CN105543193A - 一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌。所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明还公开了含有所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因的重组菌，所述重组菌是将所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因构建大肠杆菌重组表达载体，然后导入到大肠杆菌中，筛选得到表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的转基因重组菌。本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)均有良好的降解作用。

Description

一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌。

背景技术

与高等多细胞生物一样，很多单细胞的原核细菌个体之间也可以通过分泌一些信号分子来相互交流信息，感应周围环境中种群的密度，协调彼此之间的行为，在不同群体密度情况下，表现出不同的行为，从而更好的适应周围环境的变化，增加生存的能力，这种现象被命名为群体感应(Quorumsensing，QS)。

很多植物病原菌的致病性群体感应系统的机制调控，而以细菌群体感应系统为靶标的群体淬灭(QuorumQuenching，QQ)已被证明是防治这一类细菌性病害的有效策略。群体淬灭研究中，降解AHL信号分子(N-酰基高丝氨酸内酯)的酶已被证实能有效的干扰细菌的群体感应系统，并且能通过基因工程生防菌或转基因植物的方法减轻病害(Dong,Y.H.,Wang,L.H.,Xu,J.L.,Zhang,H.B.,Zhang,X.F.,andZhang,L.H.(2001).Quenchingquorum-sensing-dependentbacterialinfectionbyanN-acylhomoserinelactonase.Nature411,813-817.)。

2000年，Dong等筛选到一株能特异性降解AHL类信号分子的芽孢杆菌，并从中分离到一个大小为750bp的基因，命名为aiiA基因，编码250个氨基酸的酶，该酶与其他已知的酶没有显著的同源性，是一种全新的酶。将aiiA基因转入致病菌胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)SCG1后，显著减少了后者AHL类信号分子的产生，降低了其对马铃薯、胡萝卜等的致病性。将该基因转入烟草、马铃薯后，这些植物对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1导致的软腐病抗性大大增强(DongY.H.,etal.,AiiA,anenzymethatinactivatestheacylhomoserinelactonequorum-sensingsignalandattenuatesthevirulenceofErwiniacarotovora.ProcNatlAcadSciUSA,2000.97(7):3526-3531)。继续研究表明，该酶是通过打开AHL分子的内酯环而使其生物活性大大降低，因此被命名为N-酰基高丝氨酸内酯酶，即AHL内酯酶(AHL-lactonase)。AHL内酯酶的发现与潜在的巨大应用价值引起了人们的巨大关注，很多地方的研究者投入到寻找新的AHL内酯酶的研究工作中。

发明内容

本发明的目的是，提供一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌。旨在提供一种新型的N-酰基高丝氨酸内酯酶，为N-酰基高丝氨酸内酯酶的研究和应用奠定基础。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明提供的N-酰基高丝氨酸内酯酶，其氨基酸序列的编码序列克隆自保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心的盐渍盐单胞菌MCCC1A01339(Halomonassalaria)。

本发明还提供了所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因。

优选地，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明是通过构建一株盐渍盐单胞菌的基因组文库，通过以功能驱动的蓝白斑筛选得到AHL降解酶，通过分析确认该酶为N-酰基高丝氨酸内酯酶，然后设计特异性引物从盐渍盐单胞菌中克隆得到N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因。所采用的实验方法包括基因组文库构建技术；聚合酶链式反应(PCR)技术、DNA的提取、酶切、连接、蓝白斑筛选等常规的分子生物学技术，构建一株盐渍盐单胞菌的Fosmid基因组文库，通过以功能驱动的蓝白斑筛选AHL降解酶并得到Fosmid阳性克隆，序列测定得到AHL降解酶的一段开放阅读框(ORF)，然后通过序列比对、生物信息学分析及高效液相色谱检测等方法确定该酶为N-酰基高丝氨酸内酯酶。之后以盐渍盐单胞菌总DNA为模板，扩增出一段N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因的DNA序列，把这一段DNA序列连接到表达载体如pET-28a等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，进一步确定基因的功能和酶学性质。这一段DNA序列与前人所发现的N-酰基高丝氨酸内酯酶在基因来源、DNA和氨基酸大小、酶的分子大小、酶的活性等方面都不同。

本发明还提供了含有所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因的重组载体。

优选地，所述的重组载体是将所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的重组表达载体。所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-28a载体。

本发明还提供了含有所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因的转基因细胞系或重组菌。

优选地，所述重组菌是将所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的转基因重组菌。所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供所述的重组菌在生产N-酰基高丝氨酸内酯酶中的应用。

本发明还提供所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶在降解N-酰基高丝氨酸内酯中的应用。降解N-酰基高丝氨酸内酯时，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶适合的反应温度为30～50℃，反应pH值为7.0以上。

本发明还提供一种生产N-酰基高丝氨酸内酯酶的方法，该方法为：将权利要求6所述的重组菌进行发酵培养，将培养后的重组菌体破壁后进行分离纯化，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶。

本发明从盐渍盐单胞菌中得到的N-酰基高丝氨酸内酯酶具有以下特征：

1.该N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因长度为786bp，编码261个氨基酸，分子量约为29kDa；

2.该N-酰基高丝氨酸内酯酶最适温度为40℃，适合反应温度范围为30～50℃(若无特殊说明，该N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活测定以OOHL分子为基准底物，下同)；

3.该N-酰基高丝氨酸内酯酶的适合反应pH为7.0以上；

4.二价金属离子的浓度在1mM时，锌离子对于酶活有60％的提高，钴离子和EDTA对于酶活没有影响，铜离子、钙离子、亚铁离子、镁离子和锰离子对酶活有抑制作用。

5.该N-酰基高丝氨酸内酯酶对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)均有良好的降解作用，但对不同底物的活性不同。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1，本发明提供的N-酰基高丝氨酸内酯酶可以水解多种AHL类分子，对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)均有良好的降解作用，为系统进行新型N-酰基高丝氨酸内酯酶关于生物防治的后续研究及开发利用奠定了基础。

2，本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶在天然的盐渍盐单胞菌中含量很低，较难检测到酶的活性，无法直接利用天然的盐渍盐单胞菌得到的N-酰基高丝氨酸内酯酶进行应用研究，应用基因工程菌来表达本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶，可以使酶的活力提高数倍。

附图说明

图1是通过设计特异引物克隆获得的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因序列的电泳结果图。

图2是重组菌BL21(DE3)诱导表达后的N-酰基高丝氨酸内酯酶的SDS-PAGE蛋白电泳图。

图3是纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶的SDS-PAGE蛋白电泳图。

图4是pH对N-酰基高丝氨酸内酯酶活力的影响曲线图。

图5是温度对N-酰基高丝氨酸内酯酶活力的影响曲线图。

图6是不同种类的金属离子对N-酰基高丝氨酸内酯酶活力的影响示意图。

图7是N-酰基高丝氨酸内酯酶对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)底物的酶活力示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1：盐渍盐单胞菌的培养

将盐渍盐单胞菌(Halomonassalaria，菌株编号：MCCC1A01339，中国海洋微生物菌种保藏管理中心)接种于液体培养基中，所述液体培养基的组分配比为：蛋白胨(peptone)10g/L，酵母提取物(yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)30g/L，pH值为7.0。然后在30℃，200rpm恒温摇床振荡培养48h，于10,000rpm离心2min收集菌体用于总DNA的提取。

实施例2：盐渍盐单胞菌基因组文库构建及AHL信号分子降解酶阳性克隆的筛选

采用文库构建试剂盒(CopyControl^TMFosmidLibraryProductionKit，购自epicentre公司)构建出一株盐渍盐单胞菌的Fosmid基因组文库，通过以功能驱动的蓝白斑筛选AHL降解酶并得到Fosmid阳性克隆，序列测定得到AHL降解酶的一段开放阅读框(ORF)，然后通过序列比对、生物信息学分析及高效液相色谱检测等方法确定该酶为N-酰基高丝氨酸内酯酶。该N-酰基高丝氨酸内酯酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

实施例3：N-酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆与表达载体构建

根据筛选得到的盐渍盐单胞菌中存在的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因核苷酸序列，设计特异性引物扩增该基因并连接到表达载体pET-28a(购自Novagen公司)上，然后导入大肠杆菌进行表达。设计引物如下：

上游引物：5’-GACGTGCATATGGCCGCTCCACGTCTCTATATG-3’(如SEQIDNO：3所示)

下游引物：5’-GCTGAATTCTCAAGCGTAGTATTCCGGGGC-3’(如SEQIDNO：4所示)。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸5min。

上下游引物的5’端分别设计了NdeI及EcoRI(下划线标出)酶切位点用于连接到表达载体pET-28a，用设计好的引物扩增可能为N-酰基高丝氨酸内酯酶基因的DNA序列，将PCR扩增产物进行电泳检测，电泳结果参见图1，第1泳道所示，扩增产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，然后利用NdeI及EcoRI进行双酶切，与同样利用NdeI及EcoRI进行双酶切的表达载体pET-28a进行连接，连接产物经转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TAKARA公司)，筛选验证得到表达重组质粒。同时，将重组质粒送到苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析，经测序所述N-酰基高丝氨酸内酯酶基因的DNA序列为序列表中SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

实施例4：重组N-酰基高丝氨酸内酯酶的诱导表达及纯化

把构建的表达重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞(购自TAKARA公司)中，挑取转化子于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃200rpm摇床中培养，当OD600达到0.8左右时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度达到0.2mM，在20℃下继续培养18h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用细胞悬浮缓冲液洗涤菌体两次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液重选菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破壁，破壁至菌液澄清，10,000r/min离心5min收集上清，所收集的上清液即为N-酰基高丝氨酸内酯酶的粗酶液。

清洗并再生HisTrapTMHP镍柱(购自GE公司)，柱平衡后将粗酶液用0.22μm滤膜过滤，上样经过HisTrapTMHP镍柱，流穿两次，收集蛋白混合液流经结合柱没有结合部分；用10倍柱床体积的startingbuffer冲洗镍柱，除去镍柱的杂蛋白；开始用5倍柱床体积的含20mM咪唑的startingbuffer进行洗脱，将柱上的非特异性杂质洗去，并对洗脱液进行收集；接着依次用5倍柱床体积的含40mM，60mM，80mM，100mM，200mM，300mM和500mM咪唑的startingbuffer进行洗脱，分别对洗脱液进行收集，SDS-PAGE检测洗脱目的蛋白条带；发现含200mM咪唑的洗脱液中获得纯化的目的蛋白，继而通过脱盐柱去除buffer中的咪唑，得到纯化后的酶液。参见图2和图3，其中图2是重组菌BL21(DE3)诱导表达后的N-酰基高丝氨酸内酯酶的SDS-PAGE蛋白电泳图。图3是纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶的SDS-PAGE蛋白电泳图。

纯化蛋白所用缓冲液(startingbuffer)：20mM磷酸缓冲液(Na₂HPO₄和NaH₂PO₄，pH＝7.0)，200mMNaCl，10％甘油。

实施例5：纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶降解AHL分子产物的分析

利用高效液相色谱仪(HPLC)来进行N-酰基高丝氨酸内酯酶降解AHL分子产物的分析，色谱柱为EcipseExtend-C18(购自安捷伦公司)，5μm，4.6×250mm，Agilent，USA；流动相为60％乙醇，40％水；流速为1.0ml/min。酶反应取100μl，以pH为7.4的磷酸盐缓冲液，温度为30℃，1mM的OOHL分子为反应底物，加入1μl酶液的反应体系作为对照，以对照的酶活力作为100％。用终浓度为2％的SDS终止酶反应。

(1)最适反应pH分析：

分别用pH为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0和8.0的缓冲液(pH3-5为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH6-8为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液)配制1mM的OOHL溶液，分别取100μl加入1μl的实施例4中得到的酶液，分别在30℃反应30min，后置于95℃5min使酶失活。然后用HPLC分析反应的产物组分，以降解掉的OOHL的含量来表示酶活力的大小，结果参见图4。结果表明：N-酰基高丝氨酸内酯酶适于反应的pH为7.0以上。

(2)最适反应温度分析：

取100μl，pH为7.4的1mMOOHL底物加入1μl酶液，然后分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃不同的反应温度下反应30min，后用终浓度为2％的SDS终止酶反应。然后用HPLC分析反应的产物组成，以降解掉的OOHL的含量来表示酶活力的大小，结果参见图5。结果表明：N-酰基高丝氨酸内酯酶的适于反应的温度范围为30～40℃，在40℃时N-酰基高丝氨酸内酯酶具有最高酶活。

(3)金属离子对酶活的影响

取100μl，pH为7.4的1mM的OOHL底物加入1μl酶液，再加入1μl不同种类的金属离子和EDTA，使金属离子在反应液的终浓度达到1mM，在30℃反应30min，后用终浓度为2％的SDS终止酶反应。通过测定反应体系中的降解掉的OOHL的含量来反应酶活力的变化，结果参见图6。结果表明：二价金属离子的浓度在1mM时，锌离子对于酶活有60％的提高，钴离子和EDTA对于酶活没有影响，铜离子、钙离子、亚铁离子、镁离子和锰离子对酶活有抑制作用。

(4)N-酰基高丝氨酸内酯酶的底物特异性测定

取100μl，pH7.4的1mM不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)作为底物，包括C4-HSL、C6-HSL、3-oxo-C6-HSL、C8-HSL、3-oxo-C8-HSL(OOHL)、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C12-HSL、C14-HSL及3-oxo-C14-HSL分子(购自Cayman公司)。在30℃反应30min，再用终浓度为2％的SDS终止酶反应。然后通过测定反应体系中的降解掉的不同AHL分子的含量来反应酶活力，结果如图7所示。结果表明：N-酰基高丝氨酸内酯酶对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯均有较好的降解能力。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>中国科学院上海高等研究院

<120>一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌

<130>2016

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>786

<212>DNA

<213>盐渍盐单胞菌（Halomonassalaria）

<400>1

atggccgctccacgtctctatatgttccagacaggaacgctgaagtgtcgtgtgtgcaac60

atcaagatgaacgcgggactggatgattacgagatccccgttccctggtatctgatcact120

catcccaagggcaacgtggtcatcgacggcgggtgcgcggtcgaatgcgcgagcgatccg180

aagggatactggggcgatatcacttctgtctactggccggtcatgcgggaagaagagggc240

tgcgtccaggccttgaaggcgttcgggatcgaacccgccgacgttcgctatgttctgcac300

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gtggtgaccggacacgatcccgaggcatggccaaccttccgtcacgccccggaatactac780

gcttga786

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>盐渍盐单胞菌（Halomonassalaria）

<400>2

MetAlaAlaProArgLeuTyrMetPheGlnThrGlyThrLeuLysCys

151015

ArgValCysAsnIleLysMetAsnAlaGlyLeuAspAspTyrGluIle

202530

ProValProTrpTyrLeuIleThrHisProLysGlyAsnValValIle

354045

AspGlyGlyCysAlaValGluCysAlaSerAspProLysGlyTyrTrp

505560

GlyAspIleThrSerValTyrTrpProValMetArgGluGluGluGly

65707580

CysValGlnAlaLeuLysAlaPheGlyIleGluProAlaAspValArg

859095

TyrValLeuHisSerHisLeuHisLeuAspHisThrGlyAlaThrGly

100105110

ArgPheProAsnAlaIleHisIleValArgArgCysGluTyrGluTyr

115120125

AlaMetAlaProAspTrpPheSerAlaGlyGlyTyrIleArgAlaAsp

130135140

PheAspArgProAspValLysTrpHisLeuLeuGluAspHisAspAsp

145150155160

GlyTyrAspValPheGlyAspAspThrIleArgPheIlePheThrPro

165170175

GlyHisAlaProGlyHisSerSerPheLeuLeuArgLeuProGluThr

180185190

GlyProValLeuLeuAlaValAspAlaAlaTyrThrThrAspHisTrp

195200205

AspGluLysAlaLeuProGlyPheLeuAlaSerThrValAspAlaVal

210215220

ArgSerValArgLysLeuHisAlaLeuAlaGluLysThrGlyAlaLeu

225230235240

ValValThrGlyHisAspProGluAlaTrpProThrPheArgHisAla

245250255

ProGluTyrTyrAla

260

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gacgtgcatatggccgctccacgtctctatatg33

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gctgaattctcaagcgtagtattccggggc30

Claims (10)

1.一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，其特征在于：所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.权利要求1所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因。

3.如权利要求2所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体为权利要求2或3所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求2或3所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的转基因重组菌。

8.权利要求6所述的重组菌在生产N-酰基高丝氨酸内酯酶中的应用。

9.权利要求1所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶在降解N-酰基高丝氨酸内酯中的应用。

10.一种生产N-酰基高丝氨酸内酯酶的方法，该方法为：将权利要求6所述的重组菌进行发酵培养，将培养后的重组菌体破壁后进行分离纯化，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶。