CN102604833B - 一种发酵乳多联发酵剂的制备方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法及其制得的发酵剂，所述的多联乳酸菌发酵剂为含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和益生菌的多联发酵剂。所述发酵剂制备方法包括下列步骤：(1)将所需菌种二～三次扩培；(2)离心沉淀菌体；(3)无菌水洗涤并重悬；(4)将各菌悬液按比例与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳混合均匀；(5)真空冷冻干燥，制得多联乳酸菌发酵剂。采用该方法制备的发酵乳乳酸菌发酵剂可以实现益生菌菌种与发酵乳常规菌种(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)的复合，相比常规方法制得的发酵剂而言，该产品使用方便、批次间产品更加稳定；同时避免发酵剂产品同质化现象，从而提升产品竞争力。
Description
技术领域
本发明属于食品工业领域，特别涉及一种发酵乳多联发酵剂的制备方法及制得的发酵剂。
背景技术
益生菌（Probiotic）一词起源于希腊语，意思是“专管生命”，是指通过机体免疫和粘膜免疫途径或改善宿主肠道的微生态平衡而对宿主显示保健效果的活的微生物。益生菌具有优良的功能性质。研究表明，益生菌可以调节人体肠道菌群平衡，增加肠道内益生菌的数量，治疗肠道菌群失调；促进人体对食物的消化吸收；提高机体免疫力，增进人体免疫功能；吸附致癌物及减少粪便中致癌突变物的浓度和某些酶的活性，抑制和减缓肿瘤的发病率；降低人体内毒素水平、帮助肝细胞生长而起到保护肝脏的作用；益生菌发酵产物（含菌体）具有抗高血压和（或）调节血脂浓度、降低血清中与低密度脂蛋白相结合的胆固醇的水平的功能，益生菌发酵还可以产生多种对人体健康有益的生理活性小肽。此外益生菌还可通过束缚抗原、破坏抗原而减轻过敏反应症状，并且提高机体抗氧化能力而有助于延缓衰老。
由于益生菌具有优良的功能特性，并且牛乳与益生菌具有良好的相容性而成为益生菌的最佳天然载体。因此，益生菌乳制品成为世界各国科研机构和乳业公司的研究和产品开发热点。世界各国都投入了大量的人力、物力进行研究和开发，筛选了许多具有自主知识产权的益生菌菌株，其中一些益生菌发酵乳制品已经成功的推向市场。如芬兰Valio公司开发的L.GG，法国达能公司开发的L.casei Immunitas，法国罗地亚公司开发的L.acidophilusNCFM，日本Yakult公司开发的L.casei Shirota，日本雪印公司的L.acidophilus SBT-2062，日本明治乳业开发的L.G21，丹麦汉森公司的L.acidophilus LA-1和LA-2，加拿大Urex公司的L.rhamnasus GR-1，瑞士雀巢的L.johnsonii La1和Lj1，德国Biogaia的L.reuteri SD2112、MM2，光明乳业股份有限公司的具降高血压功能的Lactobacillus casei LC2W（EP1642963B1）、降血脂功能的Lactobacillus casei BD-Ⅱ（US Patent 7270994），降血清胆固醇功能的Lactobacillus plantarum ST-III（ZL200410066891.7、ZL03116377.7），内蒙古农业大学的Lactobacillus casei Zhang等。
总体来看，在全球含益生菌的新产品中，益生发酵乳和益生菌饮料所占比例高达74.5%，年增长在30%左右。我国乳酸菌发酵食品市场发展迅猛，目前产业规模已经超过200亿元人民币，产量突破160万吨，发酵乳制品产销量年增长速度更是超过25%，而且在今后相当长的时间内仍然会保持这一增长趋势。随着我国社会整体消费水平的提高，人们越来越关注食品的功能性，益生菌由于其优良的功能特性也越来越为消费者熟知和接受，含有益生菌的发酵乳制品的市场份额也呈逐年递增之势。因此，特别是具有一定生理功能的益生菌乳制品将是益生菌一个非常重要的发展方向。为此国外的发酵剂生产企业也开发了一些多菌种复合发酵剂，如Hansen公司的含有嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的AB酸奶发酵剂；含有嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的ABT酸奶发酵剂；含有嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）的ABY酸奶发酵剂；Danisco公司推出的YO-MIX发酵剂等。这些复合发酵剂产品的价格是常规发酵剂的数倍，许多国内企业还是选择以嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）作为基础发酵剂，再另选1～2株单株益生菌发酵剂添加。在制备复合发酵剂的方法中较为常用的是采用单株冻干菌粉进行混合，但是易造成批次间性能不稳定和后续污染。
直投式发酵剂（DVS）以其高浓度、高活力以及稳定的生产性能（产香性、产粘性及产酸性等）而备受发酵乳制品生厂商的青睐。我国发酵乳制品行业直投式发酵剂市场长期为国外发酵剂公司所垄断，益生菌发酵剂市场更是为国外公司所完全占有。但值得庆幸的是，为打破我国发酵剂的市场被国外公司垄断的局面，自上世纪九十年代，国内高校和企业对益生菌的选育及产业化投入了大量的人力物力进行技术攻关，已经拥有了一些自主知识产权的专利菌种并掌握了乳酸菌发酵剂生产关键核心技术。由于国内的乳酸菌发酵剂处于刚刚起步的阶段，其产品形态也主要采用国外主流冻干菌粉形式，若菌株和制备方法上没有突破和创新，国内乳酸菌发酵剂市场又将陷入同质化和低价竞争的不利局面。因此开发并制备发酵乳多联乳酸菌发酵剂，对于国内直投式发酵剂企业而言，是一条差异化发展之路。
发明内容
本发明针对国内发酵乳直投式发酵剂与国外发酵剂同质化严重的现象，以及国内发酵乳生产企业主要采用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）作为基础发酵剂，在此基础上再另添加1～2株单株益生菌发酵剂制备发酵乳所引起的产品批次不稳定的技术问题，提供了一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法及其制得的发酵乳多联乳酸菌发酵剂。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案如下。
本发明采取的技术方案之一是：一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，其中所述方法包括以下步骤：
(1)将需要组合的菌种种子液分别接入扩培培养基经二～三次扩培；
(2)将步骤（1）所得的料液分别进行离心回收沉淀；
(3)将步骤（2）所得的离心沉淀分别用无菌水洗涤并重新悬浮；
(4)将步骤（3）所得的各重悬菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳溶液
按比例混合均匀；
(5)将步骤（4）所得的料液进行真空冷冻干燥即可。
本发明所述技术方案步骤（1）是将需要组合的菌种种子液分别接入扩培培养基经二～三次扩培。其中所述的乳酸菌菌种较佳地包括嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus），和一种或几种益生菌。
其中所述益生菌（Probiotics）是指能以活菌状态到达胃肠道，通过调节肠道菌群组成，发挥对人体或动物健康起促进作用的单一或特定微生物的混合物益生菌及其代谢产物，包括双歧杆菌；部分革兰氏阳性球菌（如粪链球菌，乳球菌，中介链球菌等）；以及一些酵母菌等。本发明所述益生菌更佳地包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ，CGMCC No.0847）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei BD-II，CGMCC No.0849）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei LC2W，CGMCC No.0828）中的一种或几种。
其中所述的二～三次扩培是指：将保存在一定介质中，处于休眠状态的生产菌种接入无菌培养基活化后，经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种微生物的过程，这些纯种培养物称为种子。本发明较佳地选用斜面培养基保藏的菌种；其中所述的扩培培养基，较佳地是MRS、M17或灭菌脱脂乳，扩培培养基更佳地是无菌脱脂乳。培养条件较佳地为：pH6.2～6.8，发酵罐顶部充入氮气进行厌氧培养，接种量为1～5%（v/v），发酵温度30～45℃，发酵时间6～24h，更佳地培养条件为：接种量为体积百分比2～3%，发酵温度32～44℃，发酵时间8～16h。
本发明所述技术方案步骤（2）是将步骤（1）所得的料液进行离心并回收沉淀。其中较佳的离心条件为1500～5000g，离心时间是10～20min。
本发明所述技术方案步骤（3）是将步骤（2）所得的离心沉淀分别进行无菌水洗涤，并重新悬浮。所述无菌水较佳地为无菌软水，所述无菌水的各项指标较佳地为：有机物含量＜8mg/kg、污染物指数＜3、二氧化硅＜5mg/kg、铁＜0.5mg/kg、锰＜0.5mg/kg，其中所述无菌水洗涤方法较佳地为洗涤1～3次，各菌体重悬浓度较佳的为1.0×1011～9.0×1011cfu/mL。
本发明所述技术方案步骤（4）是将步骤（3）所得的各重悬菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳溶液按比例混合均匀。其中所述组合重悬菌液中活菌数比例较佳地为：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）菌数比例控制在1︰1～1000︰1，每株益生菌与保加利亚乳杆菌菌数比例控制在1︰1～10︰1，所述的重悬菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳混合比例为1︰1～9︰1。
本发明所述的冻干保护剂较佳地包括蔗糖、乳糖、乳清粉和海藻糖中的一种或几种，所述的冻干保护剂在灭菌脱脂乳水溶液中较佳的含量为1～10%。其中所述的含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳水溶液固形物较佳地含量为10～20%，上述百分比均为质量百分比。
本发明所述技术方案步骤（5）是将步骤（4）所得的料液进行真空冷冻干燥。其中所述真空冷冻干燥，较佳地冷冻条件是板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
本发明采取的技术方案之二是：上述方法制得的发酵乳多联乳酸菌发酵剂。其中所述多联乳酸菌发酵剂较佳地为直投式发酵剂。
本发明采取的技术方案之三是：上述发酵乳多联乳酸菌发酵剂在制备发酵乳制品中的用途。其中所述的发酵乳多联乳酸菌发酵剂更佳地是作为直投式发酵剂在制备发酵乳制品中的应用。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供了一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，采用该方法制备的发酵乳直投式发酵剂除了含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）这两种酸奶发酵所需的乳酸菌，还含有1～3株益生菌。本发明制得的多联乳酸菌发酵剂同采用多型号、多菌种发酵剂共同发酵或采用单株冻干菌粉混合制得的多联发酵剂发酵的传统发酵方法相比具有更均匀、批次间产品性能更稳定，使用更方便等优点。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
所用原料的来源和设备的名称规格为：
脱脂乳粉：新西兰恒天然集团；
乳酸菌培养基：M17培养基，MRS培养基和LC琼脂培养基（德国Merck公司）；
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）：丹麦科·汉森公司；
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）：丹尼斯克（中国）有限公司；
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ，CGMCC No.0847）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei BD-II，CGMCC No.0849）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei LC2W，CGMCC No.0828）均由光明乳业研究院发酵剂研究室筛选保藏。
实施例1三联乳酸菌发酵剂
菌种组成及培养条件：
| 菌种 | 培养基 |
| 嗜热链球菌 | M17/脱脂乳 |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | MRS/脱脂乳 |
| 干酪乳杆菌LC2W | MRS/脱脂乳 |
制备方法包括下列步骤：
1）将斜面保存的嗜热链球菌接种至100mL的M17培养基中，45℃厌氧培养6h后得到的含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌株的M17培养基按1%（v/v）的接种量接种于8L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度45℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.2；
2）将步骤1）得到的液体按2%（v/v）的接种于392L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度44℃，培养时间10h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
3）将步骤2）得到的液体按5%（v/v）的接种量接入7600L含有12%（wt）脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度44℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
4）将斜面保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus）菌株的MRS培养基按1%（v/v）的接种量接种于5L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
5）将步骤4）得到的液体按1%（v/v）的接种量接种于495L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度37℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
6）将斜面保存的干酪乳杆菌LC2W接种至100mL的MRS培养基中，30℃厌氧培养6h后得到的含有干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus caseiLC2W）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于4L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度30℃，培养时间24h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
7）将步骤6）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于196L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度32℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
8）将步骤7）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于4800L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
9）将步骤3）得到的液体采用自清式离心机，进行5000g，10min的离心，收集浓缩菌悬液，并用无菌软水洗涤3次；
10）将步骤5）得到的液体采用自清式离心机，进行1500g，20min的离心，收集浓缩菌悬液并用无菌软水洗涤3次；
11）将步骤8）得到的液体采用自清式离心机，进行1500g，20min的离心，收集浓缩菌悬液并用无菌软水洗涤3次；
12）将步骤9）～11）得到浓缩菌体采用血球板显微镜计数，并读取浓缩菌悬液体积刻度数；
13）将步骤12）得到的菌悬液按照嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）：干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）数量比例为1000︰10︰1，进行混合；
14）将步骤13）得到的混合菌悬液与固形物含量为10%（wt）的含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳进行混合，较佳地，本发明采用乳糖作为冻干保护剂，乳糖浓度占灭菌脱脂乳水溶液的1%（wt），将上述混合菌液与含有灭菌脱脂乳水溶液进行混合，比例为9︰1；
15）将步骤14）得到混合液体进行真空冷冻干燥，板层极限温度是-60℃，冷阱极限温度是-70℃，板层装料厚度0.5mm，真空度30Pa；
16）制得发酵乳三联乳酸菌发酵剂。
实施例2四联乳酸菌发酵剂
菌种组成及培养条件：
| 菌种 | 培养基 |
| 嗜热链球菌 | M17/脱脂乳 |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | MRS/脱脂乳 |
| 嗜酸乳杆菌 | MRS/脱脂乳 |
| 干酪乳杆菌BD-Ⅱ | MRS/脱脂乳 |
制备方法包括下列步骤：
1）将斜面保存的嗜热链球菌接种至100mL的M17培养基中，45℃厌氧培养6h后得到的含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌株的M17培养基按1%(v/v)的接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度42℃，培养时间12h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
2）将步骤1）得到的液体按4%(v/v)的接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度42℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
3）将步骤2）得到的液体按2%(v/v)的接种量接入2450L含有12%（wt）脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度44℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
4）将斜面保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus）菌株的MRS培养基按1%(v/v)的接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间12h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
5）将步骤4）得到的液体按4%(v/v)的接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度37℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
6）将步骤5）得到的液体按2%(v/v)的接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度37℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
7）将斜面保存的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h得到的含有嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）菌株的MRS培养基按2%(v/v)接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度32℃，培养时间16h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
8）将步骤7）得到的液体按4%(v/v)接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度32℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
9）将步骤8）得到的液体按2%(v/v)接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
10）将斜面保存的干酪乳杆菌BD-II（Lactobacillus casei BD-II）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有干酪乳杆菌BD-II（Lactobacillus casei BD-II）菌株的MRS培养基按2%(v/v)接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度32℃，培养时间18h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
11）将步骤10）得到的液体按4%(v/v)接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度32℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
12）将步骤11）得到的液体按2%(v/v)接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
13）将步骤3）6）9）12）得到的液体采用固体保留式离心机，进行10000g，60min的离心，收集浓缩菌泥并用无菌软水洗涤1次；
14）将步骤13）洗涤以后的菌泥采用固体保留式离心机，进行10000g，60min的离心，收集浓缩菌泥；
15）将步骤14）得到四种菌泥采用血球板显微镜计数，计算重悬软水的体积并分别重悬；
16）将步骤15）得到的菌悬液按照嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）：干酪乳杆菌BD-II（Lactobacillus casei BD-II）：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus）数量比例为1︰1︰1︰1，进行混合；
17）将步骤16）得到混合菌悬液与固形物含量为20%（wt）的含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳水溶液进行混合，保护剂采用蔗糖、乳糖、乳清粉和海藻糖，总浓度占灭菌脱脂乳水溶液的10%（wt）；其中蔗糖、乳糖、乳清粉和海藻糖在冻干保护剂中所占重量比分别为20%、30%、20%和30%，菌悬液与灭菌脱脂乳的混合比例为1︰1；
18）将步骤17）得到混合液体进行真空冷冻干燥，板层极限温度是-55℃，冷阱极限温度是-70℃。板层装料厚度2.0mm，真空度10Pa；
19）制得发酵乳四联乳酸菌发酵剂。
实施例3五联乳酸菌发酵剂
菌种组成及培养条件：
| 菌种 | 培养基 |
| 嗜热链球菌 | M17/脱脂乳 |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | MRS/脱脂乳 |
| 干酪乳杆菌LC2W | MRS/脱脂乳 |
| 嗜酸乳杆菌 | MRS/脱脂乳 |
| 植物乳杆菌ST-III | MRS |
制备方法包括下列步骤：
1）将斜面保存的嗜热链球菌接种至100mL的M17培养基中，45℃厌氧培养6h后得到的含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌株的M17培养基按1%（v/v）的接种量接种于4L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度45℃，培养时间12h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
2）将步骤1）得到的液体按2%（v/v）的接种于196L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度42℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
3）将步骤2）得到的液体按4%（v/v）的接种量接入4800L含有12%（wt）脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度44℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
4）将斜面保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus）菌株的MRS培养基按1%（v/v）的接种量接种于5L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间12h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
5）将步骤4）得到的液体按1%（v/v）的接种量接种于495L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度37℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
6）将斜面保存的酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度35℃，培养时间16h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
7）将步骤6）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度35℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
8）将步骤7）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
9）将斜面保存的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度32℃，培养时间18h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
10）将步骤9）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度32℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
11）将步骤10）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
12）将斜面保存的植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于2L含有灭菌MRS培养基中，进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间24h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
13）将步骤12）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有灭菌MRS培养基中，进行第2次扩培，培养温度37℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
14）将步骤13）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有灭菌MRS培养基中，进行第3次扩培，培养温度37℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
15）将步骤3）5）9）11）14）得到的液体采用自清式离心机，进行5000g，10min的离心，收集浓缩菌体并用无菌软水洗涤1次，再采用自清式离心机，进行5000g，10min的离心，收集浓缩菌体；
16）将步骤15）得到五种浓缩菌体采用血球板显微镜计数，计算重悬软水的体积并分别重悬；
17）将步骤16）得到菌悬液按照嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）：嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）：植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）数量比例控制在10︰5︰5︰5︰1，进行混合；
18）将步骤17）得到混合菌悬液与固形物含量为20%（wt）的含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳水溶液保护剂采用乳糖，总浓度占灭菌脱脂乳水溶液的1%（wt），菌悬液与灭菌脱脂乳的体积混合比例为1︰1；
19）将步骤18）得到混合液体进行真空冷冻干燥，板层极限温度是-55℃，冷阱极限温度是-70℃，板层装料厚度1.0mm，真空度10Pa；
20）制得发酵乳五联乳酸菌发酵剂。
实施例4五联乳酸菌发酵剂
菌种组成及培养条件：
| 菌种 | 培养基 |
| 嗜热链球菌 | M17/脱脂乳 |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | MRS/脱脂乳 |
| 干酪乳杆菌LC2W | MRS/脱脂乳 |
| 嗜酸乳杆菌 | MRS/脱脂乳 |
| 植物乳杆菌ST-III | MRS |
制备方法包括下列步骤：
1）将斜面保存的嗜热链球菌接种至100mL的M17培养基中，45℃厌氧培养6h后得到的含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌株的M17培养基按1%（v/v）的接种量接种于6L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度40℃，培养时间14h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
2）将步骤1）得到的液体按3%（v/v）的接种于194L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度43℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
3）将步骤2）得到的液体按5%（v/v）的接种量接入3800L含有12%（wt）脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度45℃，培养时间5h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
4）将斜面保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus）菌株的MRS培养基按1%（v/v）的接种量接种于5L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度38℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
5）将步骤4）得到的液体按1%（v/v）的接种量接种于495L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度40℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
6）将斜面保存的酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h得到的含有干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间20h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
7）将步骤6）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度35℃，培养时间12h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
8）将步骤7）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度34℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
9）将斜面保存的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h得到的含有嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）菌株的MRS培养基按3%（v/v）接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度34℃，培养时间20h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.7；
10）将步骤9）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度33℃，培养时间12h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
11）将步骤10）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
12）将斜面保存的植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）接种至100mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h后得到的含有植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）菌株的MRS培养基按5%（v/v）接种量接种于2L含有灭菌MRS培养基中，进行第1次扩培，培养温度36℃，培养时间24h。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
13）将步骤12）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有灭菌MRS培养基中，进行第2次扩培，培养温度37℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.2；
14）将步骤13）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有灭菌MRS培养基中，进行第3次扩培，培养温度37℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
15）将步骤3）5）9）11）14）得到的液体采用自清式离心机，进行10000g，20min的离心，收集浓缩菌体并用无菌软水洗涤1次，再采用自清式离心机，进行8000g，30min的离心，收集浓缩菌体；
16）将步骤15）得到五种浓缩菌体采用血球板显微镜计数，计算重悬软水的体积并分别重悬；
17）将步骤16）得到菌悬液按照嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）：嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）：植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）数量比例控制在20︰8︰8︰8︰1，进行混合；
18）将步骤17）得到混合菌悬液与固形物含量为20%（wt）的含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳水溶液，冻干保护剂采用蔗糖、乳糖和海藻糖，总浓度占灭菌脱脂乳水溶液的8%（wt），其中蔗糖、乳糖和海藻糖在冻干保护剂中所占质量比例分别为30%、40%和30%，菌悬液与灭菌脱脂乳的体积混合比例为2︰1；
19）将步骤18）得到混合液体进行真空冷冻干燥，板层极限温度-65℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度1mm，真空度20Pa；
20）制得发酵乳五联乳酸菌发酵剂。
实施例5五联乳酸菌发酵剂
菌种组成及培养条件：
| 菌种 | 培养基 |
| 嗜热链球菌 | M17/脱脂乳 |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | MRS/脱脂乳 |
| 干酪乳杆菌LC2W | MRS/脱脂乳 |
| 嗜酸乳杆菌 | MRS/脱脂乳 |
| 植物乳杆菌ST-III | MRS |
制备方法包括下列步骤：
1）将斜面保存的嗜热链球菌接种至80mL的M17培养基中，45℃厌氧培养6h后得到的含有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）菌株的M17培养基按1%（v/v）的接种量接种于4L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度45℃，培养时间12h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
2）将步骤1）得到的液体按2%（v/v）的接种于196L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度42℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
3）将步骤2）得到的液体按4%（v/v）的接种量接入4800L含有12%（wt）脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度44℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.8；
4）将斜面保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种至80mL的MRS培养基中，30℃厌氧培养8h后得到的含有德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的MRS培养基按1%（v/v）的接种量接种于5L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间12h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
5）将步骤4）得到的液体按1%（v/v）的接种量接种于495L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度37℃，培养时间8h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
6）将斜面保存的酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h得到的含有干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度35℃，培养时间16h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
7）将步骤6）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度35℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
8）将步骤7）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
9）将斜面保存的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h得到的含有嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于2L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第1次扩培，培养温度32℃，培养时间18h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
10）将步骤9）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第2次扩培，培养温度32℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
11）将步骤10）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有12%（wt）灭菌脱脂乳粉的水溶液中，进行第3次扩培，培养温度32℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
12）将斜面保存的植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）接种至80mL的MRS培养基中，37℃厌氧培养8h得到的含有植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）菌株的MRS培养基按2%（v/v）接种量接种于2L含有灭菌MRS培养基中，进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间24h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
13）将步骤12）得到的液体按4%（v/v）接种量接种于48L含有灭菌MRS培养基中，进行第2次扩培，培养温度37℃，培养时间10h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
14）将步骤13）得到的液体按2%（v/v）接种量接种于2450L含有灭菌MRS培养基中，进行第3次扩培，培养温度37℃，培养时间6h；培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵，pH恒定在6.5；
15）将步骤3）5）9）11）14）得到的液体采用自清式离心机，进行5000g，10min的离心，收集浓缩菌体并用无菌软水洗涤1次，再采用自清式离心机，进行5000g，10min的离心，收集浓缩菌体；
16）将步骤15）得到五种浓缩菌体采用血球板显微镜计数，计算重悬软水的体积并分别重悬，其中嗜热链球菌菌数为1.0×1011，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌数为5.0×1010，干酪乳杆菌LC2W菌数为5.1×1010，嗜酸乳杆菌菌数为4.9×1010，植物乳杆菌ST-III菌数为9.9×109；
17）将步骤16）得到菌悬液按照嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：干酪乳杆菌LC2W（Lactobacillus casei LC2W）：嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）：植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ）：德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）数量比例控制在10︰5︰5︰5︰1，进行混合；
18）将步骤17）得到混合菌悬液与固形物含量为20%（wt）的含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳水溶液，保护剂采用乳糖，总浓度占灭菌脱脂乳水溶液的1%（wt）体积混合比例为1︰1；
19）将步骤18）得到混合液体进行真空冷冻干燥，板层极限温度是-55℃，冷阱极限温度是-70℃，板层装料厚度1.0mm，真空度10Pa；
20）制得发酵乳五联乳酸菌发酵剂。
效果实施例1验证实施例1三联乳酸菌活菌数及比例
菌体计数方式采用平板浇注法，即将实施例1制得的发酵剂用无菌生理盐水（0.85%的NaCl溶液）进行1/10的梯度稀释，至合适稀释梯度，吸取1mL菌体稀释液并转移至无菌平板上，待无菌琼脂培养基（嗜热链球菌采用M17琼脂培养基计数，保加利亚乳杆菌用MRS琼脂培养基计数，干酪乳杆菌采用LC琼脂培养基计数）冷却至45～50℃时，倾倒20～25mL于含有菌体稀释液的平板上，混匀并静置冷却。每个样品进行3次平行试验。冷却、凝固的平板放置于厌氧培养箱中倒置培养（培养温度和时间依据菌种而定）。培养结束后进行计数。
表1.三联乳酸菌发酵剂活菌数量比
效果实施例2验证实施例3五联乳酸菌活菌数及比例
菌体计数方式采用平板浇注法，即将实施例3制得的发酵剂用无菌生理盐水（0.85%的NaCl溶液）进行1/10的梯度稀释，至合适稀释梯度，吸取1mL菌体稀释液并转移至无菌平板上，待无菌琼脂培养基（嗜热链球菌采用M17琼脂培养基计数，保加利亚乳杆菌用MRS琼脂培养基计数，干酪乳杆菌采用LC琼脂培养基计数，嗜酸乳杆菌采用MRS-麦芽糖琼脂培养基计数，植物乳杆菌采用MRS-山梨醇琼脂培养基计数）冷却至45～50℃时，倾倒20～25mL于含有菌体稀释液的平板上，混匀并静置冷却。每个样品进行3次平行试验。冷却、凝固的平板放置于厌氧培养箱中倒置培养（培养温度和时间依据菌种而定）。培养结束后进行计数。
表2.五联乳酸菌发酵剂活菌数量比
从效果实施例中不难看出：采用分别培养后进行混合制备的多联乳酸菌发酵剂，较常规采用多菌株共生培养制备的多联乳酸菌发酵剂，具有各菌株浓度精确可控、批次间产品性能稳定的优势。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (3)
1.一种发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将需要组合的菌种种子液分别接入扩培培养基经二～三次扩培，将所需菌种按体积百分比1～5%接种到扩培培养基中，发酵温度30～45℃，发酵时间6～24h，培养过程中维持pH恒定在6.2～6.8，菌种是德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和益生菌，所述益生菌包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-ⅢCGMCC No.0847、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）BD-II CGMCC No.0849和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）LC2WC GMCC No.0828中的一种或几种；
(2)将步骤（1）所得的料液分别进行离心回收沉淀；
(3)将步骤（2）所得的离心沉淀分别用无菌水洗涤并重新悬浮；
(4)将步骤（3）所得的各重悬菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳溶液按比例混合均匀，其中嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）的菌数量比例为1︰1～1000︰1，每株益生菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌数量比例为1︰1～10︰1；重悬混合菌液与含有冻干保护剂的灭菌脱脂乳的体积比为1︰1～9︰1，冻干保护剂包括蔗糖、乳糖、乳清粉和海藻糖中的一种或几种，所述冻干保护剂在灭菌脱脂乳溶液中的质量百分比浓度为1～10%；
(5)将步骤（4）所得的料液进行真空冷冻干燥即得。
2.如权利要求1所述的发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的扩培培养基是灭菌脱脂乳。
3.如权利要求1所述的发酵乳多联乳酸菌发酵剂的制备方法，其特征 在于，所述步骤（3）中无菌水是无菌软水，菌体重悬浓度为1.0×1011～9.9×1011cfu/mL。
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