CN118166125A - 一种与牦牛乳密度、乳脂肪含量相关的snp位点及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，具体涉及一种与牦牛乳密度、乳脂肪含量相关的SNP位点及应用。所述SNP位点位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T。本发明还提供了检测上述SNP位点的试剂在检测牦牛乳密度、乳脂肪含量辅助育种中的应用，该分子标记可应用于牦牛乳密度、乳脂肪含量性状辅助选择，检测方法快速、准确；通过筛选该SNP分子标记的基因型能够加快对牦牛乳密度、乳脂肪含量性状选择的准确性和有效性，提高牦牛养殖的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种与牦牛乳密度、乳脂肪含量相关的SNP位点及应用。
背景技术
牦牛(Yak,Bos grunnies)分布于中国青藏高原及其周围海拔3000米以上的高寒地区，主要依靠天然草场放牧来获取其生长需要的营养，很少进行人工补饲。牦牛肉和乳是真正的无污染绿色食品，具有很高的开发利用价值。是当地人民重要的生活生产资料来源。牦牛奶产量低，但富含丰富的营养物质。与牛奶相比，牦牛奶在乳蛋白、乳脂肪和氨基酸含量方面具有明显优势。牦牛的商品化和产业化直接影响着高原畜牧业的经济来源和发展水平，是青藏高原经济的重要支撑。因此，选育出具有优良乳品质的牦牛品种是非常有必要的。
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是由基因组水平上的单核苷酸变异引起的DNA序列多态性。这类变异包括单个碱基的转换、倒位、插入和缺失。在编码区出现的SNP会影响基因的功能导致生物性状的改变，因此可以作为与某些性状相关的生物标记。SNP对于畜禽品种鉴定、遗传育种、遗传资源保护、疾病诊断等多个方面都具有重要作用。利用SNP进行分子标记辅助育种不仅可以实现对畜禽优良性状的精准定向改良，提高育种效率，还能确保育成品种的遗传稳定性和优良性状的持久性，推动畜牧业创新进步。
磷酸二酯酶3A(Phosphodiesterase 3A,PDE3A)基因隶属于PDE3家族，PDE3家族通常被认定为受cGMP抑制的cAMP水解PDE，这意味着PDE3在细胞内的主要作用是调控cAMP的水平。PDE3A基因羧基末端包含一个催化结构域和一个氨基末端结构域，氨基末端结构域对于酶定位到羧基末端的颗粒部分和催化结构域具有重要。PDE3A基因编码的蛋白可启动3',5'-环状AMP磷酸二酯酶活性，通过水解cAMP，参与细胞凋亡过程的负调控；负调节cAMP介导的信号。PDE3A基因在维持细胞稳态和调控细胞功能方面扮演着重要角色。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的在于提供一种与牦牛乳密度、乳脂肪含量相关的SNP分子标记，具有快速准确，检测成本低的特点。
具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种与牦牛乳密度、乳脂肪含量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T。
第二方面，本发明提供了检测与牦牛乳密度和乳脂肪含量相关的SNP分子标记的试剂在检测牦牛乳品质性状中的应用，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T。
优选地，根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳脂肪含量显著高于基因型CC；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT。
优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。
优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第401位。
第三方面，本发明提供了检测与牦牛乳密度和乳脂肪含量相关的SNP分子标记的试剂在检测牦牛乳品质性状早期选育中的应用，，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T。
优选地，根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳脂肪含量显著高于基因型CC；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT。
优选地，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。
优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第401位。
第四方面，本发明提供了扩增含有上述第一方面所述SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛乳密度、乳脂肪含量性状早期选育中的应用。
优选地，所述特异性引物对序列如SEQ ID NO.2-3所示。
优选地，实现检测牦牛乳密度、乳脂肪含量性状的方法包括：
(1)提取牦牛基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对将步骤(1)获得的待测牦牛的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳脂肪含量显著高于基因型CC；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT。
优选地，实现牦牛乳密度、乳脂肪含量性状早期选育的方法包括：
(1)提取牦牛基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳脂肪含量显著高于基因型CC；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT；选取基因型为TT的牦牛个体进行乳脂肪含量性状的早期选育；选取基因型为CC的牦牛个体进行乳密度性状的早期选育。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过分析位点基因型与牦牛乳密度、乳脂肪含量的相关性，发现与牦牛乳品质性状相关的SNP位点，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T；根据基因分型检测，将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT，所述基因型TT的牦牛个体的乳脂肪显著(p<0.05)高于基因型CC的个体。所述基因型TT的牦牛个体的乳脂肪与基因型CT的牦牛个体不显著(p>0.05)；所述基因型CT的牦牛个体的乳脂肪与基因型CC的牦牛个体不显著(p>0.05)；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT(P<0.05)；所述基因型CC牦牛个体的乳密度与基因型CT牦牛个体不显著(P>0.05)；所述基因型CT牦牛个体的乳密度与基因型TT牦牛个体不显著(P>0.05)。通过PCR与基因测序法可快速鉴定对应性状，能够用于牦牛分子标记辅助育种，且不受牦牛品种、年龄的限制，因此，生产中可优先选择该位点基因型为TT型个体作为亲本进行规模养殖，大大加快对牦牛乳品质性状选择的准确性和有效性，提高牦牛养殖的经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例中三种基因型测序峰图。
具体实施方式
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是基因组DNA序列最基本的变异形式，由DNA序列中的单个碱基突变引起。通过确定基因组中特定位置的核苷酸变异，以及进行基因型分型，为选种工作提供了高效且精准的手段。通过利用SNPs进行畜禽遗传育种研究，我们可以更深入地了解畜禽的遗传背景，揭示其复杂性状的遗传机制，从而为优化畜禽品种、提高生产性能及加速畜禽遗传资源的保护和利用提供有力的支持。随着技术的不断进步和应用领域的不断拓宽，SNPs将在畜禽遗传育种研究领域展现出更大的潜力与价值。
本发明通过对牦牛PDE3A基因片段(序列为SEQ ID NO.1)上连续设计多对引物对牦牛DNA进行PCR扩增，对其进行基因测序，其中一对引物(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)扩增的目的片段进行基因型分析时发现了一个SNP位点,共有三种3种基因型，通过MEGA7.0和BioEdit软件分析，筛查出一个SNP位点位于序列SEQ ID NO.1的片段的第401碱基处。再通过SPSS23.0软件分析突变位点的基因型与乳品质性状的相关性，发现TT型个体的乳脂含量显著高于CT和CC基因型个体乳品质性状的表型值(p<0.05)；CC型个体的乳密度显著高于CT和TT基因型个体乳品质性状的表型值(p<0.05)。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1SNP突变位点的鉴定
(1)甘南牦牛样本采集
本发明以甘南牦牛品种作为检测对象，从甘肃省甘南藏族自治州的夏河县牧场采集了162头牦牛乳样品和耳组织样本。泌乳牦牛的胎次均在2-3次。所采集的牦牛乳用于乳成分分析。分析包括测定酪蛋白、乳密度、蛋白质、脂肪、总固体物(TS)、脱脂乳固体(SNF)和乳糖。采用MilkoScanTM FT120型乳成分测定仪(Danish FUCHS Analytical InstrumentsLtd.,Hellerup,Denmark)进行测定。
(2)基因组DNA的分离、提取、纯化
使用磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒从甘南牦牛耳组织样本中提取基因组DNA。通过Qubit荧光定量仪器检测DNA样品的浓度。用3％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的完整性。
(3)引物设计及筛选
根据Ensemble公布的牦牛PDE3A基因(登录号为：ENSBGRG00000003042)，利用引物设计软件Primer 5.0在其DNA序列上设计多对引物，对牦牛DNA样品进行PCR扩增，并对基因测序结果进行分析，筛选出一对存在SNP位点的引物，其引物序列信息如下：
F:5’-TATGGGAAAGGAAGAGTGGC-3’(SEQ ID NO.2所示)；
R:5’-TCGTTCGTATTCGCTTGGTG-3’(SEQ ID NO.3所示)。
(4)目标基因片段PCR扩增
PCR反应体系为40μL：2×Accurate Taq Master Mix(dye plus)20μL，DNA模板(100ng/μL)1μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，无酶无菌水17μL。PCR扩增程序：94℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸2min，4℃冷却。扩增结束后将扩增产物在3％琼脂糖凝胶下电泳检测。
(5)基因测序
经检测合格后的PCR反应液送往西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行双向的Sanger测序。其扩增的目的序列如SEQ ID NO.1所示，SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列的401位。突变位点处的测序峰图如图1所示。
实施例2SNP分子标记位点不同基因型与乳品质性状的相关性
(1)基因分型
所有个体重复实施例1中的(4)、(5)步骤，根据基因测序结果确定不同个体的具体基因型。在检测群体中检测到三种基因型，基因型频率和等位基因频率如表1所示。
对162头牦牛耳组织DNA样品采用PCR和基因测序进行基因分型发现，牦牛PDE3A基因SNP分子标记位点存在三种基因型，分别为纯合型CC、杂合型CT、纯合型TT。三种基因型频率为0.290(CC)、0.475(CT)和0.235(TT)。
表1牦牛PDE3A基因SNP位点的基因型和等位基因频率
(2)SNP基因型与乳品质性状表型值关联分析
为了确定本发明制备的SNP标记与牦牛乳品质性状的差异是否相关，利用SPSS223.0软件对SEQ ID NO.1的片段上的401位的SNP位点的三种基因型与牦牛酪蛋白、乳密度、蛋白质、脂肪、总固体物(TS)、脱脂乳固体(SNF)和乳糖的性状表型值分别进行最小二乘的统计分析关联分析，计算该SNP位点基因型与乳品质性状的关联性，结果见表2。
采用的模型如下：
Yj＝μ+Gj+ej；其中Yj表示测定的乳品质性状值；μ代表每个性状的总平均值；Gj代表基因型j的遗传效应；ej表示随机误差效应。各组数据间的差异采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE表示。
表2牦牛PDE3A基因多态性与乳品质性状的关联分析
注：不同上标小写字母表示差异显著(P<0.05)，*表示差异显著(P<0.05)
由表2可知，基因型为TT纯合型个体的乳脂含量显著高于CT与CC基因型个体乳品质性状的表型值(p<0.05)。基因型TT的牦牛个体的乳脂肪与基因型CT的牦牛个体不显著(p>0.05)；基因型CT的牦牛个体的乳脂肪与基因型CC的牦牛个体不显著(p>0.05)；基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT(P<0.05)；所述基因型CC牦牛个体的乳密度与基因型CT牦牛个体不显著(P>0.05)；所述基因型CT牦牛个体的乳密度与基因型TT牦牛个体不显著(P>0.05)。
本实施例鉴定了一个与牦牛乳品质性状显著相关的SNP标记，因此可以选择优势基因型个体的选留，将有助于提高牦牛的乳品质性状。
综合以上结果，本发明的突变位点可作为提高牦牛产奶性能的潜在遗传标记用于牦牛的辅助选择。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与牦牛乳密度、乳脂肪含量相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T。
2.检测与牦牛乳密度和乳脂肪含量相关的SNP分子标记的试剂在检测牦牛乳品质性状中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T。
3.检测与牦牛乳密度和乳脂肪含量相关的SNP分子标记的试剂在检测牦牛乳品质性状早期选育中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于牦牛参考基因组Bosgu_v3.0版本Ensemble登录号为ENSBGRG00000003042的第5号染色体的第13729718位，突变碱基为C或T。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，根据所述SNP分子标记的突变碱基，将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳脂肪含量显著高于基因型CC；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括用于扩增含有所述SNP分子标记的核苷酸序列的引物对。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第401位。
7.扩增含有权利要求1所述SNP分子标记的核苷酸序列的特异性引物对在用于检测牦牛乳密度、乳脂肪含量性状早期选育中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对序列如SEQ ID NO.2-3所示。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，实现检测牦牛乳密度、乳脂肪含量性状的方法包括：
(1)提取牦牛基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对将步骤(1)获得的待测牦牛的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳脂肪含量显著高于基因型CC；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，实现牦牛乳密度、乳脂肪含量性状早期选育的方法包括：
(1)提取牦牛基因组DNA为模板DNA；
(2)利用特异性引物对，将步骤(1)获得的待测牦牛的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
(3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化，进行基因分型检测，将牦牛个体基因型分为将牦牛个体基因型分为CC、CT和TT；所述基因型TT牦牛个体的乳脂肪含量显著高于基因型CC；所述基因型CC牦牛个体的乳密度显著高于基因型TT；选取基因型为TT的牦牛个体进行乳脂肪含量性状的早期选育；选取基因型为CC的牦牛个体进行乳密度性状的早期选育。
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