CN110564871B - 与牦牛乳冰点相关的snp分子标记、引物组、试剂盒和应用 - Google Patents

与牦牛乳冰点相关的snp分子标记、引物组、试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒和应用，涉及基因诊断制品技术领域，所述SNP分子标记位于牦牛生长激素受体GHR基因SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第82位点，所述位点上存在C/T碱基突变，所述GHR基因的基因型为CC或CT，所述CT基因型冰点值低于CC基因型冰点值；所述SNP分子标记信息基于的牦牛基因序列为Genebank数据库中的AM161140.1。本发明提供的SNP分子标记与牦牛乳冰点显著相关，根据该SNP分子标记能够判断牦牛乳的冰点。

Description

与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及基因诊断制品技术领域，具体涉及与牦牛乳冰点相关的SNP 分子标记、引物组、试剂盒和应用。
背景技术
SNP(single nucleotide polymorphism,SNP)，即单核苷酸多态性，是属于第三代遗传标记，广泛地分布于染色体上。SNP主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％。包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入和缺失等，例如，一个SNP可以将一个DNA序列AAGMCTAA变为ATGGCTAA。在基因组内，SNP可以划分为两种形式：一是遍布于基因组的大量单碱基突变；二是基因编码区的功能性突变，由于分布在基因编码区(coding region)，故又称其为cS-NP。cSNP经常引起表达蛋白的多态性变异，有时会影响他们的功能特性。
现有技术已有对牦牛GHR基因的多态性及生长发育的性状标记的研究，但并未发现牦牛GHR基因SNP与泌乳性状相关性研究的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒和应用。本发明提供的SNP分子标记与牦牛乳冰点显著相关，根据该SNP分子标记能够判断牦牛乳的冰点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于牦牛生长激素受体GHR基因SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第82 位点，所述位点上存在C/T碱基突变，所述GHR基因的基因型为CC或CT，所述CT基因型冰点值低于CC基因型冰点值；所述SNP分子标记信息基于的牦牛基因序列为Genebank数据库中的AM161140.1。
本发明还提供了一种检测GHR基因型的引物组，包括正向引物、反向引物和反向测序引物；
所述正向引物具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物具有 SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，所述反向测序引物具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测GHR基因型的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA 聚合酶、MgCl2和PCR反应缓冲液和上述技术方案所述的引物组。
优选地，所述引物组中正向引物和反向引物的浓度独立的为10μmol/L。
本发明还提供了所述的SNP分子标记在检测牦牛乳冰点中的应用。
本发明提供了与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于牦牛生长激素受体GHR基因SEQ ID NO.4的第82位点，所述位点上存在C/T碱基突变，所述GHR基因的基因型为CC或CT，所述CT基因型冰点值显著低于CC基因型冰点值；所述SNP分子标记信息基于的牦牛基因序列为Genebank数据库中的AM161140.1。本发明提供的SNP分子标记与牦牛乳冰点显著相关，根据该SNP分子标记能够判断牦牛乳的冰点。
附图说明
图1为牦牛GHR基因SEQ ID NO.4所在序列不同样本间的序列对比图，可直观看出第82位点碱基的突变情况；
图2为牦牛GHR基因SEQ ID NO.4序列PCR扩增后通过单向测序方法检测出突变位点的测序图谱。
具体实施方式
本发明提供了与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于牦牛生长激素受体GHR基因SEQ ID NO.4序列的第82位点，所述位点上存在C/T碱基突变，所述GHR基因的基因型为CC或CT，所述CT基因型冰点值低于CC基因型冰点值；所述SNP分子标记信息基于的牦牛基因序列为Genebank数据库中的AM161140.1。
在本发明中，所述SNP位点是以Genebank数据库中序列AM161140.1(普通牛GHR基因，外显子2-10)中SEQ ID NO.4序列设计引物，PCR扩增后进行测序并检测SNP。
在本发明中，所述SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列如下所示：
GGACATTCAAGAATGGAAAGAATGCCCCGATTACGTCTCTGCTGG TGAAAACAGCTGTTACTTTAATTCGTCTTATACCTCTGTGTGGACCCCCT ACTGCATCAAGCTAACTAGCAATGGCGGTATTGTGGATCATAAGTGTTT CTCTGTTGAGGACATAG。
本发明还提供了一种检测GHR基因型的引物组，包括正向引物、反向引物和反向测序引物；
所述正向引物具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物具有 SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，所述反向测序引物具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述SEQ ID NO.1的序列如下所示：
GGGAAAGTACCTACCAATGAATC。
在本发明中，所述SEQ ID NO.2的序列如下所示：
TTGAGTTTCTTCCTTGTAGTGCC。
在本发明中，所述SEQ ID NO.3的序列如下所示：
GAGACTTCCATCCACCCAGAG。
在本发明中，所述SNP突变位点的检测是通过提取牦牛血液基因组后，经PCR扩增通过单向测序方法检测的。
本发明还提供了一种检测GHR基因型的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA 聚合酶、MgCl2和PCR反应缓冲液和上述技术方案所述的引物组。
本发明对所述dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl2、PCR反应缓冲液和引物组在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规试剂盒的试剂放置量即可。
在本发明中，所述引物组中正向引物和反向引物的浓度独立的为 10μmol/L；所述正向引物和反向引物的用量优选为2μL。
本发明还提供了所述的SNP分子标记在检测牦牛乳冰点中的应用。
在本发明中，所述GHR基因型(CC、CT)的检测方法优选为从牦牛血液样本提取总DNA，设计引物PCR扩增片断，PCR产物经回收试剂盒纯化回收后进行序列测定，测序结果用sequence analysis软件进行分析，测序图谱峰图文件用Chromas软件或SeqMan软件打开，通过序列比对软件SeqMan 进行序列比对。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
从牦牛生长激素受体GHR基因筛选SNP位点
Genebank参考序列：AM161140.1(普通牛GHR基因,外显子2-10)，SE Q ID NO.4为参照片段，根据该参照片段设计引物SEQ ID NO.1、SEQ I D NO.2和SEQ ID NO.3，PCR扩增牦牛SEQ ID NO.4所在片段序列后进行序列对比如图1并检测SNP，以图1的前3条序列为例，在第82位点发现一个多态位点。其中，SEQ ID NO.4的序列为GGACATTCAAGAATGG AAAGAATGCCCCGATTACGTCTCTGCTGGTGAAAACAGCTGTTACTTTA ATTCGTCTTATACCTCTGTGTGGACCCCCTACTGCATCAAGCTAACTAG CAATGGCGGTATTGTGGATCATAAGTGTTTCTCTGTTGAGGACATAG；S EQ ID NO.1的序列为GGGAAAGTACCTACCAATGAATC；SEQ ID NO.2 的序列为TTGAGTTTCTTCCTTGTAGTGCC；SEQ ID NO.3的序列为GAG ACTTCCATCCACCCAGAG。
实施例2
检测20头牦牛血液样本中GHR基因SEQ ID NO.4所在片段碱基，其中一样本的序列为SEQ ID NO.5，另一样本的序列为SEQ ID NO.6。SEQ ID NO.5的序列为：GGACATTCAAGAATGGAAAGAATGCCCCGATTACG TCTCTGCTGGTGAAAACAGCTGTTACTTTAATTCGTCTTATACCTCCGTG TGGACCCCCTACTGCATCAAGCTAACTAGCAATGGCGGTATTGTGGATC ATAAGTGTTTCTCTGTTGAGGACATAG；SEQ ID NO.6的序列为：GGAC ATTCAAGAATGGAAAGAATGCCCCGATTACGTCTCTGCTGGTGAAAAC AGCTGTTACTTTAATTCGTCTTATACCTCTGTGTGGACCCCCTACTGCAT CAAGCTAACTAGCAATGGCGGTATTGTGGATCATAAGTGTTTCTCTGTT GAGGACATAG。由上可知，SNP位点碱基的不同产生两种基因型CC型和 CT型。其中，所测20头牦牛血液样本中该基因CC型和CT型占比为3:1。
SNP突变位点经血液基因组提取，PCR扩增后通过单向测序方法检测出突变位点，结果如图2。
实施例3
不同基因型间乳成分及差异显著性分析：
牦牛乳样采集时间为7月底纯放牧条件下，采集50ml泌乳牦母牛奶样干冰运往实验室，用超声波乳品分析仪检测乳脂肪、乳蛋白、非脂乳固体、密度、冰点、盐、电导率。每个样品测3个重复，取平均值。SPSS分析CT 基因型和CC基因型间乳成分差异显著性，结果见表1：
表1不同基因型间乳成分差异显著性分析
Figure BDA0002246990670000051
Figure BDA0002246990670000061
以上结果表明：不同基因型间冰点值P<0.05，说明CC基因型和CT基因型间冰点值差异显著，CT基因型冰点值显著低于CC基因型冰点值，说明该SNP影响牦牛乳冰点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青海省畜牧兽医科学院
<120> 与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记、引物组、试剂盒和应用
<141> 2019-10-22
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gggaaagtac ctaccaatga atc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttgagtttct tccttgtagt gcc 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gagacttcca tccacccaga g 21
<210> 4
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggacattcaa gaatggaaag aatgccccga ttacgtctct gctggtgaaa acagctgtta 60
ctttaattcg tcttatacct ctgtgtggac cccctactgc atcaagctaa ctagcaatgg 120
cggtattgtg gatcataagt gtttctctgt tgaggacata g 161
<210> 5
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggacattcaa gaatggaaag aatgccccga ttacgtctct gctggtgaaa acagctgtta 60
ctttaattcg tcttatacct ccgtgtggac cccctactgc atcaagctaa ctagcaatgg 120
cggtattgtg gatcataagt gtttctctgt tgaggacata g 161
<210> 6
<211> 161
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggacattcaa gaatggaaag aatgccccga ttacgtctct gctggtgaaa acagctgtta 60
ctttaattcg tcttatacct ctgtgtggac cccctactgc atcaagctaa ctagcaatgg 120
cggtattgtg gatcataagt gtttctctgt tgaggacata g 161

Claims (1)

1.与牦牛乳冰点相关的SNP分子标记在检测牦牛乳冰点中的应用，所述SNP分子标记位于牦牛生长激素受体GHR基因SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第82位点，所述位点上存在C/T碱基突变，所述GHR基因的基因型为CC或CT，所述CT基因型冰点值低于CC基因型冰点值；所述SNP分子标记信息基于的牦牛基因序列为Genebank数据库中的AM161140.1。
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