CN109337987A - 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用，所述与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记为一组分子标记，分别位于BMPR1B基因、BMP15基因、GDF9基因和FSHR基因中。本发明利用这一组分子标记可以迅速预测努比亚山羊的产羔性状，可实现努比亚山羊产羔性状的改良，大大提高了分子标记辅助选择的育种效率。
Description
技术领域
本发明涉及一组分子标记及其组合应用，特别涉及一种与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用。
背景技术
努比亚山羊原产于非洲东北部的埃及、利比亚、英国、美国等国家，东欧及南非等都有分布。我国在1995年就引入饲养，用于改良国内的山羊。努比亚山羊体型大，耐粗饲，适应性强，生长发育快，繁殖力强，遗传性能稳定，因其肉质细嫩，无膻味等特点逐渐被人们所喜爱。在生产性能方面，公羊8-10月龄、母羊6-7月龄就可以开始配种繁殖，年产1.7胎，产羔率一般为初产193％。母羔初生重2.3kg左右，双月重12.4kg左右；6月龄体重23.8kg，体高55.1cm；12月龄体重34.9kg，体高60.7cm。成年公羊体重可达到125kg；成年母羊达到80.5kg。在调入地表现出了良好的适应性和很好的生产能力，广西作为山羊传统养殖区，年出栏肉羊200多万只，努比亚山羊作为引进品种，已经在全区广泛养殖，是用来改良本地山羊的优良品种。其产出效益是本土山羊的2～3倍。努比亚山羊改良调入地母羊成效显著。加强对努比亚山羊品种的研究与保护，可以促进地方品种品质选育和改良水平的提高，对防止品种退化、保持遗传优势等具有重要的理论及现实意义。
山羊的产羔性状是影响山羊养殖业的重要经济性状之一。在肉羊生产中,收入增加的25％是多羔作用的结果。国内外对山羊的产羔数研究较少，大多数都集中在对绵羊的研究上，而绵羊多羔性方面的研究几乎全部集中在寻找多羔基因与单核苷酸多态性突变上。近年来，对山羊多羔性方面的研究也逐渐兴起，其研究方法大多是借鉴绵羊研究的方法，山羊的多羔性受到基因、年龄、季节和营养等的影响,其中基因是一个重要因素。山羊多羔性状的遗传力较低，受微效基因控制。
随着技术的进步，很多候选基因被发现，在生产中利用分子标记对多羔性状的基因型进行选择取得了很大进展。1991年，在Romney羊上发现了BMP15基因，随后陆续发现了BMP15基因上有6个不同的突变位点，分别为FecXI、FecXH、FecXG、FecXB、FecXL、FecXR，其中任何一个突变杂合的所有个体都具有较高的排卵数，而突变纯合个体则由于正常的卵巢卵泡发育受阻而不育。2001年，在BMPR1B基因上发现了FecB突变，该突变对的羊排卵数具有加性效应，对产羔数为部分显性效应，每增加一个拷贝就额外多排卵1.65枚，除此之外，人们陆续发现BMPR1B基因得其他20个新的突变位点，其中3个SNPs(G922T、T1043C、G192T)导致了氨基酸的改变，但没有影响产羔数。GDF9是第1个被发现由卵母细胞分泌的生长因子，其mRNA在绵羊卵泡发育的各个阶段都有表达，在剑桥羊和Belclare羊中发现GDF9基因与BMP15基因突变表型相似，GDF9基因突变杂合个体产羔数增加，纯合不育。GDF9基因对排卵率的影响要大于BMP15基因，在剑桥羊和Belclare羊上单拷贝的GDF9基因突变可增加排卵数1.4个。国内外对FSHR基因作为繁殖性状候选基因进行了一些研究，该基因直接影响到FSH激素的分泌，从而能影响到产羔性状。羊产羔性状相关的基因还有很多，但大部分都是先研究了这些基因与其它动物的繁殖力的相关性然后才在羊的产羔数上进行研究，比如ESR基因、RBP4基因、IGFs基因、IGFBP3基因、PRL基因、PRLR基因、RARG基因、VEGF基因、PROP1基因等，也有些是首先在羊上发现，但至今尚未被研究透彻的基因，比如Woodlands基因、Thoka基因、Lacaune基因、Olkuska基因、Belle-Ile基因、NZ Longwool基因、SLC4A10基因、TBR1基因、SENP7基因、WDFY4基因、TMEM26基因、BICCI基因等，还有很多基因尚未被发现，这些基因都是与产羔性状相关的潜在候选基因，亟待人们对其进行研究和利用。
随着科技的发展，我们可利用分子生物学技术在国内外的各个山羊品种中筛选出与产羔性状相关的候选基因，再利用确定的候选基因来研究主效基因，然后在生产上通过标记辅助选择迅速固定主基因，进行杂交，使产羔数高的优点与其他有价值的遗传特性平衡。运用标记辅助渗入技术，可能培育出多个优良性状(如产羔数多、生长快、体型大)结合于一体的新的母本群体，从而提高山羊养殖的经济效益和社会效益。
然而对于山羊产羔性状，参与调控的基因数量、种类较多，基因间的互作关系对产羔性状的共同作用及影响机制复杂，因此不能仅根据单个基因的变异指导性状改良选育。目前市场上有可用于山羊的商业SNP芯片，可以通过全基因组关联分析实现全基因组分子标记的筛选及鉴定，但芯片检测成本太高，不利于实际育种中的大规模检测应用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的是提供与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用。
本发明提供一组与努比亚山羊产羔性状相关分子标记，分别为：
(1)BMPR1B基因序列第1内含子第1664位点，该位点具有A/G碱基的变异；该位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)BMP15基因序列第2外显子第480位点，该位点具有C/G碱基的变异；该位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:2所示；
(3)GDF9基因序列第2外显子第421位点，该位点具有C/T碱基的变异；该位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:3所示；
(4)FSHR基因序列第1外显子第6位点、第5内含子第42位点、第5内含子第266位点，均具有C/T碱基的变异；
FSHR基因序列第1外显子第6位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:4所示，FSHR基因序列第5内含子第42位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:5所示，FSHR基因序列第5内含子第266位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:6所示；
(5)FSHR基因序列的3’UTR第12位点，该位点具有C/A碱基的变异；该位点前后100bp的序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明还提供了一组用于获得上述分子标记的引物，由如下引物对组成：
(1)扩增BMPR1B基因序列第1内含子第1664位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:8所示，反向引物如SEQ ID NO:9所示；
(2)扩增BMP15基因序列第2外显子第480位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:10所示，反向引物如SEQ ID NO:11所示；
(3)扩增GDF9基因序列第2外显子第421位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:12所示，反向引物如SEQ ID NO:13所示；
(4)扩增FSHR基因序列第1外显子第6位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:14所示，反向引物如SEQ ID NO:15所示；
扩增FSHR基因序列第5内含子第42位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:16所示，反向引物如SEQ ID NO:17所示；
扩增FSHR基因序列第5内含子第266位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:18所示，反向引物如SEQ ID NO:19所示；
(5)扩增FSHR基因序列的3’UTR第12位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:20所示，反向引物如SEQ ID NO:21所示。
本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定努比亚山羊产羔性状的试剂盒，试剂盒中包括有如SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:21所示的引物。
一种鉴定或辅助鉴定努比亚山羊产羔性状的方法，包括以下步骤：
(1)提取努比亚山羊的基因组DNA，并混合成DNA池；
(2)以待测努比亚山羊的基因组DNA池为模板，利用上述引物对进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行直接测序，通过观察测序峰图，如果扩增序列的峰图上存在叠峰，且重叠部分大于90％，则认为该位点存在多态性，否则不能认为存在多态性；
(4)进一步进行基因分型检测，本发明对基因分型的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行；优选地，可以利用时间飞行质谱来检测；
优选地，步骤(1)中，从羊血中提取的基因组DNA的浓度为50ng/μL，取1.5μL DNA溶液，用分光光度计检测OD260/OD280值，选取OD260/OD280值为1.6-1.9的纯品DNA，从20个基因组DNA样品各取0.5μL混在一个离心管里，使其混合均匀，成为一个混合池；
优选地，步骤(2)中，所述PCR扩增反应使用的扩增体系为：15μL 2×Taq MasterMix(Dye Plus)，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，DNA模板2μL，灭菌ddH2O加至总体系为30μL；
优选地，步骤(2)中，所述的PCR扩增反应的条件为：预变性：94℃5min，变性：94℃30s，退火：55℃30s，延伸：72℃50s，终延伸：72℃5min；其中，变性、退火和延伸三个步骤循环34次，其余各步骤都是一次；
优选地，步骤(4)中，使用时间飞行质谱来进行基因分型的引物如下：
BMPR1B基因序列第1内含子第1664位点：正向引物如SEQ ID NO:22所示，反向引物如SEQ ID NO:23所示，延伸引物如SEQ ID NO:24所示；
BMP15基因序列第2外显子第480位点：正向引物如SEQ ID NO:25所示，反向引物如SEQ ID NO:26所示，延伸引物如SEQ ID NO:27所示；
GDF9基因序列第2外显子第421位点：正向引物如SEQ ID NO:28所示，反向引物如SEQ ID NO:29所示，延伸引物如SEQ ID NO:30所示；
FSHR基因序列第1外显子第6位点：正向引物如SEQ ID NO:31所示，反向引物如SEQID NO:32所示，延伸引物如SEQ ID NO:33所示；
FSHR基因序列第5内含子第42位点：正向引物如SEQ ID NO:34所示，反向引物如SEQ ID NO:35所示，延伸引物如SEQ ID NO:36所示；
FSHR基因序列第5内含子第266位点：正向引物如SEQ ID NO:37所示，反向引物如SEQ ID NO:38所示，延伸引物如SEQ ID NO:39所示；
FSHR基因序列的3’UTR第12位点：正向引物如SEQ ID NO:40所示，反向引物如SEQID NO:41所示，延伸引物如SEQ ID NO:42所示。
进一步地，本发明还提供了上述任一所述分子标记、上述引物、上述试剂盒在努比亚山羊分子标记辅助育种中的应用。
本发明的有益效果在于：
通过对努比亚山羊的7处分子标记组合进行快速鉴定，实现努比亚山羊产羔性状的改良，大大提高了分子标记辅助选择的育种效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
努比亚山羊购自广西扶绥广羊农牧有限公司
一、DNA的提取
提取待检测的努比亚山羊的血液，使用天根生化科技有限公司的血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA，从羊血中提取的基因组DNA的浓度为50ng/μL，取1.5μL DNA溶液，用分光光度计检测OD260/OD280值，选取OD260/OD280值为1.6-1.9的纯品DNA，从20个基因组DNA样品各取0.5μL混在一个离心管里，使其混合均匀，成为一个DNA混合池。
二、引物设计
分别参考山羊BMPR1B基因(GenBank登录号NC_030813.1)、BMP15基因(GenBank登录号NW_017189516.1)、GDF9基因(GenBank登录号NC_030814.1)和FSHR基因(GenBank登录号NC_030818.1)，设计扩增含有多态性位点的分子标记引物，如表1所示：
三、PCR扩增反应
PCR反应体系(总体系30)：15μL 2×Taq Master Mix(Dye Plus)，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，DNA混合池模板2μL，灭菌ddH2O加至总体系为30μL；扩增不同分子标记位点时，分别使用对应该位点的引物。
PCR反应条件：
①预变性：94℃5min；
②变性：94℃30s；
③退火：55℃30s；
④延伸：72℃50s；
重复第②-④步骤35个循环
⑤最后延伸：72℃5min；
四、PCR产物测序
PCR扩增产物先用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，再送交深圳华大基因进行测序，通过观察测序峰图，如果扩增序列的峰图上存在叠峰，且重叠部分大于90％，则认为该位点存在多态性，否则不能认为存在多态性。
五、基因分型
1、设计时间飞行质谱引物
根据突变位点所在位置前后100bp的序列，按时间飞行质谱检测等位基因的方法，设计相应的等位基因分型引物如下表：
2、时间飞行质谱和数据分析
从20管待测DNA样品中每管取出的0.5μL混在一个离心管里，使其混合均匀，成为一个DNA混合池，使用上述引物进行时间飞行质谱检测。用SEQMAN软件进行测序峰图检测，用Meglin7.0软件进行核苷酸序列比对，计算Hardy-Weinberg平衡；EXCEL和SAS进行数据统计。
3、关联性分析
采用SAS软件的一般线性混合效应模型分析频率大于0.05的等位基因状态(存在或缺失)和基因型对努比亚山羊产羔性状的影响。等位基因状态对产羔性状的影响的研究模型：Y＝基因效应+胎次效应+随机残差效应。其中Y为产羔数或初生重或断奶重。
4、结果
4.1努比亚山羊产羔性状相关基因PCR产物测序及多态性位点检测
PCR产物条带清晰单一，大小符合目的片段大小。PCR引物、PCR反应条件体系和反应程序设计合理，能够有效而准确的扩增出目的片段，表明提取的山羊血液基因组DNA符合标准。PCR扩增产物经送往深圳华大基因测序，通过BLAST软件比对，发现这些基因上共有15处突变位点，其中1个位于BMPR1B基因上，1个位于GDF9基因上，1个位于BMPR15基因上，4个位于FSHR基因上。突变位点处叠峰重叠部分都在90％以上，说明这些位点的多态性是可信的。
4.2等位基因和基因型在努比亚山羊中的频率
经过序列的比对分析，将存在突变位点的片段进行MassARRAY时间飞行质谱检测系统基因分型。对这些位点进行基因分型，并进行基因型和基因频率的统计和分析。结果显示，BMPR1B第1内含子第1664位发生A→G突变，A和G的基因频率分别为0.06和0.94，多态信息含量为0.11，属于低度多态；BMP15第2外显子第480位发生C→G突变，A和G的基因频率分别为0.75和0.25，多态信息含量为0.31，属于中度多态；GDF9第2外显子第421位发生C→T突变，C和T的基因频率分别为0.69和0.31，多态信息含量为0.33，属于中度多态；FSHR基因上共有四处多态性位点，分别为第1外显子第6位、第5内含子第42位、第5内含子第266位和3’UTR第12位，其中前面三个均发生C→T突变，多态信息含量也都处于中度多态，3’UTR第12位发生C→A突变，C和A的基因频率分别为0.44和0.56，多态信息含量为0.37，属于中度多态。经χ2适合性检验表明这些位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。
4.3SNPs与山羊产羔性状(产羔数、初生重、断奶重)的关联分析
BMPR1B第1内含子第1664位发生A→G突变，GG型母羊的产羔数比GA型的母羊后代的平均断奶重重0.26kg；
BMP15第2外显子的第480位发生C→G突变，GG型母羊后代的平均初生重和平均断奶重分别比CC型母羊后代多0.17kg和0.21kg；
GDF9基因第2外显子第421位点C→T突变，TT型个体母羊平均产羔数比CC型个体母羊的平均产羔数多0.19只，其后代平均断奶重重0.44kg；
FSHR基因第1外显子第6位点、第5内含子第42位点、第5内含子第266位点均发生C→T突变。其中，第1外显子第6位点TT基因型母羊的平均产羔数比CC基因型母羊平均产羔数多0.13只；第5内含子第42位点TT基因型母羊的平均产羔数比CC基因型母羊平均产羔数多0.04只；第5内含子第266位点TT基因型母羊的平均产羔数比CC基因型母羊平均产羔数多0.07只；
FSHR基因的3’UTR第12位点发生C→A突变，AA型母羊后代的平均断奶重比CC型母羊后代的平均断奶重轻0.94kg。
从上述数据分析可以看出，上述7个位点的突变均有利于提高努比亚山羊的产羔性能。
序列表
<110> 广西大学
<120> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用
<130> ZYWS
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 202
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Nubian ibex)
<400> 1
actaaaacat ccagaatgca tgtaatgaaa aatgtttaat gtttcgagca agatttctgg 60
tatatatgta tctattgagt aatataagtt ttaagtgatt gatgttctcc acttacatgc 120
ttttcaccta ttttgaagct cagatttttg ccaatagctt tcatacctct ggtgattttt 180
attaccttat ttagtagagg ag 202
<210> 2
<211> 202
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Nubian ibex)
<400> 2
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tacagaaaaa gacccttctc ttctcttgag gagggctcgt cgaagcaggc agtattgcat 120
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<210> 3
<211> 202
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Nubian ibex)
<400> 3
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<211> 202
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Nubian ibex)
<400> 4
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<210> 5
<211> 202
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Nubian ibex)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Nubian ibex)
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<211> 202
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Nubian ibex)
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(102)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 7
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaccggaaa tgagtacgtt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 9
taggacatgg caactcgaca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 10
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<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 12
atcccaccct gacgtttaag gc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 13
tcctcccaaa ggcatagaca gg 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 14
cctgtcttct gagctgcacc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 15
ccacagggca ggagtgttgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 16
tttggaaagc ctagacggtg 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 17
tgggaaaagg taaatacatt g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 18
gtctacactc tgaccgccat c 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 19
ccttatggat gtgccaggga g 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 20
gtctacactc tgaccgccat c 21
<210> 21
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 21
ccttatggat gtgccaggga g 21
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 22
acgttggatg ggtgaaaagc atgtaagtgg 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 23
acgttggatg gtttcgagca agatttctgg 30
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 24
cgagcatgta agtggagaac a 21
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<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 25
acgttggatg gccaggaact tcagatgcaa 30
<210> 26
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<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 26
acgttggatg aagacccttc tcttctcttg 30
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 27
gaggtgcaat actgcctgct t 21
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 28
acgttggatg gccctcactg cttttgtatc 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 29
acgttggatg aaggcttcct tttagggtgg 30
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 30
ggtggtatct gaacgacaca agtg 24
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 31
acgttggatg caagcaggtg gatggataag 30
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<212> DNA
<213> 努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
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acgttggatg tgagcccaag ctcaggaatg 30
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<211> 19
<212> DNA
<213> 努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 33
atggataagt aaacatggc 19
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 34
acgttggatg ggtggtcacc aactctttac 30
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 35
acgttggatg ggctgtagac tacacaatgc 30
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 36
ccaactcttt actcatagct g 21
<210> 37
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<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 37
acgttggatg ggtggtcacc aactctttac 30
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<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
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acgttggatg ggctgtagac tacacaatgc 30
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<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 39
ccaactcttt actcatagct g 21
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<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg catggcatat tcttcaaagg c 31
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<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttggatg ttcccctaag acatttagcc 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记及其组合应用(Artificial Sequence)
<400> 42
tgtaattcaa cactcagaaa cattt 25
Claims (10)
1.一种与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记，其特征在于：所述与努比亚山羊产羔性状相关的分子标记为一组分子标记，分别为：
(1)BMPR1B基因序列第1内含子第1664位点，该位点具有A/G碱基的变异；
(2)BMP15基因序列第2外显子第480位点，该位点具有C/G碱基的变异；
(3)GDF9基因序列第2外显子第421位点，该位点具有C/T碱基的变异；
(4)FSHR基因序列第1外显子第6位点、第5内含子第42位点、第5内含子第266位点，均具有C/T碱基的变异；
(5)FSHR基因序列的3’UTR第12位点，该位点具有C/A碱基的变异。
2.用于获得权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，包括：
(1)扩增BMPR1B基因序列第1内含子第1664位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:8所示，反向引物如SEQ ID NO:9所示；
(2)扩增BMP15基因序列第2外显子第480位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:10所示，反向引物如SEQ ID NO:11所示；
(3)扩增GDF9基因序列第2外显子第421位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:12所示，反向引物如SEQ ID NO:13所示；
(4)扩增FSHR基因序列第1外显子第6位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:14所示，反向引物如SEQ ID NO:15所示；
扩增FSHR基因序列第5内含子第42位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:16所示，反向引物如SEQ ID NO:17所示；
扩增FSHR基因序列第5内含子第266位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:18所示，反向引物如SEQ ID NO:19所示；
(5)扩增FSHR基因序列的3’UTR第12位点的引物对：
正向引物如SEQ ID NO:20所示，反向引物如SEQ ID NO:21所示。
3.一种鉴定或辅助鉴定努比亚山羊产羔性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测努比亚山羊的基因组DNA，并混合成DNA池；
(2)以待测努比亚山羊的基因组DNA池为模板，利用权利要求2所述引物对分别进行PCR扩增，得到带有权利要求1所述分子标记的DNA片段；
(3)对PCR扩增产物进行直接测序，通过观察测序峰图，如果扩增序列的峰图上存在叠峰，且重叠部分大于90％，则认为该位点存在多态性，否则不能认为存在多态性；
(4)进一步使用时间飞行质谱进行基因分型检测，判读分子标记处的基因多态性。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，从羊血中提取的基因组DNA的浓度为50ng/μL，取1.5μL DNA溶液，用分光光度计检测OD260/OD280值，选取OD260/OD280值为1.6-1.9的纯品DNA，从20个基因组DNA样品各取0.5μL混在一个离心管里，使其混合均匀，成为一个混合池。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述PCR扩增反应使用的扩增体系为：15μL 2×Taq Master Mix(Dye Plus)，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，DNA模板2μL，灭菌ddH2O加至总体系为30μL；所述的PCR扩增反应的条件为：预变性：94℃5min，变性：94℃30s，退火：55℃30s，延伸：72℃50s，终延伸：72℃5min；其中，变性、退火和延伸三个步骤循环34次，其余各步骤都是一次。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：使用时间飞行质谱来进行基因分型的引物如下：
BMPR1B基因序列第1内含子第1664位点：正向引物如SEQ ID NO:22所示，反向引物如SEQ ID NO:23所示，延伸引物如SEQ ID NO:24所示；
BMP15基因序列第2外显子第480位点：正向引物如SEQ ID NO:25所示，反向引物如SEQID NO:26所示，延伸引物如SEQ ID NO:27所示；
GDF9基因序列第2外显子第421位点：正向引物如SEQ ID NO:28所示，反向引物如SEQID NO:29所示，延伸引物如SEQ ID NO:30所示；
FSHR基因序列第1外显子第6位点：正向引物如SEQ ID NO:31所示，反向引物如SEQ IDNO:32所示，延伸引物如SEQ ID NO:33所示；
FSHR基因序列第5内含子第42位点：正向引物如SEQ ID NO:34所示，反向引物如SEQ IDNO:35所示，延伸引物如SEQ ID NO:36所示；
FSHR基因序列第5内含子第266位点：正向引物如SEQ ID NO:37所示，反向引物如SEQID NO:38所示，延伸引物如SEQ ID NO:39所示；
FSHR基因序列的3’UTR第12位点：正向引物如SEQ ID NO:40所示，反向引物如SEQ IDNO:41所示，延伸引物如SEQ ID NO:42所示。
7.一种鉴定或辅助鉴定努比亚山羊产羔性状的试剂盒，其特征在于：试剂盒中包括有如SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:21所示的引物。
8.权利要求1所述的分子标记在努比亚山羊分子标记辅助育种中的应用。
9.权利要求2所述的引物对在努比亚山羊分子标记辅助育种中的应用。
10.权利要求3所述的试剂盒在努比亚山羊分子标记辅助育种中的应用。
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