CN104726554B - 一种克氏原螯虾ssr引物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，包括一、提取克氏原螯虾基因组DNA：从克氏原螯虾腹部肌肉提取基因组DNA；二、探针与目的片段杂交：将生物素标记的探针与目的片段杂交获得杂交产物；三、磁珠富集：将杂交产物用磁珠富集法富集得富集产物；四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA；五、SSR引物检测五大步骤。本发明能够简单、快速地筛选克氏原螯虾整个基因组中的微卫星序列，在短时间内能开发大量的SSR引物，为克氏原螯虾的种质保护、遗传改良提供技术手段。

Description

一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)隶属于节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Orgerdecapoda)，爬行亚目(Reptantia)，螯虾科(Cambaridae)，原螯虾属(Procambarus)。克氏原螯虾原产于墨西哥东北部和美国中南部，由于人类和环境因素的影响，扩散至美国至少15个州；1918 年作为牛蛙饵料引入日本，并在日本大面积繁衍和扩散；1929年由日本传入我国，目前在我国 21个省、市、自治区均有分布，并在一些湖泊和沟渠成为优势种群。目前，克氏原螯虾的遗传多样性多集中在用RAPD、线粒体细胞色素I(COI)和微卫星等分子技术进行研究，其结果仍存在部分需要完善之处，因此，高效、全面、稳定的SSR技术的应用对克氏原螯虾遗传多样性的揭示具有很好的补充意义，以期为克氏原螯虾遗传育种、种质资源保护及可持续利用提供一定的理论依据。

微卫星标记，亦称简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)，微卫星DNA分子标记在各种生物体内广泛分布,它具有数量大、多态信息含量高、特异性强、重复性好、检测快速方便等特点,目前被广泛应用于对动、植物的基因定位、连锁分析、血缘关系鉴定、遗传多样性评估、系统发生树构建、标记辅助选择、群体进化研究和品质鉴定等方面探讨。克氏原螯虾的微卫星分离在国内外还未见报道。

SSR在基因组中分布广泛,密度很高,在生物基因组中发挥着不同功能。另外SSR与其它遗传标记相比较,具有位点众多，多态性程度高,检测时对DNA模板要求程度低,检测简单快速,是一个良好的遗传标记。SSR缺点是对于未知DNA序列的生物,SSR基因位点开发较繁琐,成本较高。对于绝大多数非模式生物或非经济类作物,SSR相关资料很少,因此开发这些生物的SSR位点,对于生态监控和系统发生学研究尤为重要,也可以为以后相关研究提供良好的基础。SSR 标记虽然效果好，可靠性高，但其关键点又在于SSR 引物的开发。只有在有一定数量的SSR 引物之后，才可能对某一物种进行SSR 标记的分析。特别是对于没有测序过的生物物种，对于其DNA 碱基序列知之甚少或一无所知的物种只能利用一些特殊的方法得到这种重复序列以及其两边的侧翼序列来设计SSR 引物。目前SSR 引物的来源，概括起来有以下四种途径：1. 关文献；2. 近缘种的引物( 例如同属不同种) ；3. 数据库搜寻法：在GenBank 等公共数据库中搜寻SSR序列，根据侧翼序列设计引物；4. 自己从研究对象基因组文库中筛选SSR位点两翼序列设计引物。针对那些大多数测序很少的物种第4种方法几乎是唯一途径，也是最根本、有效的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，能够简单、快速地筛选克氏原螯虾整个基因组中的微卫星序列，在短时间内能开发大量的SSR引物，为克氏原螯虾的种质保护、遗传改良提供技术手段。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，包括以下步骤：

一、提取克氏原螯虾基因组DNA：从克氏原螯虾腹部肌肉提取基因组DNA；

二、探针与目的片段杂交：将生物素标记的探针与目的片段杂交获得杂交产物；

三、磁珠富集：将杂交产物用磁珠富集法富集得富集产物；

四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA：富集产物经扩展后，转化感受态细胞，培养后蓝白斑法挑选阳性克隆，PCR检验阳性克隆，测序，

用Chromas V2.33软件分析测序结果,去掉载体序列和接头序列；用SSR Hunter软件对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域；根据微卫星区域的特征，对测序结果进行分型；用Primer Premier 5.0软件为微卫星序列设计PCR扩增引物，引物设计的参数要求为：引物长度为18-22bp；产物长度不小于80bp，不长于500bp；扩增退火温度在50-63℃之间，正反引物间Tm值相差不超过3℃；GC含量在40-60%之间；

五、SSR引物检测：对每个位点引物的有效性和多态性进行筛选，得到有效的微卫星位点，挑选3个DNA模板对所有合成的引物进行PCR 扩增，退火温度使用设计引物时的50-62℃，微卫星PCR 扩增反应体系为25μL，扩增条件为：PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后，72℃再延伸10min；扩增产物按照5:1的体积比加入上样缓冲液， 95℃变性5min，立即-20℃冻存15min，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100W恒功率电泳2h，用银染法进行染色、显色、定影，凝胶成像仪记录凝胶图像；将正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在退火温度50-62℃下进行PCR扩增，在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物。

作为优选，探针与目的片段的杂交具体包括以下步骤：

(1)克氏原螯虾基因组DNA片段的获得：使用MseI酶切克氏原螯虾基因组DNA，37℃孵育3h；

(2) 酶切产物的回收：使用胶回收试剂盒回收酶切后产物中的400-1200bp片段得回收后DNA片段；

(3)接头的制作：将MseI接头A和MseI接头B两条核苷酸链分别加ddH₂O溶解至50 μmol/L；等比例混合两组寡核苷酸链，95℃变性10 min，然后自然冷却至室温得MseI接头，-20 ℃保存待用；

(4) 回收后DNA片段与接头的连接：将回收后DNA片段与MseI接头连接得连接产物；

(5) 连接产物的预扩增：以连接产物为模板， MseI-N为引物进行预扩增，PCR反应设置为：72℃反应7min以补齐接头，94℃预变性4min, ，94℃变性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸7min，预扩增产物4℃保存待用；

(6) 生物素探针杂交：取预扩增产物18μL，100℃水浴解链10min，加入55℃预热的杂交缓冲液77μL和生物素标记的探针5μL，构成100μL杂交体系，55℃水浴30min后冷却至室温，加入300μL TEN₁₀₀缓冲液混匀获得杂交产物，4℃保存备用。

作为优选，所述MseI接头A的序列为：5’-TACTCAGGACTCAT-3’（SEQ ID No：1）；MseI接头B的序列为：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’ （SEQ ID No：2）。

作为优选，所述MseI-N的序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAA(N)-3’ （SEQ ID No：3）。

一种克氏原螯虾SSR引物，所述克氏原螯虾SSR引物为由正向引物和反向引物组成的引物对，所述引物对选自以下之一：

F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG-3’ （SEQ ID No：4）和R: 5’-TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG-3’ （SEQ ID No：5）、

F: 5’- CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’ （SEQ ID No：6）和R: 5’-TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’ （SEQ ID No：7）、

F: 5’- CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’ （SEQ ID No：8）和R: 5’-TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’ （SEQ ID No：9）、

F: 5’- AGCCCGATAGCCTCAGGAAT -3’ （SEQ ID No：10）和R: 5’-ATGAGCTTCAGCGGACAGG -3’ （SEQ ID No：11）、

F: 5’- CCACCAACATCGGTCTACCC -3’ （SEQ ID No：12）和R: 5’-CGCTCCATGCAATGATGCTG -3’ （SEQ ID No：13）。

本发明的有益效果是：采用磁珠富集法，能够简单、快速地筛选克氏原螯虾整个基因组中的微卫星序列，在短时间内能开发大量的SSR引物，为克氏原螯虾的种质保护、遗传改良提供技术手段。

附图说明

图1是克氏原螯虾基因组DNA检测电泳图，图1中第1-24孔（从左至右）为克氏原螯虾基因组DNA样品，第25孔为Marker ；条带大小从上到下为：100,250,500,750,1000,2000bp。

图2是微卫星富集琼脂糖电泳检测图，图2中第1-5胶孔（从左至右）均为富集PCR产物，第6胶孔为Marker ；条带大小从上到下为：100,250,500,750,1000,2000bp。

图3是菌液PCR产物示意图，图3中第1-12,13-25胶孔（从左至右）均为菌液为模板的PCR产物，第13胶孔为Marker；条带大小从上到下为：100,250,500,750,1000,2000bp。

图4是X39位点的引物扩增的琼脂糖检测电泳图，图中，1-15孔（从左至右）为克氏原螯虾1-15号样品X39引物扩增产物，条带清晰无杂带。 16孔为Marker DM2000(购自北京康为世纪生物科技有限公司，条带从下到上大小分别为2,000 bp、1,000 bp、750 bp、500bp、250 bp和100 bp。

图5是X39测序峰图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，包括以下步骤：

一、提取克氏原螯虾基因组DNA

STE缓冲液: NaCl 0.1 mol/L：50 ml；Tris-Cl 0.05 mol/L （pH=8.0）：25 ml；EDTA 0.05 mol/L （pH=8.0）：50 ml；ddH₂O：50 ml；溶液pH调至8.0，灭菌备用。

剪取活着的克氏原螯虾腹部肌肉100±10mg于1.5 mL离心管中，用干净的剪刀将组织剪碎。离心管中依次加入如下试剂：500μL STE缓冲液；25μL 蛋白酶K(10mg/mL)（merck）；75 μL 10%（质量体积比）的SDS，混匀后置56℃下消化过夜。加入等体积水饱和酚溶液，轻轻颠倒混合5min以上。7000r/min离心5min，小心将上清液移至另一干净的离心管中。加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，体积比)抽提一次，12000 r/min离心10min。加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次，12000 r/min离心10分钟，取上清。在上清液中加入1/10体积的3mol/L的NaAc (pH=5.2)，2倍体积-20℃预冷的无水乙醇沉淀DNA。-70℃下沉淀2h。12000r/min离心10min，再以70% -20℃预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以200-500μL纯水溶解DNA样品。取1μL左右的样品进行电泳检测DNA质量（见图1）。

二、探针与目的片段杂交：

(1)克氏原螯虾基因组片段的获得:

使用MseI（MBI）酶切克氏原螯虾基因组DNA，37℃孵育3h, 酶切反应50μL体系:

克氏原螯虾基因组DNA: 100 ng; 10×buffer（MseI酶自带）: 5.0μL; MseI(10U): 1μL; 去离子水补足至50μL。酶切完成后，1.5%的琼脂糖检测酶切效果，如果400-1200 bp的片段占绝对优势标明酶切完毕。

(2)酶切产物的回收

使用胶回收试剂盒（赛百盛公司（上海））回收酶切后产物中的400-1200bp片段，操作步骤如下：

在紫外灯下，切取含400-1200bpDNA片段的琼脂糖凝胶，每0.1g胶加300μL溶胶液（试剂盒提供）；50℃水浴10min, 每2-3min震荡一次，使凝胶充分溶解；将溶胶液小心滴加于分离柱上，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的液体，在分离柱中加入500μL漂洗缓冲液（试剂盒提供），放置5min, 12000r/min离心1分钟，倒掉收集管中的废液；将倒掉液体后的分离柱和收集管（试剂盒提供）再次以12000r/min离心5min，倒掉残余的液体，室温放置5分钟；将分离柱放置于一个新的1.5mL收集管中，分离柱中央硅胶膜上加入300μL洗脱缓冲液（试剂盒提供），60℃水浴2min, 12000r/min离心2min, 收集离心下来的液体。琼脂糖凝胶电泳检测回收结果，使用核酸蛋白仪测定DNA浓度，稀释至100ng/μL（回收后基因组DNA）。

(3)接头的制作

将MseI接头A和MseI接头B（MseI接头A：5’-TACTCAGGACTCAT-3’ （SEQ ID No：1）；MseI接头B：5’GACGATGAGTCCTGAG-3’ （SEQ ID No：2）；由南京金斯瑞生物有限公司合成）两条核苷酸链分别加ddH₂O溶解至50 μmol/L;等比例混合两组寡核苷酸链，95℃变性10 min，然后自然冷却至室温得MseI接头，-20 ℃保存待用。

（4） 回收后DNA片段与接头的连接

pGEM-T easy 载体购自Promega公司。

连接反应20μL体系：回收后基因组DNA(100ng/μL): 5.0μL; 2×rapid ligasebuffer（Promega PGEM-T easy vector试剂盒提供）: 10.0μL; MseI接头 (25μM): 5.0μL;T4 DNA连接酶（购自Promega公司） (3U): 2.0μL; 去离子水补足至20μL。16℃连接4h，连接产物保存于-20℃备用。

（5）连接产物的预扩增

以连接产物为模板， MseI-N为引物（MseI-N: 5’-GATGAGTCCTGAGTAA(N)-3’ （SEQID No：3），由上海赛百盛公司合成）进行预扩增，20μL反应体系：10×PCR buffer:2.0μL;dNTPs:0.5μL;MseI-N引物 (10μM):0.5μL;T4 DNA连接酶 (5U): 1.0μL;稀释10倍后的连接产物：2.0μL;去离子水补足至20μL。

PCR反应设置为：72℃反应7min以补齐接头，94℃预变性4min, (94℃变性1min,53℃退火1min, 72℃延伸1min)反应30个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物（预扩增产物）4℃保存待用。

（6）生物素探针杂交

杂交缓冲液：20×SSC：0.3 mL；10% SDS：0.01 mL；加ddH₂O，定容至1 mL。

TEN₁₀₀缓冲液: Tris-Cl 1 mol/L：1 mL；EDTA 0.5 mol/L：0.2 mL；NaCl 5 mol/L：2 mL；调节pH值至7.5，加ddH2O，定容至100 mL，灭菌待用。

取上述预扩增产物18μL, 100℃水浴解链10min, 加入55℃预热的杂交缓冲液77μL和生物素标记的探针5μL（生物素标记(AC)₈探针由上海赛百盛生物有限公司合成，(AC)₈探针序列为5’- ACACACACACACACAC -3’ （SEQ ID No：14）），构成100μL杂交体系。55℃水浴30min后缓慢冷却至室温，加入300μL TEN₁₀₀缓冲液混匀，4℃保存备用。

三、磁珠富集

磁珠富集所用的磁珠、磁架及配套试剂均为PROMEGA公司生产。

(1)将洗脱缓冲液置于70℃水浴锅中预热；

(2) 将NEB S1420S磁珠震荡悬浮，吸取20μL于一1.5mL的离心管中，磁力架固定磁珠 加入200μL TEN₁₀₀缓冲液洗涤3次，洗涤完毕后用40μL TEN₁₀₀缓冲液重悬磁珠；

(3) 将生物素杂交产物全部加入磁珠，室温反应30min;

(4) 用磁力架固定磁珠，吸去杂交反应液，TEN₁₀₀溶液洗涤3次，每次300μL；

(5) 用磁力架固定磁珠，使用4℃预冷的TEN₁₀₀溶液洗涤3次，每次300μL;

(6) 加入预热的50μL洗脱缓冲液，涡旋震荡悬浮磁珠，室温孵育2min, 70℃水浴10min, 用磁力架固定好离心管后，迅速吸取上清，保存备用；

(7) 按1:2的比例加入100μL冰冻乙醇，再加入10μL 5 mol/L NaAc，4℃, 12000r/min离心20min, 弃上清后用70%（体积比）的乙醇洗涤2遍。然后4℃, 12000r/min离心20分钟，小心吸出上清，室温下干燥5min, 加入20μL无菌水溶解（富集产物，（见图2）），-20℃保存备用。

四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA

（1）目的DNA片段的体外连接：

使用T-A克隆技术，以Promega 公司PGEM-T easy连接扩增后的微卫星富集产物片段（步骤三获得），10μL连接反应体系：PGEM-T easy：0.5μL；2×rapid ligase buffer：5.0μL；微卫星富集产物片段：1.0μL；T4 DNA连接酶 (3U)：1.0μL；去离子水补足至10μL。16℃连接过夜获得连接产物。

（2）转化

（A）吸取50μL感受态细胞(大肠杆菌DH5α菌株，Promega公司)于1.5mL离心管中，冰浴下缓慢融化；

（B）向离心管中加入连接产物，体积不超过感受态细胞体积的5%，轻轻混匀。将离心管置于42℃水浴中热击90s，然后立即置于冰上5min。

（C）向离心管中加入600μL SOC培养基（100 ml组份浓度：2% (W/V) 胰蛋白胨，0.5% (W/V) 酵母抽提物，0.05% (W/V) NaCl ，2.5 mM KCl 10 mM MgCl2，20 mM葡萄糖。

配制1 M 的葡萄糖溶液：将18 g的葡萄糖溶解在90 ml的去离子水中，定容至100ml，用0.22 μm滤膜过滤除菌。向100 ml SOB培养基中加入除菌的1 M 葡萄糖溶液2 ml，均匀混合。4℃保存），以水浴将培养基加热至37℃。恒温振动器中37℃，200r/min转速，震荡培养培养1h。

（D）将200μL细菌悬浮液加入4μL IPTG（2g IPTG溶解在8ml蒸馏水中，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃）和40μL X-GAL（X-Gal 1g(购自Amresco)溶于5mL灭菌水中,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装后储存于-20℃待用）后，均匀地涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，待液体彻底吸收后，于37℃条件下倒置培养12h。

（3） 微卫星阳性克隆的筛选及测序

（A）阳性克隆的挑取、培养

一般将每个平板的克隆数控制在200个左右，以方便挑选阳性克隆。将培养好的平板（菌落生长良好并且分布均匀）在4℃放置若干小时，使菌落充分显色（阳性克隆为白色，空质粒为蓝色或淡蓝色）。

用无菌牙签挑取白色克隆到500μL LB液体培养基（含50μL Amp）中，置于37℃摇床上，220rpm转速培养过夜，4℃保存菌液。

(B) PCR检验阳性克隆

使用载体正向测序引物M13(-47) (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ （SEQ IDNo：15）)和(AC)₈探针进行PCR。取1μL菌液作为PCR模板，扩增反应体系为25μL，同时做阴性对照，反应体系构成为:菌液:1μL;10μM的引物M13(-47):1μL；10μM的 (AC)₈探针:1μL；25mmol/M的Mg²⁺:2μL；10×Taq buffer:2.5μL；2.5mmol/L的dNTP：1.2μL；Taq聚合酶：0.2μL；ddH₂O：13.1μL。PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后，72℃再延伸10min。无条带者再使用M13反向引物M13 (-48) (引物序列为：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’ （SEQ ID No：16）)和(AC)₈探针进行PCR反应。反应体系及反应条件同上。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶电泳检测（见图3），有明亮清晰条带为阳性克隆，阳性克隆菌液送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。

（4）序列分析和微卫星位点的分类及设计

用Chromas V2.33软件(http://www.technelysium.com.au/chromas.html)分析测序结果，去掉载体序列和接头序列；用SSR Hunter软件(http://en.biosoft.net/dna/SSRHunter.html)对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域；根据微卫星区域的特征,按照Weber(1990)提出的标准对测序结果进行分型；用Primer Premier 5.0软件(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/)为微卫星序列设计PCR扩增引物，引物设计的参数要求为：引物长度为18-22bp；产物长度不小于80bp，不长于500bp；扩增退火温度在50-62℃之间，正反引物间Tm值相差不超过3℃；GC含量(GC%)在40-60%之间。

五、SSR引物检测

（A）微卫星PCR扩增

随机挑选3个质量较好的DNA模板对所有合成的引物进行PCR扩增，退火温度优化使用设计引物时的50-62℃，若得不到扩增产物或者扩增效果不好，则对退火温度进行调整。

微卫星PCR扩增反应体系为25μL，其构成为：DNA模板：50-100ng；10μM的上下游引物各1μL;25mmol/M的Mg²⁺:2μL；10xTaq buffer:2.5μL；2.5mmol/L的dNTP：1.2μL；Taq 聚合酶：0.2μL；ddH2O补足至总体积25μL。扩增条件为：PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后，72℃再延伸10min。

(B)PCR扩增产物检验

扩增产物按照5:1的体积比加入上样缓冲液，95℃变性5min，立即-20℃冻存15min，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100W恒功率电泳2h左右，用银染法进行染色、显色、定影，凝胶成像仪记录凝胶图像。具体操作步骤如下：

（1）玻璃板处理：用去污剂和清水将玻璃板洗干净，并用去离子水冲洗干净，最后用95%乙醇擦拭，晾干。

（2）聚丙烯酰胺凝胶的制备：用专用烧杯配置75ml 8%的聚丙烯酰胺凝胶，迅速加入600μL 10%APS和60μl TEMED，用玻璃棒搅匀后立即灌胶。

（3）灌胶：倾斜封装好的玻璃板，将混合好的聚丙烯酰胺溶液由两玻璃板间隙慢慢灌进，为防止出现气泡，可以边灌边用泡沫板敲打橡胶封条赶走气泡。待胶流动到短板上部边缘时，插入梳子，聚合30min左右。

（4）组装电泳槽： 将聚合好的聚丙烯酰胺胶板装入电泳槽中，短板向内，两胶板对立放置，拔出梳子，电泳槽中加入足量的1×TBE缓冲液（没过对立的两胶板上边缘）。

（5）选择性产物的电泳：将变性后的每份样品取10μL点入点样孔中，电压200V电泳10min，使所有样品跑出胶孔，然后调电压至150V，至二甲苯青指示剂至胶的四分之三处时终止电泳。

（6）银染检测：

第一步：拆板。小心地将胶板取出，卸下橡胶封条，撬开玻璃板，小心取聚丙烯酰胺凝胶至装有蒸馏水的托盘中。第二步：洗胶。轻轻晃动托盘数秒，倒干蒸馏水，再加入等量蒸馏水第二次清洗凝胶，晃动数秒后倒出蒸馏水，轻按凝胶，竖直滴干数秒。第三步：染色。在托盘内加入配制好的染色液（AgNO₃）200mL，轻摇30min。第四步：显色准备。取200ml显色液，加入1ml 37%甲醛，混匀待用。第五步：洗胶。回收染色液，在托盘内加入蒸馏水清洗胶两次。第六步：显色。加入新配制的显色液，轻摇至所有条带显现清晰。；凝胶成像仪观察，拍照，记录。

（C）多态性微卫星位点的筛选

将能够正常扩增的引物对用挑选出来的DNA模板在最适退火温度下进行PCR扩增，在聚丙酰胺胶上读带，选择条带清晰，至少有两个或者两个以上等位基因的引物。

通过上述方法，可以在一周内获得大量的克氏原螯虾微卫星标记，是一种易于推广的筛选克氏原螯虾微卫星标记的方法。

获得的典型引物见下表：

图4是克氏原螯虾X39位点AAG5次重复序列的引物扩增的琼脂糖检测电泳图，图中，1-15孔（从左至右）为克氏原螯虾1-15号样品X39引物扩增产物，条带清晰无杂带，可作为一种较佳的SSR引物。图5是X39测序峰图。X39的序列信息见（SEQ ID No：17）。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省淡水水产研究所

<120> 一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法

<130> 2015.1.12

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tactcaggac tcat 14

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacgatgagt cctgag 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatgagtcct gagtaa 16

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctcgggtgt ggtgttagtg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcaggagaca ggtttggtgt g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctcgggtgt ggtgttagtg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcaggagaca ggtttggtgt g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctcgggtgt ggtgttagtg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcaggagaca ggtttggtgt g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcccgatag cctcaggaat 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgagcttca gcggacagg 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccaccaacat cggtctaccc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgctccatgc aatgatgctg 20

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acacacacac acacac 16

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 17

<211> 980

<212> DNA

<213> 克氏原螯虾

<400> 17

gcatccaacg cgttgggagc tctcccatat ggtcgacctg caggcggccg cgaattcact 60

agtgattgat gagtcctgag taatcaccac caccacgacc agcccactac ctggaggtca 120

cggctccacc accatcacca ccccagggga ccccaagatg cagccctctc ggtcggtcaa 180

cattggtcta cccagtggac cccaggtcgt tctgcagacg accccagacg acccagtaaa 240

gatggaagag gagcaacaac gactccagtc tgtaccacca acatcggtct acccaggttg 300

gaccccagga cggacggacc ccaatggacc ccaggtcgct tgtcaaagac ccagagaaga 360

aagaagagag aagaaagaag agagaagaag gaagagagaa gaaggaagag agaagaaaga 420

agaaagaaga agaagaagat aagacaagct gagtgagaca cgatgcctcg tgttccttgc 480

tggtatcagc atcattgcat ggagcgtaat tgcaagacag gatcgtttgc cttactcagg 540

actcatcaat cgaattcccg cggccgccat ggcggccggg agcatgcgac gtcgggccca 600

attcgcccta tagtgagtcg tattacaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 660

gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 720

ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 780

gcgaatggac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 840

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 900

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 960

ccgatttagt gctttacggc 980

Claims (2)

1.一种克氏原螯虾SSR引物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、提取克氏原螯虾基因组DNA：从克氏原螯虾腹部肌肉提取基因组DNA；

二、探针与目的片段杂交：将生物素标记的探针与目的片段杂交获得杂交产物；

三、磁珠富集：将杂交产物用磁珠富集法富集得富集产物；

四、阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因DNA：富集产物经扩展后，转化感受态细胞，培养后蓝白斑法挑选阳性克隆，PCR检验阳性克隆，测序，

用Chromas V2.33软件分析测序结果,去掉载体序列和接头序列；用SSR Hunter软件对插入序列进行分析，找出其中的微卫星DNA区域；根据微卫星区域的特征，对测序结果进行分型；用Primer Premier 5.0软件为微卫星序列设计PCR扩增引物，引物设计的参数要求为：引物长度为18-22bp；产物长度不小于80bp，不长于500bp；扩增退火温度在50-63℃之间，正反引物间Tm值相差不超过3℃；GC含量在40-60%之间；

五、SSR引物检测：对每个位点引物的有效性和多态性进行筛选，得到有效的微卫星位点，挑选3个DNA模板对所有合成的引物进行PCR 扩增，退火温度使用设计引物时的50-62℃，微卫星PCR 扩增反应体系为25μL，扩增条件为：PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1min，首次循环前预变性5min，最后一次循环结束后，72℃再延伸10min；扩增产物按照5:1的体积比加入上样缓冲液， 95℃变性5min，立即-20℃冻存15min，在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100W恒功率电泳2h，用银染法进行染色、显色、定影，凝胶成像仪记录凝胶图像；将正常扩增的引物对用挑选出的DNA模板在退火温度50-62℃下进行PCR扩增，在聚丙烯酰胺胶上电泳的结果读带，选择带型清晰，至少有两个或两个以上等位基因的引物；

所得克氏原螯虾SSR引物为由正向引物和反向引物组成的引物对，所述引物对选自以下之一：

F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG-3’和R: 5’-TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG-3’、 F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’和R: 5’- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’、 F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’和R: 5’- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’、 F: 5’-AGCCCGATAGCCTCAGGAAT -3’和R: 5’- ATGAGCTTCAGCGGACAGG -3’、

F: 5’- CCACCAACATCGGTCTACCC -3’和R: 5’- CGCTCCATGCAATGATGCTG -3’；

探针与目的片段的杂交具体包括以下步骤：

(1)克氏原螯虾基因组DNA片段的获得：使用MseI酶切克氏原螯虾基因组DNA，37℃孵育3h；

(2) 酶切产物的回收：使用胶回收试剂盒回收酶切后产物中的400-1200bp片段得回收后DNA片段；

(3)接头的制作：将MseI接头A和MseI接头B两条核苷酸链分别加ddH₂O溶解至50 μmol/L；等比例混合两组寡核苷酸链，95℃变性10 min，然后自然冷却至室温得MseI接头，-20 ℃保存待用；

(4) 回收后DNA片段与接头的连接：将回收后DNA片段与MseI接头连接得连接产物；

(5) 连接产物的预扩增：以连接产物为模板， MseI-N为引物进行预扩增，PCR反应设置为：72℃反应7min以补齐接头，94℃预变性4min, ，94℃变性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸1min，反应30个循环，最后72℃延伸7min，预扩增产物4℃保存待用；

(6) 生物素探针杂交：取预扩增产物18μL，100℃水浴解链10min，加入55℃预热的杂交缓冲液77μL和生物素标记的探针5μL，构成100μL杂交体系，55℃水浴30min后冷却至室温，加入300μL TEN₁₀₀缓冲液混匀获得杂交产物，4℃保存备用；

探针序列为5’- ACACACACACACACAC -3’ ；所述MseI接头A的序列为：5’-TACTCAGGACTCAT-3’；MseI接头B的序列为：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’；所述MseI-N的序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAA(N)-3’。

2.一种克氏原螯虾SSR引物，其特征在于：所述克氏原螯虾SSR引物为由正向引物和反向引物组成的引物对，所述引物对选自以下之一：

F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG-3’和R: 5’-TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG-3’、 F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’和R: 5’- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’、 F: 5’-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3’和R: 5’- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3’、 F: 5’-AGCCCGATAGCCTCAGGAAT -3’和R: 5’- ATGAGCTTCAGCGGACAGG -3’、

F: 5’- CCACCAACATCGGTCTACCC -3’和R: 5’- CGCTCCATGCAATGATGCTG -3’。