CN117187414B - 一种与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量相关的snp位点及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量相关的SNP位点及其应用。所述SNP位点位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T。本发明还提供了检测上述SNP位点的试剂在检测牦牛乳品质性状或在牦牛乳品质性状辅助育种中的应用，该分子标记可应用于牦牛乳品质性状辅助选择，检测方法快速、准确；通过筛选该SNP分子标记的基因型能够加快对牦牛乳品质性状选择的准确性和有效性，提高牦牛养殖的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量性状相关的SNP位点及应用。
背景技术
牦牛主要集中在青藏高原及周围高寒地区，是唯一能在高寒地区利用牧草资源产生经济效益的牛种，为当地牧民提供了绝大部分的生产生活资料，对藏区的经济发展及牧民生活水平提升具有重要意义。其牦牛乳是一种天然的“浓缩乳”，在化学特性上其干物质、乳脂肪、乳蛋白等营养成分含量均比其他普通乳高。因其营养丰富，牦牛乳也成为各种奶制品生产的原料，乳制品黄油与奶酪是藏区牧民维生素和主要营养物质的重要来源。近年来牦牛乳的产量逐年上升，人们对牦牛乳的关注也明显增加，但目前对牦牛乳的研究还处于初步阶段。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)即为在全基因组序列上某一单个核苷酸的突变造成的DNA序列的变异。这种变异主要有单个基因的转换、颠换、缺失和插入这四类，但以转换(Transition)和颠换(Transversion)居多。转换是指嘌呤碱基(A与G)、嘧啶碱基(T与C)之间相互替代，颠换则是嘌呤和嘧啶之间的替换。在编码区出现的SNP会影响基因的功能导致生物性状的改变，因此可以作为与某些性状相关的生物标记。因其具有高密度、稳定遗传以及可自动化分析等特点，可用于标记辅助育种、连锁分析和生物多样性的研究。
CCSER1(coiled-coil serine rich protein 1)基因也被命名为FAM190A(familywith sequence similarity 190，member A)，作为一种调节蛋白基因。作为正常有丝分裂的调节或结构成分，当CCSER1基因表达量发生变化时，会引起染色体的不稳定。此外，牦牛CCSER1基因是位于第6号染色体上的重要功能基因之一。国内外对CCSER1基因的研究较少，对CCSER1的功能及作用机制的认识都还处在初步阶段。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的在于提供一种与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量相关的SNP分子标记，具有快速准确，检测成本低的特点。
具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T。
第二方面，本发明提供了一种检测与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量相关的SNP分子标记的试剂在检测牦牛乳品质性状中的应用，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T。
优选地，根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GG牦牛个体不显著。
优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。
优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述的SNP分子标记位于第181位。
第三方面，本发明提供了一种检测与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量相关的SNP分子标记的试剂在牦牛乳品质性状早期选育中的应用，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T。
优选地，根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GG牦牛个体不显著。
优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。
优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述的SNP分子标记位于第181位。
第四方面，本发明提供了扩增含有上述第一方面所述SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛乳品质性状或乳品质性状早期选育中的应用。
优选地，所述特异性引物对序列如SEQ ID NO.2-3所示。
优选地，实现检测牦牛乳品质性状的方法包括：
(1)提取牦牛耳组织基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对将步骤(1)获得的待测牦牛耳组织的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GG牦牛个体不显著。
优选地，实现牦牛乳品质性状早期选育的方法包括：
(1)提取牦牛耳组织基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛耳组织的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GG牦牛个体不显著；选取基因型为TT的牦牛个体进行乳品质性状的早期选育
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过分析位点基因型与牦牛乳酪蛋白和蛋白质含量的相关性，发现与牦牛乳品质性状相关的SNP位点，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T；
根据基因分型检测，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT，所述基因型TT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质显著(p<0.05)高于基因型GG的个体；所述基因型TT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GT的牦牛个体不显著(p>0.05)；所述基因型GT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GG的牦牛个体不显著(p>0.05)；
通过PCR与基因测序法可快速鉴定对应性状，能够用于牦牛分子标记辅助育种，且不受牦牛品种、年龄的限制，因此，生产中可优先选择该位点基因型为TT型个体作为亲本进行规模养殖，大大加快对牦牛乳品质性状选择的准确性和有效性，提高牦牛养殖的经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例中三种基因型测序峰图。
具体实施方式
本发明通过对牦牛CCSER1基因片段上，连续设计多对引物对牦牛DNA进行PCR扩增，对其进行基因测序，其中一对引物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)扩增的目的片段(序列为SEQ ID NO.1)进行基因型分析时发现了一个SNP位点，共有三种3种基因型，通过MEGA11.0和BioEdit软件分析，筛查出一个SNP位点位于序列SEQ ID NO.1的片段的第181碱基处。再通过SPSS25.0软件分析牦牛个体的突变位点的基因型与乳品质性状的相关性，发现基因型TT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质显著(p<0.05)高于基因型GG的个体；基因型TT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GT的牦牛个体不显著(p>0.05)；基因型GT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GG的牦牛个体不显著(p>0.05)。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1SNP突变位点的鉴定
(1)甘南牦牛样本采集
本发明以甘南牦牛品种作为检测对象，从甘肃省甘南藏族自治州的夏河县牧场采集了162头牦牛乳样品和耳组织样本。泌乳牦牛的胎次均在2-3次。所采集的牦牛乳用于乳成分分析。分析包括测定脂肪、蛋白质、乳糖、酪蛋白、非脂乳固体、酸度和总固形物。采用MilkoScanTM FT120型乳成分测定仪(Danish FUCHS Analytical Instruments Ltd.,Hellerup,Denmark)进行测定。
(2)基因组DNA的分离、提取、纯化
采用磁珠法进行样品DNA提取。用Qubit荧光定量仪检测DNA样品的浓度。采用1.0％琼脂糖凝胶电泳和Thermo Scientific Nano Drop 2000c检测DNA的质量和浓度。
(3)引物设计及筛选
根据Ensemble公布的牦牛CCSER1基因(登录号为：ENSBGRG00000023090)，利用引物设计软件Primer 5.0在其DNA序列上设计多对引物，对牦牛DNA样品进行PCR扩增，并对基因测序结果进行分析，筛选出一对存在SNP位点的引物，其引物序列信息如下：
F：5’-AGCACCTTCTTCTTACTCAT-3’(SEQ ID NO.2所示)；
R：5’-ATTGTTCTGCTGCTGGGATT-3’(SEQ ID NO.3所示)。
(4)目标基因片段PCR扩增
PCR反应体系为40μL：2×Accurate Taq Master Mix(dye plus)20μL，DNA模板(100ng/μL)1μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，无酶无菌水17μL。PCR扩增程序：94℃
预变性30s；98℃变性10s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸2min，
4℃冷却。扩增结束后将扩增产物在1％琼脂糖凝胶下电泳检测。
(5)基因测序
经检测合格后的PCR反应液送往西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行双向的Sanger测序。其扩增的目的序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列的181位。突变位点处的测序峰图如图1所示。
实施例2SNP分子标记位点不同基因型与乳品质性状的相关性
(1)基因分型
所有个体重复实施例1中的(4)、(5)步骤，根据基因测序结果确定不同个体的具体基因型。在检测群体中检测到三种基因型，基因型频率和等位基因频率如表1所示。
对162头牦牛耳组织DNA样品采用PCR和基因测序进行基因分型发现，牦牛CCSER1基因SNP分子标记位点存在三种基因型，分别为纯合型GG、杂合型GT、纯合型TT。三种基因型频率为0.256(GG)、0.525(GT)和0.216(TT)。
表1牦牛CCSER1基因SNP位点的基因型和等位基因频率
(2)SNP基因型与乳品质性状表型值关联分析
为了确定本发明制备的SNP标记与牦牛乳品质性状的差异是否相关，利用SPSS25.0软件对SEQ ID NO.1的片段上的181位的SNP位点的三种基因型与牦牛酪蛋白、蛋白质、脂肪、非脂乳固体(SNF)、乳糖、酸度和总固形物(TS)的性状表型值分别进行最小二乘的统计分析关联分析，计算该SNP位点基因型与乳品质性状的关联性，结果见表2。
采用的模型如下：
Yj＝μ+Gj+ej；其中Yj表示观察到的乳品质性状值；Gj代表基因型j的遗传效应；μ代表每个性状的总平均值；ej表示随即残差效应。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE表示。
表2牦牛CCSER1基因多态性与乳品质性状的关联分析
注：不同上标小写字母表示差异显著(P<0.05)，*表示差异显著(P<0.05)
由表2可知，牦牛第6号染色体的第91615789bp位点多态性与牦牛乳酪蛋白和蛋白质具有显著相关性(P<0.05)。基因型TT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质显著(p<0.05)高于基因型GG的个体；基因型TT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GT的牦牛个体不显著(p>0.05)；基因型GT的牦牛个体的乳酪蛋白和蛋白质与基因型GG的牦牛个体不显著(p>0.05)。
本实施例鉴定了一个与牦牛乳品质性状显著相关的SNP标记，因此可以选择优势基因型个体的选留，将有助于提高牦牛的乳品质性状。
综合以上结果，本发明的突变位点可作为提高牦牛产奶性能的潜在遗传标记用于牦牛的辅助选择。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.检测SNP分子标记的试剂在检测牦牛乳酪蛋白中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T；根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GG牦牛个体不显著。
2.检测SNP分子标记的试剂在牦牛乳酪蛋白性状早期选育中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T；根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GG牦牛个体不显著。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，含有所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第181位。
5.扩增含有SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛乳酪蛋白或牦牛乳酪蛋白性状早期选育中的应用；所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本European Nucleotide Archive登录号为GCA_005887515.1的第6号染色体的第91615789位，突变碱基为G或T；根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GG牦牛个体不显著。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对序列如SEQ ID NO.2-3所示。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，实现检测牦牛乳酪蛋白的方法包括：
(1)提取牦牛耳组织基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对将步骤(1)获得的待测牦牛耳组织的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GG牦牛个体不显著。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，实现牦牛乳酪蛋白性状早期选育的方法包括：
(1)提取牦牛耳组织基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛耳组织的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为GG、GT和TT；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白显著高于基因型GG；所述基因型TT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GT牦牛个体不显著；所述基因型GT牦牛个体的牦牛乳酪蛋白与基因型GG牦牛个体不显著；选取基因型为TT的牦牛个体进行牦牛乳酪蛋白性状的早期选育。
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