵菇的干酪乳杆菌KL1、乳酸乳球菌乳亚种KS4和嗜热链球菌Tx三株产胆盐水解酶的菌种，经过活化和扩大培养，利用自动发酵罐进行高密度培养，再经离心浓缩和加入冻干保护剂，预冻和冻干，制备产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂。本发明优化高密度培养、预冻和冻干条件，使菌种存活率达到70％以上，且干粉发酵剂活菌数可达10¹⁰cfu/g以上。本发明制备的干粉发酵剂发酵牛奶后，所得酸奶口感黏稠细腻幼滑，甜酸度适中，有浓郁的酯香风味。

Description

一种产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂的制备方法

技术领域

本发明涉及产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂的制备方法，适用于功能性酸奶及益生菌制剂等发酵乳制品干粉发酵剂的生产。

背景技术

开菲尔是以牛乳或羊乳为原料，添加含有乳酸菌和酵母菌的开菲尔粒发酵剂，经发酵酿制而成的一种传统酒精发酵乳饮料。目前工业化生产的开菲尔乳品是以牛乳为原料，利用从开菲尔粒(又称藏灵菇)中分离的乳酸菌和酵母菌进行发酵制得。开菲尔起源于俄罗斯北高加索地区，当地牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒，其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物体，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中，使之发酵成具有爽快酸味和起泡性的保健饮料，即为开菲尔。

开菲尔乳品中含有消化吸收效果好的乳蛋白质和乳脂肪，其中有益菌群将牛乳中的乳糖大部分水解为对人体有益的L(+)-乳酸，只生成极少量的D(-)-乳酸。据测定，开菲尔中D(-)-乳酸的含量仅为2％～5％，远低于普通酸奶的25％～60％，故开菲尔乳品适于乳糖不耐症者饮用。同时，开菲尔中的L(+)-乳酸可改善人体对钙、磷、铁的吸收，且可提高人体中B族维生素(VB1、VB2、VB6、VB12、叶酸、尼克酸等)的含量。一些研究证实，开菲尔乳品具有较好的降血脂和降血糖的功效，并对结核病具有治疗效果。此外，开菲尔乳品中含有抑制癌细胞增殖的荚膜多糖和溶解癌细胞的四碳二羧酸，可降低癌症的发病率。同时还有降低血清胆固醇含量，增强肝脏功能，提高机体免疫力和抗衰老作用。开菲尔粒中的活菌对结核分枝杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌等病原菌均有强烈的抑制作用。

乳酸菌是开菲尔粒中含量最多、最具活力的一部分菌群，属于益生菌，主要存在于人体肠道。当其在人体肠道中达到一定数量时，能够改善或调节肠道微生物菌群的平衡。乳酸菌的代谢产物可以降低肠道内的pH，抑制肠道中的腐败菌生长和减弱腐败菌在肠道的产毒作用，并有助于帮助消化，预防便秘，防止细胞老化，增强机体免疫力，降低血清胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等。

早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不同观点，主要集中于以下三点：1.乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；2.乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；3.其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。

本发明所用干酪乳杆菌KL1、乳酸乳球菌乳亚种KS4和嗜热链球菌Tx作为益生菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实验证明有降低机体血清胆固醇含量的功效。

目前，国内申请各种发酵剂制备方法的专利较多，如天津科技大学肖冬光和汪建明申请的“益生乳酸菌发酵剂的制备方法及其在新鲜干酪中的应用”(CN1560231)是制备直接添加于酸奶、干酪等发酵乳制品中的益生乳酸菌发酵剂；哈尔滨美华生物技术股份有限公司张柏林和吴荣荣申请的“德氏乳杆菌保加利亚亚种酸奶或发酵乳干粉发酵剂”(CN1628528)是利用单一的德氏乳杆菌保加利亚亚种制备用于酸奶或其他发酵乳生产的发酵剂；陕西师范大学张富新和雷长鹏申请的“羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法”(CN102113556A)是利用从商品牛奶酸奶中分离所得的乳酸菌制备羊奶酸奶专用发酵剂。但关于利用分离筛选自藏灵菇的产胆盐水解酶的乳酸菌，利用自动发酵罐高密度培养，并制备干粉发酵剂的方法未见国内外相关文献报道和专利报道。

发明内容

本发明的目的在于提供利用干酪乳杆菌KL1、乳酸乳球菌乳亚种KS4和嗜热链球菌Tx三株产胆盐水解酶的菌种制备干粉发酵剂的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

所述方法中，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1，乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx三株菌种，均分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，并已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别为：CGMCCNo.1809(菌株KL1)，CGMCCNo.1807(菌株KS4)和CGMCCNo.1810(菌株Tx)。

所述方法中，在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，干酪乳杆菌KL1菌株的菌落大小为2～3mm，表面粗糙如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaCO₃的透明圈，菌落有较高黏性；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，有时菌体呈球形，G⁺无芽孢杆菌；乳酸乳球菌乳亚种KS4和嗜热链球菌Tx菌株的菌落大小为1～2mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，无光泽，凸起，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaCO₃的透明圈，菌落有较高黏性。个体形态呈球形或卵圆形，一般成对或链状排列，G⁺兼性厌氧菌。干酪乳杆菌KL1、乳酸乳球菌乳亚种KS4和嗜热链球菌Tx作为益生菌，均可在生长代谢过程中产生胆盐水解酶。

所述方法中，菌种所用培养基均为市售蒙牛纯牛奶，并于115℃灭菌15min。

所述方法中，以2％(V/V)的接种量将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的干酪乳杆菌KL1，乳酸乳球菌乳亚种KS4和嗜热链球菌Tx三株菌种分别接种于装有10mL灭菌牛奶的试管中，37℃培养12h至牛乳凝固，得到活化后的菌种。

所述方法中，在上述试验结果基础上，以3％的接种量将三株活化后的菌种分别接种于装有100mL灭菌牛奶的三角瓶中，37℃培养12h至牛乳凝固，得到扩大培养液。

所述方法中，在上述试验结果基础上，将2000mL蒙牛纯牛奶加入5L自动发酵罐，并加入5％(即100mL)新鲜胡萝卜原汁作为生长因子，利用发酵罐于115℃灭菌15min，灭菌后利用冷水机将发酵罐中的牛奶冷却至培养温度。将KL1、KS4和Tx三株菌种扩大培养液以3∶1∶2的比例接种于发酵罐内，总接种量为4％，利用发酵罐自动控温系统维持培养温度为40℃，培养过程中流加浓度为10％的灭菌Na₂CO₃溶液，以维持培养液pH6.5，设置搅拌机转速为50r/min，培养时间6h，得到液体发酵剂。

所述方法中，上述5L发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为BIOF6005GBN。上述新鲜胡萝卜原汁为将市售新鲜胡萝卜去皮、煮熟，用九阳牌食物料理机直接榨汁所得。

所述方法中，在上述试验结果基础上，将2000mL液体发酵剂于4℃、8000r/min条件下离心10min，收集得到菌泥。

所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥平均加入2只盛有100mL灭菌乳的600mL冻干瓶中，加入2.5％甘油(V/V)、2.5％谷氨酸钠(W/V)和2.5％脱脂奶粉(伊利牌)的冻干保护剂，混合均匀后，得到浓缩发酵剂。

将浓缩发酵剂于-30℃预冻13h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂。

所述方法中，在上述试验结果基础上，利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻发酵剂于冻干温度-55℃、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干发酵剂。

所述方法中，所得产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂活菌数可达10¹⁰cfu/g以上，菌种存活率可达70％以上。干粉发酵剂发酵牛奶后，所得酸奶口感黏稠细腻幼滑，甜酸度适中，有浓郁的酯香风味。

上述方法得到的产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂的制备方法属于本发明保护范围。

具体实施方式

下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量对体积的百分含量。

实施例1、产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂的制备方法

1、活化

将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的干酪乳杆菌KL1、乳酸乳球菌乳亚种KS4和嗜热链球菌Tx三株菌种分别以2％(V/V)的接种量接种于10mL灭菌牛奶中，37℃培养至牛乳凝固。如此传代培养3次得到活化后的菌种。

2、扩大培养

将上述活化后的菌株KL1、KS4和Tx以3％的接种量分别接种于装有100mL灭菌牛奶的三角瓶中，37℃培养12h至牛乳凝固，得到扩大培养液。

3、高密度培养

将2000mL蒙牛纯牛奶加入5L自动发酵罐，按表1加入不同组合的生长因子，利用发酵罐于115℃灭菌15min，灭菌后利用冷水机将发酵罐内的牛奶冷却至培养温度。将KL1、KS4和Tx三株菌种以3∶1∶2的比例接种于发酵罐内，总接种量为4％(即80mL)，利用发酵罐控温系统维持培养温度为40℃，按表2流加浓度为10％的灭菌Na₂CO₃溶液，以维持一定的培养液pH，设置搅拌机转速为50r/min，培养时间6h，得到液体发酵剂。采用平板菌落计数法测定活菌数。

表1不同生长因子对发酵剂活菌数的影响

由表1可见，以5％胡萝卜汁为生长因子培养所得发酵剂活菌数量最高，达到1.1×10¹⁰cfu/mL，明显高于不添加生长因子所得结果(1.5×10⁹cfu/mL)；以5％胡萝卜汁和5％番茄汁为生长因子培养所得活菌数为1.6×10⁹cfu/mL，以5％胡萝卜汁和5％啤酒为生长因子培养所得活菌数为1.4×10⁹cfu/mL，两者与不添加生长因子所得结果相差不大，促进菌种生长效果不明显。故选取生长因子为5％胡萝卜汁。

表2不同pH对发酵剂活菌数的影响

由表2可见，当培养液pH为6.5时所得活菌数量最高，为1.1×10¹⁰cfu/mL；pH6.2次之，达到3.2×10⁸cfu/mL；当培养液pH为6.8时活菌数量最低，为8.1×10⁷cfu/mL。故选取培养液pH为6.5。

4、离心浓缩与加入保护剂

将上述2000mL液体发酵剂分装入离心瓶中，于4℃、8000r/min离心10mmin，弃掉上清液，收集得到菌泥；将菌泥平均加入2只盛有100mL灭菌乳的600mL冻干瓶中，按表3加入不同组合的冻干保护剂，混匀，得到浓缩发酵剂。采用平板菌落计数法测定活菌数，并计算菌种存活率。

表3不同组合的冻干保护剂对发酵剂菌种存活率的影响

由表3可见，当选取2.5％甘油+2.5％谷氨酸钠+2.5％脱脂奶粉为冻干保护剂时，菌种存活率最高，为72.60％；2.5％脱脂奶粉次之，为71.40％；2.5％甘油+2.5％谷氨酸钠更次之，为70.72％；2.5％蔗糖+2.5％山梨醇最低，为60.76％。故选取2.5％甘油+2.5％谷氨酸钠+2.5％脱脂奶粉为冻干保护剂组合配方。

5、预冻、冻干

将上述2瓶100mL浓缩发酵剂按表4条件预冻13h至完全冻结状态，得到预冻发酵剂；利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)，将上述预冻发酵剂按表4条件冻干至完全干燥状态，得到干粉发酵剂。采用平板菌落计数法测定活菌数，并计算菌种存活率。

表4不同预冻和冻干条件对发酵剂菌种存活率的影响

由表4可见，在同一预冻温度条件下，真空度值越大，发酵剂菌种存活率越高。当真空度为0.20mBar和0.24mBar时，虽然菌种存活率相对较高，但在一定时间内难以制成粉状菌剂，不适用于工业化生产。当真空度为0.16mBar时，所得发酵剂菌种存活率明显高于0.12mBar时的存活率，故选取0.16mBar为冻干真空度。当真空度为0.16mBar时，预冻温度-30℃所得发酵剂菌种存活率明显高于其他预冻温度所得结果，为70.36％，故选取-30℃为预冻温度。

综上所述，本方法将菌株KL1、KS4和Tx三株菌种的扩大培养液按3∶1∶2的比例接种于蒙牛纯牛奶中，总接种量为4％(V/V)，并按纯牛奶体积5％的量加入新鲜胡萝卜原汁作为生长因子，利用5L自动发酵罐进行灭菌和高密度培养，培养温度40℃，培养液pH6.5，搅拌转速50r/min，培养时间6h，得到液体发酵剂；按离心前发酵剂1/10体积的量，取灭菌牛奶作为冻干基质，分装于600mL的冻干瓶中；将液体发酵剂于4℃、8000r/min条件下离心10min后收集的菌泥置于冻干基质中，加入2.5％甘油(V/V)、2.5％谷氨酸钠(W/V)和2.5％脱脂奶粉(W/V)的冻干保护剂，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将每个冻干瓶装量为100mL的浓缩发酵剂于-30℃预冻13h至冻结状态，得到预冻发酵剂；利用6LLABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻发酵剂于冻干温度-55℃、真空度0.16mBar条件下冻干48h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂。其活菌数可达10¹⁰cfu/g以上，菌种存活率可达70％以上。干粉发酵剂发酵牛奶后，所得酸奶口感黏稠细腻幼滑，甜酸度适中，有浓郁的酯香风味。本专利所属项目1：北京市自然科学基金“藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理功能的研究”

项目编号：5062006

项目起止时间：2006.01-2008.12

项目负责人：刘慧

本专利所属项目2：北京市自然科学基金“藏灵菇克鲁维酵母菌降胆固醇作用及机理的研究”

项目编号：5092008

项目起止时间：2009.01-2011.12

项目负责人：刘慧

Claims

1.一种利用菌株KL1CGMCC No.1809为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，菌株KS4CGMCC No.1807为乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lacti)，菌株Tx CGMCC No.1810为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)三种产胆盐水解酶乳酸菌制备干粉发酵剂的方法，其特征在于：将菌株KL1、KS4和Tx分别于接种量2％(V/V)，培养温度37℃，培养时间12h的条件下进行活化，得到活化菌种；将活化菌种于接种量3％，培养温度37℃，培养时间12h的条件下分别进行扩大培养，得到扩大培养液；将KL1、KS4和Tx菌株的扩大培养液按3∶1∶2的比例接种于蒙牛纯牛奶中，总接种量为4％，并按纯牛奶体积5％的量加入新鲜胡萝卜原汁作为生长因子，利用5L自动发酵罐进行灭菌和高密度培养，培养温度40℃，培养液pH6.5，搅拌转速50r/min，培养时间6h，得到液体发酵剂；将液体发酵剂于4℃、8000r/min离心10min，弃掉上清液，收集得到菌泥；按离心前发酵剂1/10体积的量，取灭菌牛奶作为冻干基质，分装于600mL的冻干瓶中，将离心收集后的菌泥置于冻干基质中，加入2.5％甘油(V/V)、2.5％谷氨酸钠(W/V)和2.5％脱脂奶粉(W/V)的冻干保护剂，混合均匀后，得到浓缩发酵剂；将每个冻干瓶装量为100mL的浓缩发酵剂于-30℃预冻13h至冻结状态，得到预冻发酵剂；利用美国产6L LABCONCO真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于冻干温度-55℃、真空度0.16mBar条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到产胆盐水解酶乳酸菌干粉发酵剂。