CN106967661B - 一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用 - Google Patents

一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用。所述高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，以E.coli Arctic ExpressTM(DE3)为表达载体，整合有aiiA目的基因，能够在培养过程中高产酰基高丝氨酸内酯酶AiiA，抑制循环冷却水系统中的微生物污染，尤其是对循环冷却水系统存在的大量浮游微生物抑制效果明显。

Description

一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系 统中的应用
技术领域
本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌及其在循环冷却水系统中的应用。
背景技术
工业用水约占城市用水的80％，而其中冷却用水又约占工业用水的80％，提高冷却用水的重复利用率，节能减排是目前工业用水的通用方法。但由于循环冷却水的温度、pH值适宜多种微生物的生长，随着空气中的微生物不断进入循环冷却水系统，微生物大量繁殖带来了生物粘泥、腐蚀、结垢、换热效率降低等一系列危害。传统抑制微生物污染的物理化学法会带来二次污染，因此，寻求一种有效且绿色环保的抑制循环冷却水系统微生物污染的方法具有重要的意义。
群体感应(Quorum sensing，简称为QS)是细菌根据种群密度大小进行种内或种间的一种基因调控机制，这有助于单细胞细菌在复杂多变的环境中增加生存机会。细菌通过分泌并释放一类叫做自诱导物(Autoinducer)的小分子来进行种内和种间的交流，自诱导物又称信号分子(Signal molecule)。信号分子浓度随细菌种群密度的增加而增加。当信号分子在体系中的浓度达到一定阈值时，则会激活某些特定基因的表达从而实现细菌种内或种间的一些群体行为，如生物发光、生物膜的形成、致病基因的表达、色素的产生、抗生素的合成等，细菌的QS系统在微生物学、医学、环境微生物学等领域都扮演着重要的角色。
有研究报道循环水系统中信号分子浓度与微生物污染程度成正比，这意味着通过调节信号分子浓度来缓解微生物污染是可行的。
近年来，已有将细菌群体淬灭效应用于抑制微生物污染的研究报道，但现有的群体淬灭细菌，群体感应淬灭酶的表达低，抑制活性不高，无法实现工业化应用；且发明人对循环冷却水系统中的微生物抑制效果研究发现，现有的群体感应淬灭菌对循环水系统中的浮游微生物抑制效果不明显，目前尚未见到群体淬灭细菌应用于循环冷却水处理领域的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种高产酰基高丝氨酸内酯酶AiiA的工程菌，所述工程菌能够在培养过程中高产率地产生AiiA，且培养后上清液投加入循环冷却水系统中能抑制其中的微生物污染，尤其是对其中存在的大量浮游微生物抑制效果明显。
本发明的第二个目的是提供本发明工程菌在抑制循环冷却水系统中微生物污染的用途。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种高表达酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，以E.coli Arctic ExpressTM(DE3)为表达载体，整合有aiiA目的基因。
根据本发明的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，所述的aiiA目的基因序列的序列号为DQ440581.1。
根据本发明的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，其构建方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增：以表1中的序列为引物，以B.thuringiensi基因组DNA为模版，PCR扩增aiiA基因序列并纯化；
表1
Figure BDA0001264786380000021
引物划线部分为Nde I和Xba I限制性酶切位点；
(2)克隆：将步骤(1)获得的aiiA基因序列克隆到pCzn1载体上得到重组质粒pCzn1-aiiA；
(3)转化：将步骤(2)获得的重组表达质粒pCzn1-aiiA转化到E.coli ArcticExpressTM(DE3)中得到本发明的工程菌。
根据本发明的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，其中步骤(1)中所述的B.thuringiensi基因组DNA是将B.thuringiensi接种至50mL LB培养基中，200rpm震荡培养至稳定期后，提取B.thuringiensi的基因组DNA得到。
根据本发明的高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，其中步骤(2)中所述的重组质粒pCzn1-aiiA转化入E.coli TOP10克隆菌株阳性筛选，所得的阳性克隆子测序，并以限制性内切酶Nde I和Xba I验证。
本发明的第二方面是提供本发明制备的工程菌在抑制循环冷却水系统中微生物污染的用途，尤其是在抑制循环冷却水系统中浮游微生物污染的用途。循环冷却水系统中包含着两种不同的微生物种群：存在于循环冷却水整体流动中的浮游微生物和在生物粘泥中的附着微生物，一般以循环水系统中浮游微生物数量为监测目标评价水质的好坏。本发明人发现，现有的群体淬灭菌，如B.thuringiensi等，对循环冷却水系统中的浮游微生物抑制效果不明显，一般不超过20％，而本发明的工程菌，对循环冷却水系统中的浮游微生物抑制率可高达73％，可应用于工业循环冷却水微生物、尤其是浮游微生物污染的抑制。
附图说明
图1是本发明实施例1步骤(1)PCR扩增得到的aiiA序列的琼脂糖凝胶电泳图，其中，M为DL2000 DNA Marker；1为aiiA目的基因；
图2是本发明实施例1步骤(2)制备的重组质粒pCzn1-aiiA的结构示意图。
具体实施方式
本发明使用的实验材料和药品均可商购获得。
实施例1 工程菌的构建
1.1试剂和耗材
Protein Marker，购自Thermo公司；IPTG、Acr、Bis、Tris，购自Sigma公司；福氏佐剂，购自Sigma公司；SDS/十二烷基硫酸钠、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，购自Solarbio公司；TEMED，购自BIO-RAD公司；X-Gal，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；Tyrptone、YeastExtract，购自OXOID公司；PCR反应管，购自Fisher公司；0.22μm无菌滤器和透析袋，购自Millipore公司；Ni2+-IDA亲和层析胶，购自Novagen公司；Agarose，购自上海基因公司；GoodView核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；DNA胶纯化试剂盒，购自AXYGEN公司；PCR产物纯化试剂盒，购自novoprotein公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.2仪器
Allegra 21R台式高速冷冻离心机，购自美国BECKMAN公司；台式高速离心机，购自德国SORVAL公司；Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、GelDoc2000成像系统、水平电泳系统，购自美国BIO-RAD公司；PTC-200基因扩增仪，购自美国MJResearch公司；320-S pH计，购自美国Mettler Toledo公司；AR5120电子天平，购自美国AHOMS公司；MultiTemp III恒温水浴锅、HoferΜV-25紫外透射仪，购自美国AmershamPharmacia公司；雪花状制冰机，购自日本SANYO公司；JY92-2D超声波细胞粉碎机，购自中国新芝科器研究所；超净工作台，购自中国苏净集团；NANODROP2000，购自Thermo公司。
1.3菌株和载体
B.thuringiensi由本实验室分离保存，可以对外公开发放；pCzn1质粒，由南京钟鼎生物公司保存；E.coli TOP10克隆菌株，由南京钟鼎生物技术有限公司保存；E.coliArctic ExpressTM(DE3)表达菌株，购自购自安捷伦公司，由南京钟鼎生物技术有限公司保种。
1.4溶液及其配制
LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1L，调节pH为7.0，121℃灭菌20min，固体培养基以1.5％比例加入琼脂。
DNA提取溶液由以下几部分组成：
①TE缓冲液(pH＝8.0)：量取10mM Tris-HCl Buffer(pH为8.0)100mL，1mm EDTA(pH为8.0)20mL，加入80mL的去离子水，定容至1L，混合均匀后高温高压灭菌；
②SDS溶液(w/v＝10％)：称量10g高纯度的SDS置于200ml烧杯中，加入约80ml的去离子水，68℃水浴搅拌使其溶解，再将溶液定容至100ml后，室温保存；
③蛋白酶K(20mg/mL)：称取200mg蛋白酶K，添加8mL蒸馏水，轻轻晃动至蛋白酶K溶解，加水定容至10mL后分装至离心管中，-20℃下冷冻保存；
④NaCl(5mol/L)：称取292.5g NaCl，加蒸馏水溶解后定容至1L，室温保存；
⑤CTAB/NaCl溶液：称取4.1g NaCl溶解于80mL蒸馏水中，缓慢加入10g CTAB，再加热至65℃使其溶解，定容至100mL，室温保存；
⑥70％乙醇：量取70mL无水乙醇到量筒中，加蒸馏水定容至100mL，混合均匀，装入试剂瓶中室温保存。
琼脂糖凝胶电泳试剂配制：
①Tris-乙酸(TAE)：50×贮存液(每升)：242g Tris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mmol/L EDTA(pH为8.0)，电泳时稀释成1×浓度使用；
②琼脂糖制胶：用1×TAE将琼脂糖配制成1％，加热溶解后加入GoodView核酸染料(100mL加入4μL)。
感受态细胞溶液的制备：配制0.1M CaCl2，于121℃灭菌20min，4℃保存备用。
质粒提取溶液的制备：
①TE缓冲液，同上；
②溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH为8.0)，10mmol/L EDTA(pH为8.0)，121℃高温灭菌后，4℃备用；
③溶液II：0.2mol/L NaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)，1％SDS(现配现用)；
④溶液III：冰醋酸11.5mL，5mol/L乙酸钾60mL，无菌水28.5mL；所配成溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L；
⑤3M乙酸钠(pH5.2)：在800mL水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2，加水定容至1L，分装后灭菌备用；
⑥卡那霉素(kan)：50mg/mL；
⑦氨苄青霉素(Amp)：100mg/mL；
⑧IPTG：1g IPTG溶于5mL水，0.22μm滤膜过滤后并灭菌，-20℃保存备用。
1.5工程菌构建
步骤(1)PCR扩增：
首先，提取B.thuringiensi基因组DNA，具体方法为将本实验室保存的B.thuringiensi甘油保种液接种到装有50mL的LB培养基中，于37℃，200rpm震荡培养至稳定期，取50mL培养至稳定期的B.thuringiensi培养液，10000rpm离心10min，去上清液；加9.5mL TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10％SDS，50μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀；加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管；用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中；加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min沉淀DNA；用玻璃棒捞出DNA沉淀，经70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE得到B.thuringiensi基因组DNA为模版，-20℃保存，如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，得到B.thuringiensi基因组DNA为模版，-20℃保存。
然后，以得到的以B.thuringiensi基因组DNA为模版，利用表1中的特异性引物PCR扩增aiiA目的基因并纯化。PCR反应体系50μL：10×PCR buffer，5μL；MgCl2(25mM)，5μL；dNTP(20mM)，4μL；DNA模版，2μL；Primer 1(20μM)，2μL；Primer 2(20μM)，2μL；ddH2O，补足至50μL。PCR反应条件为：95℃预反应5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，反应循环30次；72℃延伸5min；15℃保温。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析得到其大小约为750bp，见图1。纯化：取PCR扩增产物4μL进行琼脂糖凝胶电泳，将得到的清晰条带的PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。具体步骤为：在1倍体积的PCR反应物中加入2倍体积的Binding Buffer，翻转充分混匀；将上述混合液加入DNA纯化柱内，如果溶液体积>700μL，分次转移溶液；室温放置1-2min或更长时间；13000rpm离心1min，弃废液；目的DNA长度≤500bp时，离心结束后将收集管中的溶液再次转入DNA纯化柱中，离心；在DNA纯化柱中加入650μL Wash Buffer，13000rpm离心30s，弃废液，将DNA纯化柱放回收集管；重复上一步；13000rpm离心3min，以去除柱中残余乙醇；将纯化柱放入新的离心管中，向柱中加入在60℃下预热的30-50μL Elution Buffer或ddH2O，室温放置1-2min或更长时间。
步骤(2)克隆并验证：
将步骤(1)扩增纯化的PCR产物克隆至pCzn1载体得到重组质粒，将重组质粒转入E.coli TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果与预期序列进行比对，100％匹配，说明克隆出的基因序列为目的基因。具体方法为：将含有重组质粒pCzn1-aiiA的E.coliTOP 10接种至含有100μg/mL Amp的LB液体培养基中，28℃摇床培养过夜；吸取1mL培养好的菌液，12000r/min离心5min，弃去上清液；加入500μL TE Buffer，12000rpm离心5min；将收集的菌体重悬于预冷的100μL溶液I中，剧烈震荡，使菌体充分悬浮，分散，冰浴5min；将悬液中加入200μL溶液II中，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴状态，此时不能震荡；5min内加入150μL溶液III中，轻柔颠倒5～10次，冰浴10min；4℃下12000rpm离心10min，沉淀染色体DNA及不溶的变性蛋白质，吸取上清转移到另一离心管中；加等量的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提两次，每次剧烈震荡20s，12000rpm高速冷冻离心5min，可见溶液分为三层，上层即为质粒DNA溶液；将上清液转移到另一离心管中，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次，12000rpm高速冷冻离心10min；加入十分之一体积的3M NaCl，两倍体积预冷的无水乙醇，混匀后于室温下沉淀质粒DNA，离心后弃去上清；加入1mL 75％乙醇，洗涤沉淀、离心、风干后，加入36μL TE溶解DNA，加入1.5M RnaseA得到重组质粒pCzn1-aiiA，室温放置30min后于-20℃保存备用。以限制性内切酶Nde I和Xba I分别对测序正确的重组质粒pCzn1-aiiA进行双酶切鉴定，双酶切反应体系为：重组质粒3μL；Nde I，0.25μL；Xba I，0.25μL；10×Buffer，1.0μL；ddH2O补足至10μL。酶切反应液经琼脂糖电泳鉴定，显示aiiA基因已克隆到了pCzn1载体，重组质粒构建成功。其中pCzn1为具有低温诱导的特别原核表达载体，载体自身携带6×His标签蛋白，可以使用Ni纯化体系亲和纯化获得高纯度重组蛋白。
步骤(3)转化：
将步骤(2)克隆得到的重组质粒pCzn1-aiiA转化至E.coli Arctic ExpressTM(DE3)中，制备得到基因工程菌E.coli AE(DE3)-pCzn1-aiiA。具体方法为：将1μL重组质粒pCzn1-aiiA加入100μL E.coli Arctic ExpressTM(DE3)感受态细菌中，置冰上20min；42℃热激90s，迅速置冰中5min；加入600μL 37℃预热的LB培养基；37℃，220rpm震荡1h，离心后全部涂布于含50μg/mL Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。
实施例2 对群体感应信号分子的降解
2.1实验对象：本实验室保存的B.thuringiensis和实施例1制备的基因工程菌；
2.2培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，调节pH至7.0，121℃高温灭菌20min后加入氨苄青霉素至100μg/mL。
2.3培养方法：将本实验室保存的B.thuringiensis和实施例1制备的基因工程菌在30℃，140r/min条件下培养至稳定期，取培养好的菌液于冷冻离心机中13700rpm离心20min，取上清液备用。
2.4底物：信号分子标准品C6-HSL，购自Sigma公司。
2.5实验过程：量取1L浓度为200μg/L的信号分子标准品C6-HSL于A、B两个反应瓶中，A反应瓶中加入B.thuringiensis菌液离心上清液10mL，B反应瓶中加入工程菌菌液离心上清液10mL，30℃，pH为9条件下反应30min，使用高效液相色谱-串联质谱仪测定C6-HSL浓度，结果见表2。
表2
Figure BDA0001264786380000081
结果表明，本发明基因工程菌对信号分子标准品C6-HSL的降解效率明显高于B.thuringiensis，即本发明的基因工程菌培养过程中AiiA产生量更高。
实施例3 对循环冷却水系统中浮游微生物的抑制率
3.1实验对象：本实验室保存的B.thuringiensis和实施例1制备的基因工程菌；
3.2仪器：NJHL-III型智能动态模拟试验装置，2100P型便携式浊度仪，购自美国HACH公司，Y-CN121智能型工业在线电导率仪，购自北京德威特仪器有限公司，酸碱滴定管，A50-HQ-10便携式溶解氧仪，购自美国HACH公司，PHS-25型pH计，购自上海雷磁仪器厂，单联电炉，购自金坛市良友仪器；
3.3牛肉膏蛋白胨培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，调节pH至7.0，121℃高温灭菌20min后加入氨苄青霉素至100μg/mL；
3.4培养方法及菌液离心：将本实验室保存的B.thuringiensis和实施例1制备的基因工程菌接种至灭菌过后的牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、140r/min摇床培养至稳定期。将培养至稳定期的菌液于冷冻离心机13700rpm离心20min，取上清液备用；
3.5试验方法：
使用常见的开放式循环冷却系统进行测试，运行前，储水箱、补水箱中注入循环水，锅炉加入软化水或去离子水，以ClO2作为杀菌剂，以2.0mg/L的比例投加到储水箱中，搅拌使ClO2充分溶解后开机运行5h，让杀菌剂随水流循环整个系统中，对系统进行彻底的清洗，以防其他因素对后续实验结果造成影响。杀菌结束后，将水排净，彻底清洁储水箱和补水箱，重新补充循环水。所述的循环水全部来自于重庆市潼南区某化工厂中的循环水系统一次水，以便更为贴近循环水系统工程实际情况。
设置三组系循环冷却系统平行试验，三套系统均加入循环水同时运行，其中第一组作为空白对照组，全程不加菌液；第二组在运行第5天投入体积为循环水体积1‰的实施例1制备的、培养至稳定期的工程菌离心上清液；第三组在运行第5天投入体积为循环水体积1‰的培养至稳定期的B.thuringiensis离心上清液。
选定实验自开始起的第10天早晨9：00取样，用HGT 4207-2011平皿计数法测定三组系统中浮游菌数量，实验结果见表3，
表3
Figure BDA0001264786380000091
试验结果表明，本发明的基因工程菌对循环冷却水系统中浮游微生物的抑制效果明显。

Claims (5)

1.一种高表达酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌，以E.coli Arctic Express TM(DE3)为表达载体，整合有aiiA目的基因，所述的aiiA目的基因序列的序列号为DQ440581.1。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述的工程菌通过以下方法构建：
(1)PCR扩增：以Primer 1和Primer 2为引物，以Bacillus thuringiensis基因组DNA为模版，PCR扩增aiiA基因序列并纯化，所述Primer1的序列为CGCCA^TATGATGACAGTAAAGAAGC，所述Primer 2的序列为TATT^CTAGATATATATTCCGGGAAC；
(2)克隆：将步骤(1)获得的aiiA基因序列克隆到pCzn1载体上得到重组质粒pCzn1-aiiA；
(3)转化：将步骤(2)获得的重组质粒pCzn1-aiiA转化到E.coli Arctic Express TM(DE3)中得到高产酰基高丝氨酸内酯酶的工程菌。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：步骤(1)中所述的B.thuringiensis基因组DNA是将B.thuringiensis接种至50mL LB培养基中，200rpm震荡培养至稳定期后，提取B.thuringiensis的基因组DNA得到。
4.权利要求1-3任一项所述的工程菌在抑制循环冷却水系统中微生物污染的用途。
5.权利要求1-3任一项所述的工程菌在抑制循环冷却水系统中浮游微生物污染的用途。
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