CN109852665B - 不同酵母菌株混合发酵的研究方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种不同酵母菌株混合发酵的研究方法，包括：(1)将用于混合发酵的酵母菌株分为未标记组和标记组，未标记组至多包含一株酵母菌，标记组至少包含一株酵母菌，对标记组中原始酵母菌株进行不同的抗药性标记，获得相应的重组酵母菌株；(2)比较标记组中的原始酵母菌株和相应的重组酵母菌株的发酵性能；(3)将未标记组中的酵母菌株与标记组中的重组酵母菌株进行混合发酵，或将标记组中不同的重组酵母菌株进行混合发酵。本发明提供研究方法，可以准确地监控整个混合发酵过程中不同酵母菌株的数量动态变化，为研究混合发酵体系中的不同酵母菌株的代谢互作提供解决方法，对提升葡萄酒品质有重要意义。

Description

不同酵母菌株混合发酵的研究方法及其应用

技术领域

本发明属于酵母菌代谢互作研究领域，尤其涉及同种酵母不同菌株混合发酵的研究方法及其应用。

背景技术

葡萄酒的酿造是不同菌种或菌株共同发挥代谢作用的复杂生物化学过程。酵母菌是参与葡萄酒酒精发酵的主要微生物，其群体组成和代谢活动直接影响葡萄酒的质量。我国葡萄栽培面积广阔，各产区地理位置独特、气候条件差异明显，再加上自然选择的作用，因而形成了特有的本土酵母菌群资源。本土酵母菌对当地环境适应性强，既可以主导葡萄酒的发酵过程又可促进产区或地域特色葡萄酒的生产，因此将优良本土酵母菌用于葡萄酒酿造具有明显优势。

相关研究表明，接种优良本土酵母菌或进行多个酵母菌株的混合发酵可增加葡萄酒的复杂性、避免同质化现象，从而有助于提高葡萄酒的质量。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)是最重要的葡萄酒酵母，决定着葡萄酒酿造的成败和最终品质。不同的S.cerevisiae菌株会生成特定的代谢物质，从而影响葡萄酒的风味，使葡萄酒具有独特性。我国大多数葡萄酒生产企业使用商业S.cerevisiae进行葡萄酒的酿造，至今尚未见商业S.cerevisiae对我国本土酵母菌资源的影响及二者竞争关系的相关报道。因此，研究和发掘我国本土酵母菌资源，用本土优良S.cerevisiae进行接种发酵或者与其它酵母菌进行混合接种发酵，生产具有地区特色的葡萄酒将是我国葡萄酒生产的研究重点。

对发酵过程中不同酵母细胞数量的动态变化进行监控，了解各酵母菌在发酵不同阶段的消长规律，有助于加强对葡萄酒发酵过程的微生物学控制。区分S.cerevisiae菌株的方法包括经典的分类学方法和分子方法。经典的分类学方法是对形态、生理、生化特性进行描述，该方法较费时费力。分子方法需要首先提取酵母菌DNA，进行PCR之后获得图谱而进行菌株区分，该方法更适合于自然发酵条件下的未知种群的分析。

目前，采用接种特定的优良酵母菌进行混合发酵，是酿酒师期望获得多种风味、品质较高的葡萄酒的一种主要酿造方法。监控酵母菌在发酵过程中的动态变化以及酵母菌间的相互作用，是实现葡萄酒风味调控的必要手段。因此，急需一种操作简单快捷，在特定酵母菌株混合发酵体系中能够有效监控不同酵母菌株动态变化的研究方法，为后续研究混合发酵体系中的不同酵母菌株的代谢互作及酿造更高品质的葡萄酒奠定基础。

发明内容

本发明目的在于提供一种适用于同种酵母菌不同菌株的混合发酵、且操作简单、能够有效监控不同酵母菌株动态变化的研究方法及其应用。

为实现上述目的，本发明提供一种不同酵母菌株混合发酵的研究方法，包括以下步骤：

(1)将用于混合发酵的酵母菌株分为未标记组和标记组，所述未标记组至多包含一株酵母菌，所述未标记组的酵母菌株不进行抗药性标记，所述标记组至少包含一株酵母菌，对所述标记组中不同的原始酵母菌株进行不同的抗药性标记，获得各自相应的重组酵母菌株；

(2)比较所述标记组中的原始酵母菌株和各自相应的重组酵母菌株的发酵性能；

(3)将所述未标记组中的酵母菌株与所述标记组中的重组酵母菌株进行混合发酵，监控发酵过程中所述未标记组中的酵母菌株与所述标记组中的重组酵母菌株的数量动态变化；或

将所述标记组中不同的重组酵母菌株进行混合发酵，监控发酵过程中所述标记组中不同的重组酵母菌株的数量动态变化。

较佳地，所述步骤(1)中，对所述标记组中不同的原始酵母菌株进行不同的抗药性标记包括以下步骤：

(11)质粒的提取，所述质粒包括质粒pUG6或质粒pYC140，所述质粒pUG6携带有卡那霉素抗药性基因，所述质粒pYC140携带有潮霉素抗药性基因；

(12)抗药性基因的获得，以所述质粒pUG6为模板进行卡那霉素抗药性基因的扩增，或以所述质粒pYC140为模板进行潮霉素抗药性基因的扩增；

(13)重组酵母菌株的构建和筛选，将扩增获得的卡那霉素抗药性基因或潮霉素抗药性基因整合到原始酵母菌株的基因组中，用抗药性筛选培养基进行筛选，获得重组酵母菌株，并采用PCR扩增技术对重组酵母菌株进行验证，以获得稳定遗传的重组酵母菌株。

较佳地，所述步骤(12)中，采用上游引物JK_HO-KO-F和下游引物JK_HO-KO-R进行卡那霉素抗药性基因的扩增，所述上游引物JK_HO-KO-F和下游引物JK_HO-KO-R中含有HO基因交换位点，所述JK_HO-KO-F具有如SEQID:1所示的核苷酸序列，所述下游引物JK_HO-KO-R具有如SEQ ID:2所示的核苷酸序列，或，

所述步骤(12)中，采用上游引物HOKO-Hyg_F和下游引物HOKO-Hyg_R进行潮霉素抗药性基因的扩增，所述上游引物HOKO-Hyg_F和下游引物HOKO-Hyg_R中含有HO基因交换位点，所述上游引物HOKO-Hyg_F具有如SEQ ID:3所示的核苷酸序列，所述下游引物HOKO-Hyg_R具有如SEQ ID:4所示的核苷酸序列。

较佳地，所述步骤(13)中采用PCR扩增技术对重组酵母菌株进行验证，包括：

(131)使用引物JK_HOKOchk-F和引物JK_KanRE-R进行卡那霉素抗药性基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物JK_KanRE-R含有如SEQ ID:6所示的核苷酸序列；

(132)使用引物JK_HOKOchk-F和引物JKHOKO-chk_R进行HO基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物JKHOKO-chk_R引物含有如SEQ ID:8所示的核苷酸序列，或，

所述步骤(13)中采用PCR扩增技术对重组酵母菌株进行验证，包括：

(131)使用引物JK_HOKOchk-F和引物HYG-chk_R进行潮霉素抗药性基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物HYG-chk_R含有如SEQ ID:7所示的核苷酸序列；

(132)使用引物JK_HOKOchk-F和引物JKHOKO-chk_R进行HO基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F引物含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物JKHOKO-chk_R引物含有如SEQID:8所示的核苷酸序列。

较佳地，步骤(2)包括：

(21)将原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株分别进行单菌发酵，比较原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株的发酵性能；

(22)将原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株进行混合发酵，监控发酵过程中原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株的数量动态变化。

较佳地，所述酵母菌株为酿酒酵母。

本发明还提供一种不同酵母菌株混合发酵的研究方法在研究酵母菌产生毒素对自身细胞嗜杀性中的应用。

具体地，将所述标记组中的原始酵母菌株与各自相应的重组酵母菌株进行混合发酵。

本发明还提供一种不同酵母菌株混合发酵代谢的研究方法在研究不同酵母菌株混合发酵的发酵特征中的应用。

本发明提供的不同酵母菌株混合发酵代谢的研究方法具有以下优点：

(1)本发明提供的抗药性基因标记的方法，可以用于酵母菌混合发酵代谢的研究中。本发明提供的抗药性基因标记的方法，操作简单，在整个混合发酵过程中，可以准确地监控酵母菌群的动态变化，适用于不同酵母菌株的混合发酵，适用性强，对研究酵母菌的混合发酵，提升葡萄酒品质有重要意义。

(2)通过比较原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株的发酵能力，来验证抗药性标记对酵母菌本身的代谢是否有影响，该验证方法操作简单且结果可靠，使得本发明提供的不同酵母菌株混合发酵的研究方法更加稳定可靠。

(3)该方法用于混合发酵代谢研究中，可以很直观的反应出发酵过程中各菌株数量的动态变化，结合各菌株的发酵能力，对研究菌株单个细胞的发酵活力具有指导作用，为混合发酵中确定不同菌株的接种比例、接种时间等都具有积极的意义。

附图说明

图1A为潮霉素标记的重组酵母菌株的PCR验证电泳图；

图1B为卡那霉素标记的重组酵母菌株的PCR验证电泳图；

图2A为原始酵母菌株UCD522和重组酵母菌株UCD522HO::Kanmx在YAN浓度为55mg/L的累积释放CO₂发酵曲线；

图2B为原始酵母菌株UCD522和重组酵母菌株UCD522HO::Kanmx在YAN浓度为433mg/L的累积释放CO₂发酵曲线；

图2C为原始酵母菌株UCD2610、重组酵母菌株UCD2610HO::Kanmx和UCD2610HO::Hyg在YAN浓度为55mg/L的累积释放CO₂发酵曲线；

图2D为原始酵母菌株UCD2610、重组酵母菌株UCD2610HO::Kanmx和UCD2610HO::Hyg在YAN浓度为433mg/L的累积释放CO₂发酵曲线；

图3A为YAN浓度为55mg/L时，UCD2610与UCD2610HO::Hyg在混合发酵过程中的细胞数量动态变化；

图3B为YAN浓度为55mg/L时，UCD2610与UCD2610HO::Hyg在混合发酵过程中的细胞数量比例；

图4A为YAN浓度为433mg/L时，UCD522与UCD522HO::Kanmx混合发酵过程中的细胞数量动态变化；

图4B为YAN浓度为55mg/L时，UCD522与UCD522HO::Kanmx混合发酵过程中的细胞数量比例；

图5A为YAN浓度为433mg/L时，UCD522HO::Kanmx与UCD 2610HO::Hyg在混合发酵过程中的细胞数量动态变化；

图5B为YAN浓度为55mg/L时，UCD522HO::Kanmx与UCD 2610HO::Hyg在混合发酵过程中的细胞数量动态变化；

图6A为UCD522HO::Kanmx、UCD2610HO::Kanmx和NX11424在YAN为433mg/L条件下的累积CO₂释放发酵曲线；

图6B为UCD522HO::Kanmx、UCD2610HO::Kanmx和NX11424在YAN为55mg/L条件下的累积CO₂释放发酵曲线；

图7A为YAN浓度为433mg/L时，NX11424与UCD522HO::Kanmx在混合发酵过程中的细胞数量动态变化；

图7B为YAN浓度为55mg/L时，NX11424与UCD522HO::Kanmx在混合发酵过程中的细胞数量动态变化；

图8为NX11424与UCD522HO::Kanmx在混合发酵过程中的数量比例关系；

图9A为YAN浓度为433mg/L时，NX11424与UCD2610HO::Kanmx在混合发酵过程中的数量动态变化；

图9B为YAN浓度为55mg/L时，NX11424与UCD2610HO::Kanmx在混合发酵过程中的数量动态变化；

图10为NX11424与UCD2610HO::Kanmx在混合发酵过程中的数量比例关系。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

本发明中，混合发酵的原始菌株选自美国加州大学戴维斯分校葡萄栽培与葡萄酒酿造系菌种保藏中心的酿酒酵母UCD522和UCD2610，在酵母嗜杀特性中，UCD522为敏感菌株，菌株UCD2610为嗜杀菌株；以及西北农林科技大学葡萄酒学院葡萄酒微生物资源与遗传育种实验室的酿酒酵母NX11424，为我国宁夏本土酵母，中性菌株。

实施例1重组酵母菌株的构建及筛选

本发明中选用质粒pUG6和pYC140作为基础质粒，质粒pUG6和pYC140保存于E.coliDH 5α中，质粒pUG6携带卡那霉素(Kanamycin)抗药性基因，pYC140携带潮霉素(Hygromycin)抗药性基因。

1.1.质粒的提取

E.coli质粒提取试剂(100mL)：

Solution I：5mL 1mol/L Tris-HCl，2mL 0.5mol/L EDTA，93mL H₂O

Solution II：20mL 1mol/L NaOH，10mL 10％SDS(w/v)，70mL H₂O

Solution III：60mL 5mol/L醋酸钾，11.5mL冰乙酸，28.5mL H₂O

(1)挑取E.coli单菌落接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基(5g酵母粉，10g胰蛋白胨，5g氯化钠溶于蒸馏水，1mL mol/L NaOH，定溶至1000mL。121℃高压灭菌20min。培养E.coli转化子时需加入氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL)中，37℃振荡培养10-14h，取1.5mL菌液于Eppendorf管中，14000rpm离心2min收集菌体，弃上清；

(2)加100μL Solution I重悬菌体，室温下静置5min；

(3)加入200μL Solution II，振荡混匀，冰浴5min；

(4)加入150μL预冷的Solution III，轻轻混均，冰浴5min；

(5)14000rpm离心5min，将上清液移至另一Eppendorf管中；

(6)加入0.5μL RNase(10mg/mL的)，37℃温育20min；

(7)加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混合均匀，-20℃放置10min；

(9)14000rpm离心20min，除上清；

(10)加入200μL 70％的乙醇清洗沉淀，14000rpm离心5min，去除上清液，静置晾干；

(11)加入100μL Tris溶解沉淀，-20℃保存。

提取得到的质粒及其经酶切后的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证，凝胶成像仪上观察，照相。琼脂糖凝胶电泳试剂：上样缓冲液：40％(w/v)蔗糖，0.25％(w/v)溴酚蓝，4℃保存；5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA(pH 8.0)20mL，加蒸馏水定容至1000mL,121℃高压灭菌20min,使用时稀释为1×TBE；1％琼脂糖凝胶：琼脂糖0.4g，1×TBE40mL，加热至琼脂糖熔化，稍冷却，加4μL Gel Red，混匀。

1.2抗药性基因的获得

以质粒pUG6为模板，使用上游引物JK_HO-KO-F(如SEQ ID:1所示)和下游引物JK_HO-KO-R(如SEQ ID:2所示)进行Kanamycin基因的扩增；以质粒pYC140为模板，上游引物HOKO-Hyg_F(如SEQ ID:3所示)和下游引物HOKO-Hyg_R(如SEQ ID:4所示)进行Hygromycin基因的扩增。反应体系总体积为25μL，PCR反应体系如下：10×High Fidelity PCR Buffer5μL；50mM MgSO₄ 2μL；10mM dNTPs 1μL；10μM引物各1μL；Platinum TaqHigh Fidelity 0.2μL，模版DNA 1μL；加双蒸水至25μL。反应程序:94℃预变性2min，94℃变性45s，54～60℃(用于Kanamycin基因扩增)或58～66℃(用于Hygromycin基因扩增)温度梯度退火45s，68℃延伸2min，35个循环，68℃总延伸7min。

1％的琼脂糖凝胶电泳电泳检测扩增片段，凝胶成像仪上观察，照相。根据目的基因大小进行切胶、回收PCR产物。PCR产物电泳后用胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction Kit)进行纯化，纯化方法按照说明书进行。

1.3重组酵母菌株构建及筛选

S.cerevisiae的转化采用LiAc/SS carrier DNA/PEG方法，具体步骤参照Gietz和Schiestl(High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.Nature Protocols,2,31～34)：

(1)挑取S.cerevisiae单菌落接种于5mL YEPD(葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸粉1％，固体培养基加入2％的琼脂，用蒸馏水配置，自然pH，121℃高压灭菌20min)液体培养基中，25℃振荡过夜培养；

(2)以终OD为0.1～0.2的接种量接种于50mL YEPD中，培养至0.5～0.8OD；

(3)25℃下5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清；

(4)用1.5mL预冷的无菌双蒸水悬浮酵母细胞，转移至2mL离心管；

(5)4℃ 5000rpm离心5min，弃上清；

(6)1.5mL预冷的TELG悬浮酵母细胞，4℃ 5000rpm离心5min，弃上清；

(7)0.5mL预冷的TELG悬浮酵母细胞，置于冰上备用；

(8)取100μL酵母细胞于1.5mL离心管中，立即加入20μL ss DNA，200ng DNA(设置阴性对照无菌水和阳性对照对应质粒)，再加入0.6mL的TELP，混匀后25℃下孵育30min后，42℃热激30min；

(9)25℃下5000rpm离心5min收集酵母细胞，转移至5mL YEPD液体培养基中，25℃培养4h；

(10)25℃下5000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。用1mL无菌双蒸水悬浮酵母细胞；

(11)取50～200μL涂布于含有G418或Hygromycin B的YEPD平板上(在YEPD固体培养基中添加终浓度为100μg/mL的G418或150μg/mL的Hygromycin B)，28℃培养3～4d至菌落长出。抗药平板上长出的菌落，进行划线纯化，用于菌落PCR。

挑取阳性克隆单菌落于0.02N NaOH中，99℃加热10min后备用。使用引物JK_HOKOchk-F(如SEQ ID:5所示)和JK_KanRE-R(如SEQ ID:6所示)进行Kanamycin基因检验，引物JK_HOKOchk-F(如SEQ ID:5所示)和HYG-chk_R(如SEQ ID:7所示)进行Hygromycin基因检验，引物JK_HOKOchk-F(如SEQ ID:5所示)和引物JKHOKO-chk_R(如SEQ ID:8所示)进行HO基因检验。反应体系总体积为25μL。PCR循环为：94℃ 2min，94℃ 45s，50℃(扩增Kanamycin和HO基因)或者52℃(扩增Hygromycin基因)退火45s，72℃延伸90s，循环次数30次，最后，72℃延伸7min。PCR反应体系总体积为25μL，PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL；50mM MgCl₂1μL；10mM dNTPs 0.5μL；10μM引物各0.5μL；Taq酶0.25U，模版DNA 1μL，加双蒸水至25μL。1％的琼脂糖凝胶电泳电泳检测扩增片段，凝胶成像仪上观察，照相。对于同时出现HO和相应抗药性基因条带的视为稳定遗传菌株。

在本实施例中，为了构建含有Kanamycin/Hygromycin抗药性标记的重组S.cerevisiae菌株，采用LiAc/SS carrier DNA方法，将PCR后得到的DNA片段整合到S.cerevisiae的基因组中，该DNA片段含有抗药性标记和HO基因的两端同源序列。在含有100μg/mL的G418或150μg/mL的Hygromycin B的YEPD平板上进行初步筛选后，挑取抗药性平板上长出的单菌落进行纯化，纯化后用于菌落PCR验证，采用菌落PCR方法验证抗药性基因是否已成功整合到UCD522和UCD2610的基因组内部。用相应引物同时进行抗药性基因Kanaycin/Hgyromycin和HO基因的检测，分别以原始菌株和受体菌单菌落为模板进行菌落PCR扩增。对于同时出现HO和抗性基因的条带的视为转化菌。

PCR产物电泳结果如图1A、图1B所示，图1A中，M，1Kb DNA Ladder；1、2泳道分别为UCD2610HO::Hyg和UCD2610的潮霉素基因检测；3、4泳道分别为UCD2610HO::Hyg和UCD2610的HO基因检测；图1B中，1、2、3、4泳道分别为UCD2610、UCD522、UCD2610HO::Kanmx和UCD22HO::Kanmx的卡那霉素基因检测；5、6、7、8泳道分别为UCD2610、UCD522、UCD2610HO::Kanmx和UCD22HO::Kanmx的HO基因检测。根据电泳结果，原始菌株的Hygromycin基因和Kanamycin基因PCR扩增为阴性，结果正确。HO基因条带大小为1100bp左右(图1A，3、4泳道；图1B，5、6、7、8泳道)，与1075bp大小相符，Hygromycin基因为1500bp左右(图1A，1泳道)，大小与1456bp相符；Kanamycin基因为700bp(图1B，3、4泳道)，与700bp大小相符。因此，得到重组菌株UCD522HO::Kanmx，UCD2610HO::Kanmx和UCD2610HO::Hyg。

实施例2原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株发酵性能比较

在本实施例中，先将原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株分别进行单菌发酵，以期获得对酵母菌株发酵特征和细胞数量不造成影响的抗药性标记。随后，将原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株进行混合发酵，以研究原始菌株与抗药性标记菌株间的相互作用，为后续研究不同菌株在混合发酵中的代谢奠定基础。

氮源是影响酵母菌代谢的主要因素，为验证本发明提供的卡那霉素抗药性基因和潮霉素抗药性基因标记的可靠性，在本实施例及以后的实施例中，以低氮环境(YAN浓度为55mg/L)和高氮环境(YAN浓度为433mg/L)作为基础研究环境。

Triple M单菌接种发酵条件：将种子以10⁶cfu/mL的接种量接入装有Triple M培养基(75mL)的三角瓶中，在25℃下,120rpm摇床培养，用CO₂失重法监测发酵进程(每隔24h进行称重一次)，连续2d的失重为0.1g左右视为发酵结束。发酵结束后用Clinitest方法检测残糖。每个发酵设置3个重复，YAN浓度为433mg/L和55mg/L。对于混合发酵而言，不同菌株的接种数量比为1:1。发酵过程每天取样0.1mL，稀释至合适梯度分别涂布YEPD平板(每个梯度3个重复)和添加了G418或Hygromycin B的YEPD平板，于28℃培养2～3d，待菌落长出后，进行菌落计数。

Triple M模拟汁配方如下，各试剂均购自Fisher Scienfific公司。

Ergo Stock：6.25mL Tween 80加入95％乙醇至25mL，之后添加62.5mg(90％)的麦角固醇，搅拌溶解，置于4℃冰箱内备用；

溶液A：于250mL无菌去离子水中加入110g D-葡萄糖，110g D-果糖和4mL ErgoStock；

溶液B：于200mL无菌去离子水中加6g L(+)-酒石酸，3g L(-)-苹果酸，0.5g柠檬酸；

溶液C：200mL无菌去离子水中加入1.7g无氨基酵母氮源(Yeast Nitrogen Basewithout Amino Acids,YNB)(YNB浓度为55mg/L的培养基加0.85g)，2.0g酸水解酪蛋白(YNB浓度为55mg/L的培养基加1.0g)，6mg肌醇，0.2g无水氯化钙，0.8g L-精氨酸·HCl(YAN浓度为55mg/L的培养基加入0.107g)，1g L-脯氨酸，0.1g L-色氨酸和磷酸铵(YAN浓度为433mg/L和55mg/L的培养基分别加入1g和0.015g)。

先将溶液B、C混合后再加入溶液A，用3mol/L的KOH调pH至3.25后定容至1L，0.45μm滤膜过滤除菌，现用现配。

2.1原始酵母菌株与抗药标记重组酵母菌株的单菌发酵

通过比较原始菌株UCD522、UCD2610，重组菌株UCD522HO::Kanmx、UCD2610HO::Kanmx和UCD2610HO::Hyg的累积释放CO₂的发酵曲线，检验抗药性标记是否影响菌株的发酵特征。供试菌株的累积释放CO₂的发酵曲线如图2A、图2B、图2C、图2D所示。在YAN浓度为433mg/L和55mg/L时，除重组菌株UCD2610HO::Hyg外(图2C)，抗药性标记对酵母菌株的发酵特征不造成影响，重组菌株与相对应的原始菌株的发酵特征基本一致。发酵结束后，模拟酒样中的残糖含量为0.5～2g/L，各菌株均能顺利完成酒精发酵，并且重组菌株与相对应的原始菌株的残糖含量间无显著性差异。

2.2原始酵母菌株与相应重组酵母菌株的混合发酵

在YAN浓度为55mg/L时，进行原始菌株UCD2610与重组菌株UCD2610HO::Hyg的混合接种发酵(初始接种比例为1:1)，于发酵过程每天取样、涂板及菌落计数，发酵过程中二者的数量动态变化如图3A所示。结果表明，重组菌株与原始菌株在发酵过程中的细胞数量无显著性差异(P<0.05)，且变化趋势一致(图3A)。混合发酵过程中，UCD2610与UCD2610HO::Hyg的细胞数量比例维持在1:1左右(图3B)。研究表明，嗜杀酵母对自身毒素和同类型的毒素蛋白具有免疫力，本研究中，UCD2610与UCD2610HO::Hyg的数量比例维持在1:1左右，可以推测UCD2610产生的嗜杀毒素对自身细胞没有嗜杀性。

在YAN浓度为433mg/L时，进行原始菌株UCD522与重组菌株UCD522HO::Kanmx的混合接种发酵(初始接种比例为1:1)，发酵过程每天取样、涂板及菌落计数，发酵过程中二者的数量动态变化如图4A、4B所示。结果表明，重组菌株与原始菌株在发酵过程中的细胞数量及其变化趋势基本一致(图4A)。混合发酵过程中，UCD522与UCD522HO::Kanmx的细胞数量比例维持在1:1左右(图4A)。

在本实施例中，在原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株分别进行单菌发酵试验中，两者的发酵能力差异不大，在两者进行混合发酵试验中，发现两者在发酵过程中的菌数量比例基本为1；1，说明本发明提供的卡那霉素和潮霉素抗药性基因标记的方法对酵母菌本身的代谢不会产生影响。因此，本发明提供的抗药性基因标记的方法，可以用于不同酵母菌株混合发酵代谢的研究中。在葡萄酒生产过程中，通常意义上的混合发酵多是将酿酒酵母和非酿酒酵母混合，由于酿酒酵母和非酿酒酵母的形态特征不同，因此经常采用经典的分类学方法进行菌株动态变化监控，但该方法操作繁琐、费时费力，且不适用于多株系酿酒酵母的混合发酵。而本发明提供的卡那霉素和潮霉素抗药性基因标记的方法，对酵母菌自身代谢没有影响，操作简单，在整个混合发酵过程中，可以准确地监控不同酵母菌群的动态变化，适用于不同酿酒酵母菌株的混合发酵，同时对研究不同酵母菌的混合发酵，提升葡萄酒品质有重要意义。

此外，在本实施例中，通过比较原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株单菌发酵的发酵能力，以及两者混合发酵的菌数量的动态变化相结合的方式，来验证抗药性标记对酵母菌本身代谢的是否有影响，该验证方法操作简单且结果可靠，使得本发明提供的不同酵母菌株混合发酵代谢的研究方法更加稳定可靠。

实施例3标记组中不同重组酵母菌株混合发酵

3.1UCD522HO::Kanmx与UCD2610HO::Hyg的混合发酵研究

在YAN浓度为433mg/L和55mg/L的Triple M培养基中，分别进行UCD522HO::Kanmx与UCD2610HO::Hyg的混合接种发酵，初始接种比例为1:1。发酵过程中，各菌株的细胞数量动态变化如图5A、5B所示。由图5A、5B可知，发酵的第2d，酵母菌UCD2610HO::Hyg占主导地位，UCD522HO::Kanmx的细胞数量低于10⁴cfu/mL。

实施例4未标记组中酵母菌株与标记组中重组酵母菌株混合发酵

4.1未标记菌株NX11424与标记菌株单独发酵性能比较

在本实施例中，比较我国本土酵母NX11424、抗药性标记菌株UCD522HO::Kanmx和UCD2610HO::Kanmx的单菌发酵性能，具体单菌发酵的实施方法可参照实施例2。本实施例中，发酵曲线如图6A，图6B所示，其中●，UCD522HO::Kanmx；■，UCD2610HO::Kanmx；▲，NX11424。在YAN浓度为433mg/L时，UCD522HO::Kanmx、UCD2610HO::Kanmx和NX11424的累积CO₂释放发酵曲线无明显差异(图6A)，此条件下培养基中有充足的氮源，各菌株均能顺利完成发酵过程。而在YAN浓度为55mg/L时，各菌株的累积CO₂释放发酵曲线差异明显(图6B)，敏感菌株UCD522HO::Kanmx发酵速度最快，而嗜杀菌株UCD2610HO::Kanmx发酵速度最慢，中性菌株NX11424的发酵速度位于二者之间。

4.2NX11424与UCD522HO::Kanmx的混合发酵研究

由图7A、7B可知，发酵第2d，酵母菌的细胞数量由10⁶cfu/mL上升到10⁸cfu/mL。在YAN浓度为433mg/L时，NX11424在混合发酵过程中占主导地位(图7A和图7B)，发酵第2d数量优势明显，其数量是UCD522HO::Kanmx的10倍左右，之后NX11424与UCD522HO::Kanmx比例下降至2:1，而在发酵第7d(发酵末期)的比例又有所提高(3:1)(图8)。在YAN浓度为55mg/L时，NX11424与UCD522HO::Kanmx在混合发酵过程中比例维持在1:1，在第10d(发酵末期)二者的比例明显提高(8:1)(图8)。

结合4.1及实施例3中数据结果分析可知，UCD522在YAN浓度为55mg/L的发酵中，其数量低于UCD2610和NX11424的细胞数量(图5A、5B和图7A、7B)，但其发酵速度最快，说明该菌株用较少的生物量实现了较高的代谢活力，因此推测UCD522的单个细胞发酵活力最强。

4.3NX11424与UCD2610HO::Kanmx的混合发酵研究

由图9A、9B可知，在YAN浓度为433mg/L时，混合发酵中NX11424与UCD2610HO::Kanmx的比例维持在1:1左右，在第7d(发酵末期)比例有所提高，提高到4:1(图10)。在55mg/L的YAN条件下，混合发酵中NX11424与UCD2610HO::Kanmx的比例维持在1:1左右，在第10d(发酵末期)比例提高到2:1。我国本土S.cerevisiae NX11424在与嗜杀酵母菌UCD2610HO::Kanmx的混合发酵过程中数量上占优势，具有竞争力，是具有潜力的酵母菌资源。

本发明提供的不同酵母菌株混合发酵代谢的研究方法具有以下优点：

(1)本发明提供的抗药性基因标记的方法，可以用于酵母菌混合发酵代谢的研究中。本发明提供的卡那霉素和潮霉素抗药性基因标记的方法，对酵母菌自身代谢没有影响，操作简单，在整个混合发酵过程中，可以准确地监控酵母菌群的动态变化，适用于不同酵母菌株的混合发酵，适用性强，对研究酵母菌混合发酵，提升葡萄酒品质有重要意义。

(2)通过比较原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株单菌发酵的发酵能力，以及两者混合发酵的菌数量的动态变化相结合的方式，来验证抗药性标记对酵母菌本身代谢的是否有影响，该验证方法操作简单且结果可靠，使得本发明提供的不同酵母菌株混合发酵代谢的研究方法更加稳定可靠。

(3)该方法用于混合发酵代谢研究中，可以很直观的反应出发酵过程中各个菌株的动态变化，结合各个菌株的发酵能力，对研究菌株单个细胞的发酵活力具有指导作用，为混合发酵中确定不同菌株的接种比例、接种时间等都具有积极的意义。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 不同酵母菌株混合发酵的研究方法及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatccatatc ctcataagca gcaatcaatt ctatctatac tttaaaccag ctgaagcttc 60

gtacgc 66

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aattttactt ttattacata caacttttta aactaatata cacattatag gccactagtg 60

gatctg 66

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatccatatc ctcataagca gcaatcaatt ctatctatac tttaaacaga ttgtactgag 60

agtgcacc 68

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aattttactt ttattacata caacttttta aactaatata cacattatag cacgtgatga 60

aaaggg 66

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaagtcctg tttctatg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggcgacagt cacatcat 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgacggtgtc gtccatcac 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caccatttcc tgcgagta 18

Claims (10)

1.一种不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将用于混合发酵的酵母菌株分为未标记组和标记组，所述未标记组至多包含一株酵母菌，所述未标记组的酵母菌株不进行抗药性标记，所述标记组至少包含一株酵母菌，对所述标记组中不同的原始酵母菌株进行不同的抗药性标记，获得各自相应的重组酵母菌株；

(2)比较所述标记组中的原始酵母菌株和各自相应的重组酵母菌株的发酵性能；

(3)将所述未标记组中的酵母菌株与所述标记组中的重组酵母菌株进行混合发酵，监控发酵过程中所述未标记组中的酵母菌株与所述标记组中的重组酵母菌株的数量动态变化；或

将所述标记组中不同的重组酵母菌株进行混合发酵，监控发酵过程中所述标记组中不同的重组酵母菌株的数量动态变化。

2.如权利要求1所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对所述标记组中不同的原始酵母菌株进行不同的抗药性标记包括以下步骤：

(11)质粒的提取，所述质粒包括质粒pUG6或质粒pYC140，所述质粒pUG6携带有卡那霉素抗药性基因，所述质粒pYC140携带有潮霉素抗药性基因；

(12)抗药性基因的获得，以所述质粒pUG6为模板进行卡那霉素抗药性基因的扩增，或以所述质粒pYC140为模板进行潮霉素抗药性基因的扩增；

(13)重组酵母菌株的构建和筛选，将扩增获得的卡那霉素抗药性基因或潮霉素抗药性基因整合到原始酵母菌株的基因组中，用抗药性筛选培养基进行筛选，获得重组酵母菌株，并采用PCR扩增技术对重组酵母菌株进行验证，以获得稳定遗传的重组酵母菌株。

3.如权利要求2所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，所述步骤(12)中，采用上游引物JK_HO-KO-F和下游引物JK_HO-KO-R进行卡那霉素抗药性基因的扩增，所述上游引物JK_HO-KO-F和下游引物JK_HO-KO-R中含有HO基因交换位点，所述JK_HO-KO-F具有如SEQ ID:1所示的核苷酸序列，所述下游引物JK_HO-KO-R具有如SEQ ID:2所示的核苷酸序列。

4.如权利要求2所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，所述步骤(12)中，采用上游引物HOKO-Hyg_F和下游引物HOKO-Hyg_R进行潮霉素抗药性基因的扩增，所述上游引物HOKO-Hyg_F和下游引物HOKO-Hyg_R中含有HO基因交换位点，所述上游引物HOKO-Hyg_F具有如SEQ ID:3所示的核苷酸序列，所述下游引物HOKO-Hyg_R具有如SEQ ID:4所示的核苷酸序列。

5.如权利要求3所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，所述步骤(13)中采用PCR扩增技术对重组酵母菌株进行验证，包括：

(131)使用引物JK_HOKOchk-F和引物JK_KanRE-R进行卡那霉素抗药性基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物JK_KanRE-R含有如SEQID:6所示的核苷酸序列；

(132)使用引物JK_HOKOchk-F和引物JKHOKO-chk_R进行HO基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物JKHOKO-chk_R引物含有如SEQ ID:8所示的核苷酸序列。

6.如权利要求4所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，所述步骤(13)中采用PCR扩增技术对重组酵母菌株进行验证，包括：

(131)使用引物JK_HOKOchk-F和引物HYG-chk_R进行潮霉素抗药性基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物HYG-chk_R含有如SEQ ID:7所示的核苷酸序列；

(132)使用引物JK_HOKOchk-F和引物JKHOKO-chk_R进行HO基因检验，所述引物JK_HOKOchk-F引物含有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列，所述引物JKHOKO-chk_R引物含有如SEQID:8所示的核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，步骤(2)包括：

(21)将原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株分别进行单菌发酵，比较原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株的发酵性能；

(22)将原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株进行混合发酵，监控发酵工程中原始酵母菌株与相应的重组酵母菌株的数量动态变化。

8.如权利要求1-7任一项所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母。

9.如权利要求1-8任一项所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法在研究酵母菌产生毒素对自身细胞嗜杀性中的应用。

10.如权利要求1-8任一项所述的不同酵母菌株混合发酵的研究方法在研究不同酵母菌株混合发酵的发酵特征中的应用。

Images