CN101633943A - 生长激素受体基因作为中国草原红牛优良屠宰性状分子标记的鉴定方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物基因工程技术领域，是一种生长激素受体基因作为中国草原红牛优良屠宰性状的分子标记及应用。所获得的GHR基因片段的核苷酸序列长度为489bp，是外显子10的一部分。在第289位碱基处存在有一个碱基突变，导致限制性片段长度多态性的产生。将此突变位点作为一个分子标记，通过PCR－RFLP即聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性的方法，使用限制性内切酶BstACI检测此突变位点，并将检测结果与中国草原红牛屠宰性状相关联，为中国草原红牛的选种选育提供理论基础。本发明的特点在于获得与中国草原红牛优良屠宰性状相关的GHR基因部分片段，并对该片段进行多态性分析，为中国草原红牛的标记辅助选择提供分子标记。
Description
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，涉及中国草原红牛优良屠宰性状候选基因在标记辅助选择中的应用，具体地说是一种生长激素受体(GHR)基因作为分子标记及在中国草原红牛优良屠宰性状中的应用。
背景技术
1987年，Lueng[DAVID W.LEUNG，Growth Hormone receptor and SerumBinding Protein：Purification，Cloning and Expression，Nature 330，537-543(10 December 1987)]从兔肝脏中提取并纯化出生长激素受体(GHR)，又根据氨基酸序列首次从兔的肝脏cDNA文库中克隆出GHR cDNA。随后人们相继克隆了人、小鼠、大鼠、绵羊、牛、鸡等20多种动物的GHR cDNA。生长激素(GH)通过与靶细胞表面特定的生长激素受体(GHR)结合，刺激胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的生成而对发育和代谢产生作用。因此，GHR的功能区域的改变会影响到GH的结合能力和信号传导，即GHR基因碱基序列发生突变可能影响到生长激素的正常功能的发挥，最终影响到许多生长性状。
1996年，Falaki等[M.Falaki，Relationships of Polymorphisms forGrowth Hormone and Growth Hormone Receptor Genes with Milk ProductionTraits for Italian Holstein-Friesian Bulls，Journal of Dairy ScienceVol.79No.8：1446-1453]报道在用来编码细胞内部分C端的DNA序列中发现了9个RPLR-TaqI基因型，并且该位点的多态性与意大利荷斯坦奶牛的乳蛋白百分含量相关；S.Blott等[Sarah Blott，Molecular Dissection of a QuantitativeTrait Locus：A Phenylalanine-to-Tyrosine Substitution in theTransmembrane Domain of the Bovine Growth Hormone Receptor Is Associatedwith a Major Effect on Milk Yield and Composition，Genetics，Vol.163，253-266，January 2003]报道在Holstein-Friesian牛基因部分编码区和内含子受体跨膜区F279Y氨基酸的替换，从而影响牛的产奶性状；而高雪等[高雪，牛生长激素受体基因遗传变异研究，中国农学通报第21卷第8期2005年8月(2005)]在对本地奶牛的研究中，在GHR基因的第八外显子、第九外显子、第三外显子、5’端均未发现多态，是由于样本数量的限制还是本地黄牛特有的遗传特性还不清楚。
Hale等[Hale CS，Decrease Growth in Angus Steers，withTG-microsatellite Allele in P1Promoter of the Growth Hormone ReceptorGene.J Anim Sci，2000，78：2099-2104.]研究了安格斯牛GHR基因启动区的(TG)n微卫星多态与生产性能的关系，比较了纯合基因型LL和杂合基因型SL对牛的生长性状和屠体性状的影响，并得出S基因型对安格斯牛的断奶重和屠体重有明显影响，并得出S等位基因与安格斯牛群低生长率有关；但是，R.A.curi等[R.A.Curi，Effects of Polymorphic Microsatellites in the RegulatoryRegion of IGF1 and GHR on Growth and Carcass Traits in Beef Cattle，Animal Genetics，2005，Volume 36 Issue 1，Pages 58-62]却发现S等位基因与L等位基因的杂合型具有较高的日增重和体重(P＜0.05)。Ge等[Ge W，Association of Single Nucleotide Polymorphisms in the Growth Hormone andGrowth Hormone Receptor Genes with Blood Serum Insul in-Like Growth FactorI Concentration and Growth Traits in Angus Cattle.Journal of AnimalScience，2003，81(3)：641-648]在GHR基因的启动子部分发现了一个SNP，其多态对血清IGF-1的浓度和生长性状有明显影响。Di Stasio L[Di Stasio L，Polymorphism of the GHR Gene in Cattle and Relationships with MeatProduction and Quality.Animal genetics 2005；36(2)：138-40]等研究了GHR基因的第十外显子257bp处的单核苷酸与14个产肉性状和4个肉质性状的关系，发现GHR的特定基因型对肉品质有不利影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种生长激素受体(GHR)基因作为中国草原红牛优良屠宰性状的分子标记。本发明在于获得与中国草原红牛优良屠宰性状相关的GHR基因部分片段，并对该片段进行多态性分析，为中国草原红牛的标记辅助选择提供分子标记。
本发明的另一个目的是提供鉴定作为中国草原红牛分子标记的GHR基因的RCR-RFLP检测方法。
本发明的第三个目的是提供所涉及的分子标记在中国草原红牛生长性状关联分析上的应用。
本发明通过以下技术方案实现。
一种克隆得到的中国草原红牛生长激素受体基因GHR片段，它的核苷酸序列如表1：
表1中国草原红牛生长长激素受体基因GHR克隆片段
CAGCAGCCCAGTGTTATCCTAGTAGAGGAAAACAAACCAAGACCACTTCTCATTGGTGGAACTGAGTCAACTCATCAAGCTGTCCATACACAGCTCAGCAATCCAAGTTCATTGGCAAACATTGATTTTTATGCCCAGGTAAGCGACATTACACCAGCAGGAAATGTGGTCCTTTCCCCAGGCCAAAAGAATAAGACTGGGAACCCCCAGTGTGACACGCACCCAGAAGTGGTCACACCCTGCCAAGCTAACTTCATCGTGGACAACGCTTACTTCTGCGAGGTAGAC
CCAAAAAGTACATTGCCCTGGCCCCTCATGTCGAGGCTGAATCACACGTAGAGCCAAGCTTTAACCAGGAAGACATTTACACCACCACAGAAAGCCTTACCACTACAGCTGGGAGGTCGGGGACAGCAGAACATGTTCCAAGTTCTGAGATACCTGTCCCAGATTATACCTCCATTCATATAGTACAGTCTCCACAGGGC
其中，
为此序列片段中突变位点的两种单核苷酸，该序列中只存在A或G的一种。
所获得的GHR基因片段的核苷酸序列长度为489bp，是外显子10的一部分。
序列表1的第289位碱基处存在有一个碱基突变位点，导致限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)的产生。将此突变位点作为一个分子标记，通过PCR-RFLP即聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性的方法，使用限制性内切酶BstACI检测此突变位点，并将检测结果与中国草原红牛屠宰性状相关联，为中国草原红牛的选种选育提供理论基础。
本发明的分子标记鉴定方法和性状关联分析过程如图10所示。
本发明的分子标记鉴定方法，通过下述步骤实现。
一、克隆中国草原红牛GHR基因部分序列的方法
1.采集中国草原红牛血液
用活体或屠宰时进行血液采集。为在后续实验中便于从血液中提取基因组DNA，应使用EDTA抗凝血法进行处理，而不使用肝素抗凝血法。
2.从中国草原红牛血液中提取基因组DNA
将采集的血液经EDTA抗凝血法处理后，用常规方法提取基因组DNA。
3.设计特异性引物并进行PCR扩增
设计一对特异引物，上游引物：5`-CAGCAGCCCAGTGTTATC-3`；下游引物：5`-GCCCTGTGGAGACTGTACTAT-3`。PCR反应总体系为25微升，其中10×反应缓冲液2微升，10mmol/L dNTP 0.5微升，25mmol/L MgCl21.5微升，1.0umol/L的上游引物和下游引物各0.5微升，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至25微升。
循环程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸45秒，共35个循环。循环之后，72℃延伸10分钟。全部反应完成后，PCR扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
4.克隆所扩增的中国草原红牛GHR基因序列并测序
本发明将目的片段克隆在pMD18-T载体上，而后转化重组质粒，经酶切鉴定正确后进行测序。
二、建立PCR-RFLP方法并鉴定突变位点
序列测定后，通过序列特征分析，使用限制性内切酶BstACI进行酶切反应。反应结束后经琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型。在所设计的一对特异引物的第288位置存在A/G等位突变，该突变引起氨基酸的改变，并导致限制性内切酶BstACI位点发生改变。当发生改变的位点为G碱基时存在酶切位点(电泳检测结果为287bp+202bp)，命名为A等位基因；当该位点为A碱基时，不存在酶切位点(489bp)，命名为B等位基因。这两个等位基因可组成3种基因型。即AA、BB、AB。如图2所示，其中M泳道为标准分子量Marker，1-2泳道为BB型，3-4泳道为AB型，5-6泳道为AA型。
三、对标记性状进行关联分析
本发明通过生长性状关联分析过程，对中国草原红牛部分性状进行关联分析并预测相应基因型个体部分性状的生长潜力。生长性状关联分析过程，是通过下述步骤实现的。
使用SPSS12.0软件中的General Linear Model过程，建立如下统计分析模模型并消除系统效应来分析不同基因型和部分屠宰性状的关联。
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值，μ为生产性能的最小二乘均值，Gj为基因型对生产性能的效应值，ei为对应于观察值的随机残差。
对中国草原红牛第10外显子的BstACI多态性位点与部分屠宰性状进行关联分析，基因型检测结果表明在145个个体中AA型基因型有25个，AB基因型个体有107个，BB型基因型个体有13个。分析结果如表2所示，其中，同一性状最小二乘均值及标准差后具有不同字母表示差异显著(P＜0.05)，具有不同大小写字母表示差异极显著(P＜0.01)。由表2可知，B等位基因是中国草原红牛性状的有利等位基因，BB基因型标记可作为用于提高中国草原红牛优良性状的选择标记(分子标记)，并对一些性状提出预测值，最小二乘均值±标准差即为对相同月龄中国草原红牛屠宰性状。将此突变位点作为一个分子标记，通过PCR-RFLP的方法鉴定此突变位点，并将鉴定结果与中国草原红牛部分屠宰性状相关联，为中国草原红牛的选种选育提供理论基础。
利用本发明建立的PCR-RFLP方法即可检测处在任何生长阶段的中国草原红牛GHR基因型并评估其生长潜力，也可通过检测21-23月龄的育肥中国草原红牛个体的GHR基因不同基因型，提出部分屠宰性状的估测值。
本发明的效果是如下。
1、克隆了中国草原红牛GHR基因部分DNA序列
GHR基因扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，如图1所示。将PCR产物回收测序，结果显示产物长度为489bp。测序结果显示该片段289bp处存在A、G两个等位基因，测序峰如图3所示。
2、建立了中国草原红牛GHR基因PCR-RFLP诊断方法
用本发明设计的特异性引物扩增中国草原红牛基因组DNA得到的489bp特异扩增片段。测序的结果发现在该489bp片段存在BstACI酶切位点(GR*CGYC)，其中第288bp处为多态性切点，位于GHR基因第10外显子中，用该引物扩增的中国草原红牛GHR基因的489bp长的片段，经过酶切可产生三种基因型，即AA型、AB型和BB型，具体图片如图2所示。
3、对标记性状进行关联分析
最小二乘平均值及标准差后带有不同小写字母表示差异显著，带有不同大写字母表示差异极显著。
表2部分性状在AA、BB和AB基因型的最小二乘平均值及标准差
附图说明
图1是GHR基因扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-8泳道为被检测的8个PCR产物。
图2是2％琼脂糖凝胶电泳检测GHR基因扩增产物的BstACI酶切结果。其中M泳道为标准分子量Marker，1-2泳道为BB型，3-4泳道为AB型，5-6泳道为AA型。
图3是本发明扩增的GHR基因部分DNA序列的克隆测序峰图。
图4是实施例1中PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。
图5是实施例1中酶切反应产物的2％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的酶切产物。
图6是实施例2中PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。
图7是实施例2中酶切反应产物的2％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的酶切产物。
图8是实施例3中PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。
图9是实施例3中酶切反应产物的2％琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的酶切产物。
图10是本发明的分子标记鉴定方法和性状关联分析过程图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，用具体实施方式详细描述具体内容。
本发明利用已公布的GHR基因序列和已提取的中国草原红牛基因组DNA，设计特异性引物一对，克隆第10外显子的一部分，利用PCR-RFLP方法，使用限制性内切酶BstACI对PCR反应产物进行酶切。将酶切结果分型并将不同基因型与部分生产性状关联，并对不同基因型个体的部分性状预测，为中国草原红牛的选种选育提供理论基础。
一、中国草原红牛GHR基因部分DNA片段的克隆
1引物设计
以牛GHR基因为参照，NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，美国国家生物技术信息中心)收录号为AM161140，利用Oligo6.0软件设计特异性引物1对。引物序列如下所示：
上游引物：5`-CAGCAGCCCAGTGTTATC-3`
下游引物：5`-GCCCTGTGGAGACTGTACTAT-3`扩增产物长度为489bp。
2PCR(聚合酶链式反应)体系及扩增条件
PCR反应总体系为25微升，其中10×反应缓冲液[10mmol/LTris-HCL(PH8.0)，50mmol/L KCl，0.1％TritonX-100]2微升，10mmol/L dNTP 0.5微升，25mmol/L MgCl21.5微升，引物浓度为1.0umol/L，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，用四馏水补足至25微升。
循环程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸45秒，共35个循环。循环之后，72℃延伸10分钟。全部反应完成后，PCR扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
3PCR产物回收、纯化及测序
(1)PCR扩增产物的凝胶回收、纯化
PCR扩增产物的凝胶回收和纯化使用常规方法即可。本发明中为快速、高效的回收PCR扩增产物，使用Omega公司的E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒进行凝胶纯化，具体操作参照其说明书进行，使用试剂除1×TAE Buffer缓冲液和二馏水外均为试剂盒内提供。在新鲜的1×TAE Buffer下，用1％琼脂糖/溴化乙啶凝胶电泳完全分离目的DNA片段。在长波紫外灯下用洁净的手术刀片快速切取含目的DNA片段凝胶条。在干净的1.5ml离心管中称量所切胶块的重量，计算胶块的体积(按1克为1毫升计算，为保证回收量，回收的胶块重量应在50毫克至350毫克之间)，加入等体积的Binding Buffer，55℃-65℃水浴或温浴直到胶块完全融化，期间每2-3分钟摇动一次以便混合均匀。将上述操作得到的所有溶液(不超过700微升，超过700微升的部分则弃去)转移至HiBind DNA Spin-Column管中，室温10000g离心1分钟，弃去滤液。加入300微升Binding Buffer后，10000g离心1分钟。将HiBind DNA Spin-Column中加入700微升SPW Buffer，竖直静置2-3分钟，然后室温10000g离心1分钟。弃掉滤液，再将HiBind DNA Spin-Colum中加入700微升SPW Buffer，竖直静置2-3分钟，然后室温10000g离心1分钟，使HiBind DNA Spin-Column管无液体残留的。弃去滤液，将无液体残留的HiBind DNA Spin-Column 10000g离心1分钟，干燥其基质。将HiBind DNA Spin-Column放入一个干净灭菌的1.5ml离心管中，加30微升DNA Elution Buffer或灭菌的2馏水到HiBind DNASpin-Column的中央，10000g离心1分钟洗脱DNA。
(2)感受态DH5α宿主菌的制备
用CaCl2法制备大肠埃希氏DH5α(E.coli DH5α)感受态宿主菌，整个过程需在严格的无菌条件下进行。方法如下：从37℃培养16至20小时的LB(Luria-Bertani)平板培养基中挑取新活化的E.coli DH5α单菌落于不加氨苄的LB液体培养基中，37℃每分钟200至220转振荡培养12小时，然后取300微升于50毫升装有LB的锥形瓶中，柔和摇晃2小时，OD600值为0.45至0.55。取冰中预冷10分钟的E.coli DH5α菌液于冰上预冷的离心管中，在4℃下每分钟4500转的转速离心10分钟。取25毫升冰浴预冷的0.075Mol/L的CaCl2-Tris-Cl悬浮沉淀，置于冰浴15分。在4℃下每分钟4500转的转速离心10分钟，弃上清液后，倒置1分钟。加2毫升冰浴预冷的CaCl2-甘油重悬沉淀。每管200微升分装至1.5毫升离心管内，在-80℃保存。
(3)目的片段与克隆载体的连接
可根据实际情况选择合适的载体。本发明为快速、高效的进行载体连接，选用了TaKaRa公司的pMD18-T载体连接试剂盒进行目的片段与克隆载体的连接，除四馏水外，其他所有试剂均为试剂盒内提供。将凝胶回收的目的DNA片段连接到pMD-18T载体上。按照表3的连接反应体系，在200微升高压灭菌的微量离心管中加入表2中所列的组分，混匀，16℃连接30分钟。
表3连接反应体系
| 试剂 | 体积(微升) |
| pMD-18T Vector | 1.0 |
| 回收的DNA片段 | 4.0 |
| Solution I | 5.0 |
(4)重组质粒的转化
在每管200微升冰上冻融的感受态细胞中，加入10微升的连接产物，轻弹管壁以混匀内容物，冰浴45分钟。将离心管放入预热的42℃恒温水浴中静置2分钟。快速将离心管转移到冰中，冰浴5分钟。在离心管中加入400微升LB液体培养基，37℃摇床每分钟150转的转速温浴1小时。
(5)阳性克隆的筛选
将LB固体培养基15psi(1.05kg/cm2)高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至60℃时，加入1毫升100毫克/毫升的氨苄青霉素(AMP)、1毫升24毫克/毫升的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、2毫升20毫克/毫升的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(X-Gal)后均匀混合，铺制平板。取100微升转化后的细菌均匀涂布于培养基表面，37℃培养箱中放置1小时。然后将平板倒置于37℃培养箱中培养，12-16小时后将平板移入4℃放置，以使蓝色充分显现。观察蓝色与白色菌落生长情况，为使每条目的带的转化产物覆盖5’和3’末端全序列，挑取阳性菌落(白色)5-10个接种于LB培养基。
(6)重组质粒的提取
可使用常规方法进行重组质粒的提取。本发明为快速、高效进行重组质粒的提取，选用Omega公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I试剂盒提取阳性质粒DNA，除四馏水、去离子水外，所用试剂均为试剂盒内提供。从平板培养基上挑选单个阳性菌落接种到5毫升50微克/毫升的LB/Ampicillin液体培养基中，37℃每分钟220转的转速恒温振荡，培养12-16小时。取5毫升菌液放入离心管中，室温10000g离心1分钟，弃掉上面的上清液。用250微升的含RNA去除酶的Solution I充分悬浮细胞沉淀。加入250微升的Solution II，轻轻地上下翻转混合4～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液，室温放置2分钟。加入350微升的SolutionIII，轻轻上下翻转混合5至6次，直至形成紧实凝集块，室温10000g离心10分钟。将试剂盒中的HiBindTM DNA Minicolumn放置于2毫升的Collection Tube上，将上述带有凝集块混合液的上清液转移至HiBindTMDNA Minicolumn中，室温10000g离心1分钟。弃掉滤液，加入500微升的BufferHB到HiBindTM DNA Minicolumn，然后室温10000g离心1分钟。离心完毕后弃掉滤液，加700微升用乙醇稀释过的DNA Wash Buffer清洗HiBindTM DNAMinicolumn，室温10000g离心1分钟，弃掉滤液。然后室温10000g离心空的HiBindTM DNA Minicolumn 1分钟，干燥基质。干燥完毕后将HiBindTM DNAMinicolumn安置于新的灭菌过的1.5毫升的离心管上，在HiBindTM DNAMinicolumn中的膜的中央处加入60微升灭菌的去离子水，室温静置1分钟后，10000g离心1分钟洗脱DNA，可以再洗脱一次提高产量，在-20℃贮存。
(7)阳性质粒的酶切及测序
选用适当的限制性内切酶进行酶切以鉴定重组质粒，将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行序列测定。本发明中，重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
二、PCR-RFLP方法的建立
1中国草原红牛GHR基因部分片段的获得
GHR基因扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物，见图1，其中M泳道为标准分子量Marker，1-8泳道为被检测的8个PCR产物。将PCR产物回收测序，结果显示产物长度为489bp。
2RFLP方法建立
限制性内切酶BstACI可自行选择。本发明中为得到高效、高速的效果，选用Bio Basic Inc.(BBI公司)的BstACI内切酶。PCR产物酶切反应体系为15微升，其中1×Buffer W[其中含10mM Tris-HCl(PH8.0)，10mM MgCl2，100mMNaCl，1mM DTT]1.5微升，PCR产物5微升，限制性内切酶BstACI1.0微升(10U)，用二馏水补足至15微升，将样品混合均匀后37℃恒温水浴5小时。恒温水浴结束后，取5微升酶切产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型。
在该对引物的第288bp位置存在A/G等位突变，该突变引起氨基酸的改变，并导致限制性内切酶BstACI位点发生改变。当该位点为G碱基时存在酶切位点(电泳检测结果为287bp+202bp)，命名为A等位基因；当该位点为A碱基时，不存在酶切位点(489bp)，命名为B等位基因。这两个等位基因可组成3种基因型。即AA、BB、AB。如图2所示，其中M泳道为标准分子量Marker，1-2泳道为BB型，3-4泳道为AB型，5-6泳道为AA型。
三、对标记性状进行关联分析
在利用已屠宰的中国草原红牛共145个基因组DNA样品(基因组DNA提取自肝脏和血液)，分析性状包括部分屠宰性状。运用SPSS12.0软件中的GeneralLinear Model过程，建立如下模型并消除系统效应来分析不同基因型和性状间的关联。
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值；μ为生产性能的最小二乘均值；Gj为基因型对生产性能的效应值；ei为对应于观察值的随机残差。
实施例1
在中国吉林省桶榆县三家子乡的中国草原红牛中随机抽取一个23月龄的待屠宰个体，在屠宰时采集血液进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为32.44ug/ml，OD260/OD280 Ratio为1.824。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为25微升，其中10×反应缓冲液[10mmol/L Tris-HCL(PH8.0)，50mmol/L KCl，0.1％TritonX-100]2微升，10mmol/L dNTP 0.5微升，25mmol/LMgCl21.5微升，引物浓度为1.0umol/L，上游引物和下游引物各0.5微升，0.5微升(2U/ul)Taq DNA聚合酶，1微升提取的基因组DNA(含32.44ng基因组DNA)，四馏水19.5微升。循环程序：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸45秒，共35个循环。最后，72℃延伸10分钟。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图4所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为15微升，其中1×Buffer1.5微升，PCR产物5微升，限制性内切酶BstACI1.0微升(10U/ul)，二馏水7.5微升。将样品混合均匀后，37℃恒温水浴5小时。为提高酶切反应效率，可每隔1小时将反应管取出，将部分蒸发的液体轻甩到管底部。酶切反应结束后，取5微升酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并记录其基因型。如图5所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的酶切产物。经鉴定，此个体属于AA型。其性状与本发明所预测的值的对比见表5。
表5实施例1中抽取的个体性状测量值与估计值对比
| 性状 | 实际值测量值 | 预测值 |
| 宰前活重 | 545.5 | 525.8375±32.06691 |
| 胴体重 | 320.7 | 305.5733±25.08251 |
| 肾脂重 | 9.1 | 9.2365±3.01685 |
| 骨重 | 57.4 | 56.6875±6.82162 |
| 净肉重 | 244.5 | 248.8858±23.54031 |
| 肉骨比 | 4.2596 | 4.4560±0.72156 |
| 肋脂厚 | 0.89 | 0.9025±0.29395 |
| 眼肌面积 | 90.25 | 91.9576±16.92556 |
实施例2
在中国吉林省农科院畜牧分院饲养的中国草原红牛中随机抽取一个21月龄的待屠宰个体，在屠宰时采集血液进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为37.25ug/ml，OD260/OD280Ratio为1.792。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为25微升，其中10×反应缓冲液[10mmol/L Tris-HCL(PH8.0)，50mmol/L KCl，0.1％TritonX-100]2微升，10mmol/L dNTP 0.5微升，25mmol/LMgCl21.5微升，引物浓度为1.0umol/L，上游引物和下游引物各0.5微升，0.5微升(2U/ul)Taq DNA聚合酶，1微升提取的基因组DNA(含37.25ng基因组DNA)，四馏水19.5微升。循环程序：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸45秒，共35个循环。最后，72℃延伸10分钟。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物.如图6所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为15微升，其中1×Buffer1.5微升，PCR产物5微升，限制性内切酶BstACI1.0微升(10U/ul)，二馏水7.5微升，将样品混合均匀，37℃恒温水浴5小时。为提高酶切反应效率，可每隔1小时将反应管取出，将部分蒸发的液体轻甩到管底部。酶切反应结束后，取5微升酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并记录其基因型。如图7所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的酶切产物。此个体属于AB型。其性状与本发明所预测的值的对比见表6。
表6实施例2中抽取的个体性状测量值与估计值对比
| 性状 | 实际值测量值 | 预测值 |
| 宰前活重 | 566.7 | 561.5556±52.29749 |
| 胴体重 | 344.9 | 328.7000±56.47222 |
| 肾脂重 | 9.2 | 9.2222±2.04803 |
| 骨重 | 57.1 | 50.5000±13.37675 |
| 净肉重 | 267.8 | 278.2000±50.90971 |
| 肉骨比 | 4.69 | 4.4830±0.88485 |
| 肋脂厚 | 0.9 | 0.9444±0.15092 |
| 眼肌面积 | 122.55 | 131.2944±15.80991 |
实施例3
在中国吉林省农科院畜牧分院饲养的中国草原红牛中随机抽取一个22月龄的待屠宰个体，在屠宰时采集血液进行基因组DNA的提取并整理其相关的性状资料。提取的基因组DNA经分光光度仪测定，浓度为38.27微克/毫升，OD260/OD280比率为1.811。利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR扩增。PCR反应总体系为25微升，其中10×反应缓冲液[10mmol/LTris-HCL(PH8.0)，50mmol/L KCl，0.1％TritonX-100]2微升，10mmol/L dNTP 0.5微升，25mmol/L MgCl21.5微升，浓度为1.0umol/L的上游引物和下游引物各0.5微升，0.5微升(2U/ul)Taq DNA聚合酶，1微升提取的基因组DNA(含38.27纳克基因组DNA)，四馏水19.5微升。循环程序：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸45秒，共35个循环。最后，72℃延伸10分钟。扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图8，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为15微升，其中1×Buffer1.5微升，PCR产物5微升，限制性内切酶BstACI1.0微升(10U/ul)，二馏水7.5微升，将样品混合均匀后，37℃恒温水浴5小时。为提高酶切反应效率，可每隔1小时将反应管取出，将部分蒸发的液体轻甩到管底部。酶切反应结束后，取5微升酶切产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并记录其基因型。如图9，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1为被检测的酶切产物。此个体属于BB型。其性状与本发明所预测的值的对比见表7。
表7实施例3中抽取的个体性状测量值与估计值对比
| 性状 | 实际值测量值 | 预测值 |
| 宰前活重 | 622.2 | 603.0000±31.48015 |
| 胴体重 | 359.5 | 354.8889±18.49108 |
| 肾脂重 | 9.4 | 9.5000±0.86603 |
| 骨重 | 63.2 | 64.0000±0.50000 |
| 净肉重 | 305.5 | 290.8889±18.09337 |
| 肉骨比 | 4.8259 | 5.5074±0.31877 |
| 肋脂厚 | 1.19 | 1.3667±0.11547 |
| 眼肌面积 | 144.65 | 144.8930±12.76720 |
Claims (3)
1、一种克隆中国草原红牛GHR基因部分序列的方法，(1)采集中国草原红牛血液，(2)从中国草原红牛血液中提取基因组DNA，(3)设计特异性引物并进行PCR扩增，(4)克隆所扩增的中国草原红牛GHR基因序列并测序，其特征是所述的设计特异性引物并进行PCR扩增，所设计一对特异引物为：
上游引物：5`-CAGCAGCCCAGTGTTATC-3`
下游引物：5`-GCCCTGTGGAGACTGTACTAT-3`
PCR反应总体系为25微升，其中10×反应缓冲液2微升，10mmol/L dNTP 0.5微升，25mmol/L MgCl21.5微升，1.0umol/L的上游引物和下游引物各0.5微升，1UTaq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至25微升；
循环程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸45秒，共35个循环。循环之后，72℃延伸10分钟。全部反应完成后，PCR扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；
所克隆的中国草原红牛生长激素受体基因的核苷酸序列如下：
CAGCAGCCCAGTGTTATCCTAGTAGAGGAAAACAAACCAAGACCACTTCTCATTGGTGGAACTGAGTCAACTCATCAAGCTGTCCATACACAGCTCAGCAATCCAAGTTCATTGGCAAACATTGATTTTTATGCCCAGGTAAGCGACATTACACCAGCAGGAAATGTGGTCCTTTCCCCAGGCCAAAAGAATAAGACTGGGAACCCCCAGTGTGACACGCACCCAGAAGTGGTCACACCCTGCCAAGCTAACTTCATCGTGGACAACGCTTACTTCTGCGAGGTAGAC
CCAAAAAGTACATTGCCCTGGCCCCTCATGTCGAGGCTGAATCACACGTAGAGCCAAGCTTTAACCAGGAAGACATTTACACCACCACAGAAAGCCTTACCACTACAGCTGGGAGGTCGGGGACAGCAGAACATGTTCCAAGTTCTGAGATACCTGTCCCAGATTATACCTCCATTCATATAGTACAGTCTCCACAGGGC，
其中，为此序列片段中突变位点的两种单核苷酸，该序列中只存在A或G的一种；
所述的序列长度为489bp，是外显子10的一部分。
2、一种PCR-RFLP方法，其特征是在生长激素受体基因片段的核苷酸序列中，第289位碱基处存在有一个碱基突变位点，导致限制性片段长度多态性的产生；将此突变位点作为一个分子标记，通过PCR-RFLP的方法，使用限制性内切酶BstACI检测此突变位点，并将检测结果与中国草原红牛屠宰性状相关联，为中国草原红牛的选种选育提供理论基础。
3、一种对标记性状进行关联分析，其特征是：
使用SPSS12.0软件中的General Linear Model过程，建立如下模型并消除系统效应来分析不同基因型和部分屠宰性状的关联。
统计分析模型为：Yi＝μ+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值；μ为生产性能的最小二乘均值；Gj为基因型对生产性能的效应值；ei为对应于观察值的随机残差。
利用本发明中建立的PCR-RFLP方法即可检测处在任何生长阶段的中国草原红牛GHR基因型并评估其生长潜力。另外，可通过检测21-23月龄的育肥中国草原红牛个体的GHR基因，提出部分屠宰性状的估测值。
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