CN110205391A - 与陆川猪背膘厚相关的snp分子标记及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及与陆川猪背膘厚相关的SNP分子标记及其引物和应用，本发明通过对ACOX1基因进行测序分析，获得ACOX1基因的亚型序列，通过对其外显子进行测序分析得出与猪背膘厚相关的突变位点：该位点位于第9外显子15T/C、27A/G、127A/G出现了三处突变，可根据这几个突变位点设计相应引物和试剂盒，用于分子标记辅助选择育种，为陆川猪及其杂交选育提供技术支持。

Description

与陆川猪背膘厚相关的SNP分子标记及其引物和应用

【技术领域】

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及与陆川猪背膘厚相关的SNP分子标记及其引物和应用。

【背景技术】

随着生活水平的提高,猪肉品质引起了人们的更多关注，背膘厚度是脂肪性状之一，是胴体性状的一个重要指标。降低背膘厚度可以提高瘦肉率,以满足人们的消费需求，同时可以增加养殖者的经济效益。通过研究与脂肪性状相关的基因,利用基因型选择来降低背膘厚度，是胴体性状改良的有效途径。陆川猪作为中国八大优良地方品种之一，具有早熟易肥、产仔数多、肉味鲜美等特点，开展陆川猪脂类代谢相关基因分子机制的研究，阐明陆川猪生长发育及脂肪沉积方面的调控机理，对陆川猪开发利用有重要的意义。

申请人为研究猪背膘厚度和基因的连锁关系对ACOX1(脂酰辅酶A氧化酶1)有着深入的研究，在申请人自己发表的论文《陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1基因克隆及序列分析》(中国畜牧兽医，2017,44(3)：628-634)中有相关描述：ACOX1在脂肪细胞内参与脂肪酸氧化过程，是体内过氧化物酶β-氧化系统的起始酶，是脂肪酸β-氧化第一步反应的限速酶，在脂肪酸氧化反应中发挥重要的作用，ACOX1特异性催化长链和极长链脂肪酸脱氢氧化形成反式双键的α，β-烯脂酰辅酶A，是脱氢反应的起始酶。ACOX1在动物体内多种组织表达，研究发现在肝脏中其mRNA和蛋白质表达最为丰富，并在肾脏和脂肪组织也有大量的表达。猪的ACOX1基因定位在第17号染色体上,基因与影响日增重、初生重、背膘厚、脂肪酸组成的数量性状遗传位点紧密相连，在脂肪酸代谢中起着重要作用，该文对ACOX1基因进行分析并预测其蛋白质二级结构，但是并未找出与猪背膘肉变异相关的具体位点，在现有技术中，虽然有报道ACOX1基因存在两种亚型，但是，在NCBI上暂时还未找到地方猪种的完整基因序列。仅能做为一个理论基础，并不能切实指导进行陆川猪与背膘肉相关的育种、选育工作。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供与陆川猪背膘厚相关的SNP分子标记及其引物和应用，该分子遗传标记准确指出与猪背膘厚相关的基因位点，且根据改位点设计引物，并在猪的育种或者养殖过程中能应用于选育不同背膘厚的猪品种。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

与背膘厚相关的SNP分子标记，其位于猪ACOX1基因的第9外显子上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第15位碱基为T或C；第27位碱基为A或G；第127位碱基为A或G。

进一步的，所述第15位碱基为C、第127位碱基为G且第27位碱基为G时为AA型；所述第15位碱基为T、第127位碱基为A且第27位碱基为A时为BB型；所述第15位碱基为C，第127位碱基为G且第27位碱基为A时为AB型。

进一步的，所述BB型的猪背膘厚度显著高于AA型和AB型。

本发明还包括用于扩增所述SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明还包括利用上述引物对制备而得的试剂盒。

本发明还包括上述SNP分子标记在厚或薄猪背膘肉品种或品系选育中的用途。

进一步的，所述SNP分子标记是通过陆川猪和杜洛克猪杂交后筛选获得的。

本发明还提供了一种利用所述SNP分子标记在选育或辅助选育背膘厚/薄猪的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1：提取待选育猪的基因组DNA；

步骤2：利用权利要求3所述引物对，将步骤1的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

步骤3：对步骤2扩增产物进行测序；

步骤4：根据步骤3的测序结果，确定步骤1待选育猪的基因型，所述第15位碱基为C、第127位碱基为G且第27位碱基为G时为AA型；所述第15位碱基为T、第127位碱基为A且第27位碱基为A时为BB型；所述第15位碱基为C，第127位碱基为G且第27位碱基为A时为AB型；

步骤5：根据步骤4所述的基因型，判定待选育猪的背膘厚度，所述SNP分子标记的基因型为BB时，其背膘厚度大于AB型和AA型；根据育种需求选育不同背膘厚度的猪。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过对已克隆出的陆川猪ACOX1基因部分CDS区域设计引物再进行测序分析，获得ACOX1基因的亚型序列，通过对其外显子进行测序分析。结果表明陆川猪ACOX1基因存在两种亚型结构，ACOX1基因两个亚型编码区长度为1 986bp，编码661个氨基酸，主要差别位于第270位至430位之间，在陆川猪、杜洛克猪、杜陆杂交猪中第9外显子15T/C、27A/G、127A/G出现了三处突变，其中第15位和127位的突变是向关联的，所述第15位碱基为C、第127位碱基为G且第27位碱基为G时为AA型；所述第15位碱基为T、第127位碱基为A且第27位碱基为A时为BB型；所述第15位碱基为C，第127位碱基为G且第27位碱基为A时为AB型；进一步研究发现BB型平均背膘厚为3.143cm要显著高于其他基因型，AB型平均背膘厚1.907cm，要低于其他基因型，可用于分子标记辅助选择育种，为陆川猪及其杂交选育提供技术支持。

【附图说明】

图1是ACOX1基因第9外显子的3个突变位点测序图；

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

SNP分子标记的获得：

步骤一：F1代样本的获得：

分别采集来自广西壮族自治区畜牧研究所地方猪活体基因库猪场的49头陆川猪、55杜洛克猪和191头杜洛克陆川猪杂交F1代的血液样品，样品采集后，放置添加抗凝剂的真空采血管中，并于-20℃保存。

步骤二：总cDNA序列的获得：

基因组DNA的抽提按常规的酚仿抽提法进行，方法如下：

(1)将1mL血液、1mL血液裂解液和5μL蛋白酶K混合，剧烈震荡混匀，56℃水浴过夜。将消化过夜后的样品取出，在空气中冷却10min。

(2)将消化后的血液加入等体积的Tris-饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，4℃5000rpm离心10min，吸取上清液。

(3)重复步骤(2)1次

(4)加入等体积的有机溶剂I，其中有机溶剂I由Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇按质量比为25：24：1混合制得，颠倒混匀10min，4℃5000rpm离心10min。吸取上清液。

(5)加入等体积的有机溶剂II，其中，有机溶剂II由氯仿：异戊醇按质量比为24：1混合制得，混匀10min，4℃条件下5000rpm离心10min。吸取上清液。

(6)加-20℃无水乙醇1mL，轻轻倒转，可见絮状沉淀时置于-20℃冷却0.5-3h。取出4℃12000rpm离心5min。

(7)弃上清液，加入冷却70％酒精1mL，倒转洗涤，4℃12000rpm离心5min；重复一次。

(8)弃上清液，自然干燥，加双蒸水50μL，室温溶解10min。

(9)取5μLDNA溶液，1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

步骤三：PCR扩增

以步骤二获得的基因组为模板，采用引物F9、R9对第九外显子进行扩增，得到扩增产物，引物序列如下：

F9：5′-AGGTGCCTTCCTCGTCTGTT-3′(SEQ ID No.2)

R9：5′-TGTGAGTCCCTTTCATTGGT-3′(SEQ ID No.3)

扩增体系：

PCR反应程序：

94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，总共35个循环；再进行72℃延伸5min，4℃保存。

步骤四、产物的回收纯化

利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒天跟生化科技(北京)有限公司，回收纯化PCR产物，具体操作步骤按照该试剂盒所附带的说明书。

步骤五、连接反应

将上述纯化回收的PCR扩增产物与pMD18-T载体进行连接。连接反应体系为5μlPCR回收产物2μl、pMD18-T载体0.5μl、Solutin I连接酶2.5μl，4℃连接过夜,得到连接产物。

步骤六、转化

(1)在无菌状态下取出新鲜感受态细菌E.Coli DH5α(冰冻)，用手握融。

(2)向每支感受态中加入5μL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，冰浴30min。

(3)42℃水浴，90s进行热激活。

(4)迅速将此管转移到冰上，冰浴5min。

(5)每管加1mL的LB液体培养基，37℃摇床振摇50min，使细菌复苏。

(6)用无菌弯头玻璃棒铺菌器将100μL菌液铺于含氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基表面，37℃正放1h，倒置培养过夜(14～18h)。

(7)次日，观察培养皿是否有菌落生长，挑出5-10个菌落于新的LA液体培养进行培养(8～12h)。

步骤七、阳性克隆的鉴定

根据琼脂平板上的菌落生长情况,进行挑菌。向管中加入1ml液体LB培养基，同时向每个管中加入2ul的氨苄青霉素，然后用即枪头挑取琼脂平板上的白色菌落选择形状完整,呈圆点形的菌落共20个，分别放于盛有液体培养基的管中，放于37℃摇床内，以250r/min的转速扩大培养3-4小时，待管内出现浑浊现象或者白色丝状沉淀时，采用采用F9和R9引物对和进行菌液鉴定。

PCR扩增体系：

PCR反应程序：

94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，总共35个循环；再进行72℃延伸5min，4℃保存。

PCR反应结束后,吸取产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶成像仪拍照，初步确定阳性克隆。

步骤八、测序验证、SNP位点的获得

将经过扩增初步鉴定为阳性克隆的菌液送交上海英潍捷基有限公司进行测序，利用lasergene软件进行序列比对，得到差异位点。测序结果见图1，证明在猪外显子第9号染色体的出现了3个位点的差异突变：即第15位T/C、第27位G/A，第127位碱基为A/G；

SNP位点的检测：

通过49头陆川猪、55杜洛克猪和193头杜洛克陆川猪杂交F1代的ACOX1基因的第9进行测序分析表明，在第9外显子15T/C、27A/G、127A/G出现了三处突变，其中第15位和127位的突变是向关联的，同时发生突变。

表1不同猪的外显子基因频率

由上表可知，杜陆杂交猪在第9外显子15T/C、27A/G、127A/G出现了三处突变(如图1所示)；因此选择ACOX1基因第9外显子多态性与膘厚进行统计分析：

利用SPSS.18软件对ACOX1基因第9外显子多态性与膘厚进行统计和相关性分析，所述第15位碱基为C、第127位碱基为G且第27位碱基为G时为AA型；所述第15位碱基为T、第127位碱基为A且第27位碱基为A时为BB型；所述第15位碱基为C，第127位碱基为G且第27位碱基为A时为AB型，其他的为野生型ab型。根据对杂交猪F1代的背膘厚进行分析得到结果如表2：

表2猪的背膘厚分析结果

基因型	猪数(头)	基因型频率	平均背膘厚(mm)
				ab型	56	0.2932	26.37±3.69a
AA型	65	0.3403	25.79±3.22a
				AB型	7	0.0367	19.07±1.32b
BB型	63	0.3298	31.43±3.88c

备注：表中用不同字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)，数值用最小二乘均值士标准差。

由上表可知，BB型的平均背膘厚明显高于AA型，且达到极显著水平，AA型的平均背膘厚要高于AB型达到极显著水平；但是AA型的平均背膘厚与野生型ab差异不显著；而AB型的平均背膘厚明显低于AA型、野生型ab和BB型，达到极显著水平。

实施例2：

根据上述筛选得到的基因结果，显示，本申请与公猪精子活力相关的分子遗传标记，位于猪ACOX1基因的第9外显子上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第15位碱基为T或C；第27位碱基为A或G；第127位碱基为A或G。

实施例3：

本领域技术人员很容易根据本发明的分子遗传标记设计出用于扩增该分子标记的引物或鉴定所述分子标记的探针，从而用于该遗传标记的检测，例如通过PCR扩增得到所述分子遗传标记，再通过克隆测序得到相应的序列，或者通过Bsm-RFLP多态性进行检测。因此，本发明还包括用于扩增所述分子遗传标记的引物或鉴定所述分子遗传标记的探针，以及含有所述引物或探针的试剂盒。

实施例4：

可应用本申请的分子遗传标记选育或辅助选育不同级别背膘厚的陆川猪，用于种猪选择或者是猪杂交技术领域，具体方法为：提取待选育猪的基因组DNA；利用序列表SEQID NO.2和SEQ ID NO.3的述引物对，将待选育猪的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；通过对PCR产物进行测序，判断待选育猪的基因型(所述第15位碱基为C、第127位碱基为G且第27位碱基为G时为AA型；所述第15位碱基为T、第127位碱基为A且第27位碱基为A时为BB型；所述第15位碱基为C，第127位碱基为G且第27位碱基为A时为AB型)；根据需求选择相应基因型(如需选育和/或养殖背膘厚的猪，应选择BB基因型的猪；如需选育和/或养殖背膘薄的猪，应选择AB型猪；如需选育和/或养殖背膘中等的猪应选择AA基因型的猪)的种猪进行下一步的育种或者养殖研究。

综上所述，本申请分析得出了与对猪背膘厚度相关的陆川猪ACOX1基因连锁基因，为：第9外显子15T/C、27A/G、127A/G的三个突变，根据突变位点得出可用于对猪背膘厚表型的分子标记进行辅助选择育种以及对陆川猪及其杂交选育提供技术支持；能快速、准确的选育不同背膘厚的猪。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广西壮族自治区畜牧研究所

<120> 与陆川猪背膘厚相关的SNP分子标记及其引物和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 180

<212> DNA

<213> 猪属猪(Sus scrofa)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is t or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (127)..(127)

<223> n is a or g

<400> 1

ctggaggcac gcagnctata ggcttcnatc aggctgtcag ggctgttgat atccgccacg 60

gtcggccagg ctgccacctg ctgaggctgg atgcgctggc tgggcaggtc attcaggtag 120

gacaccntgc cacacaccaa cttgcctgag tgcacctggt tgtaactttt catcaggaac 180

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ren gong xu lie)

<400> 2

aggtgccttc ctcgtctgtt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ren gong xu lie)

<400> 3

tgtgagtccc tttcattggt 20

Claims (8)

1.与背膘厚相关的SNP分子标记，其特征在于，其位于猪ACOX1基因的第9外显子上，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第15位碱基为T或C；第27位碱基为A或G；第127位碱基为A或G。

2.根据权利要求1所述与背膘厚相关的SNP分子标记，其特征在于，所述第15位碱基为C、第127位碱基为G且第27位碱基为G时为AA型；所述第15位碱基为T、第127位碱基为A且第27位碱基为A时为BB型；所述第15位碱基为C，第127位碱基为G且第27位碱基为A时为AB型。

3.根据权利要求2所述与背膘厚相关的SNP分子标记，其特征在于，所述BB型的猪背膘厚度显著高于AA型和AB型。

4.根据权利要求1所述与背膘厚相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记是通过陆川猪和杜洛克猪杂交后筛选获得的。

5.用于扩增权利要求1-4任意一项所述SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。

6.含有如权利要求5所述引物对的试剂盒。

7.如权利要求1-4任意一项所述SNP分子标记在厚或薄猪背膘肉品种或品系选育中的用途。

8.利用权利要求1-4任意一项所述SNP分子标记在选育或辅助选育背膘厚/薄猪的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤1：提取待选育猪的基因组DNA；

步骤2：利用权利要求3所述引物对，将步骤1的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

步骤3：对步骤2扩增产物进行测序；

步骤4：根据步骤3的测序结果，确定步骤1待选育猪的基因型，所述第15位碱基为C、第127位碱基为G且第27位碱基为G时为AA型；所述第15位碱基为T、第127位碱基为A且第27位碱基为A时为BB型；所述第15位碱基为C，第127位碱基为G且第27位碱基为A时为AB型；

步骤5：根据步骤4所述的基因型，判定待选育猪的背膘厚度，所述SNP分子标记的基因型为BB时，其背膘厚度大于AB型和AA型；根据育种需求选育不同背膘厚度的猪。