CN103103182B

CN103103182B - 皱纹盘鲍微卫星分子标记及制备方法

Info

Publication number: CN103103182B
Application number: CN201310024363.4A
Authority: CN
Inventors: 刘小林; 李杨; 刘明泰; 李丹; 许淑芬; 李旭光; 张艳
Original assignee: DALIAN HAIBAO FISHERY Co Ltd
Current assignee: DALIAN HAIBAO FISHERY Co Ltd
Priority date: 2013-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-01-23
Also published as: CN103103182A

Abstract

本发明公开一种可分析皱纹盘鲍野生群体的遗传多样性，鉴定养殖群体之间的亲缘关系的皱纹盘鲍微卫星分子标记及制备方法，通过皱纹盘鲍微卫星(AC)_n文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选、微卫星引物的设计、PCR扩增及筛选等步骤，得到了10个高度多态的微卫星分子标记Hd1、Hd2、Hd3、Hd4、Hd5、Hd6、Hd7、Hd8、Hd9、Hd10，通过多态性检测证实，本发明的微卫星分子标记有重复性好的特点，是一种有效可靠的分子标记，可以建立皱纹盘鲍微卫星DNA标记技术体系，用于皱纹盘鲍的遗传多样性评估、遗传结构分析以及鉴定养殖群体之间的亲缘关系等。

Description

皱纹盘鲍微卫星分子标记及制备方法

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种可分析皱纹盘鲍野生群体的遗传多样性，鉴定养殖群体之间的亲缘关系的皱纹盘鲍微卫星分子标记及制备方法。

背景技术

微卫星(Microsatellite)又称作短重复序列(Short Tandem Repeats, STRs)或者简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSRs)，是一类遍布于真核生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为1-6bp)为重复单位组成的简单串联重复。其重复序列长短在同一物种不同遗传型间高度可变，但重复序列两端一般高度保守。根据此保守序列设计引物，即可通过PCR技术分析核心序列重复次数的变异，在不同遗传型之间检测到多态。由于微卫星DNA具有共显性、选择中性和多态信息含量高等特点，它已经成为目前应用最广泛的一种分子标记。目前微卫星分子标记的应用主要有动植物遗传连锁图谱的构建、QTL定位、品种资料鉴定、遗传多样性分析和亲子鉴定等方面。现有微卫星分子标记的制备方法基本是依次按如下步骤进行：皱纹盘鲍基因组DNA的制备、基因组酶切及目的大小片段的回收、DNA片段与接头的连接、连接产物的预扩增、生物素探针杂交、磁珠法富集微卫星DNA片段、微卫星富集文库的构建、微卫星阳性克隆的筛选及测序、微卫星引物的设计、PCR扩增及筛选等步骤。

皱纹盘鲍(Haliotisdiscus hannai) 属于软体动物门腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目，是鲍科贝类分布于我国北方的唯一种，也是辽宁和山东沿海海水养殖的重要对象。20世纪90年代开始，皱纹盘鲍的工厂化养殖规模增长迅速，已经成为沿海地区经济发展新的增长点。但是，迄今为止，还没有关于皱纹盘鲍微卫星DNA分子标记的相关报道，无法对野生鲍的遗传资源状况进行调查并开展育种工作，以至于皱纹盘鲍的养殖业因遗传背景不清晰和野生种质资源的衰退，而受到了一定程度的影响。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可分析皱纹盘鲍野生群体的遗传多样性，鉴定养殖群体之间的亲缘关系的皱纹盘鲍微卫星分子标记及制备方法。

本发明的技术技术解决方案是：一种皱纹盘鲍微卫星分子标记，其特征在于：所述微卫星分子标记的标号分别为Hd1、Hd2、Hd3、Hd4、Hd5、Hd6、Hd7、Hd8、Hd9、Hd10；各标号微卫星DNA分子标记的核苷酸序列分别为：

Hd1：

ATACATCATATATATGCATCATTCAGTATGAAAGTCGAGTGTGTGTATATCGGACACGTTACATACATCATTCAGAATGAAAGGCGAGTGTGTGTATATGGGAAATGTATCATACATCATTCAGAATGAAAGACGATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGTGTTTGTTTTGTGTGGTGTGTGATATTTGACATATTTTATGTGATATGTGCCATTATATTTCACATATGTAAGATATGTCATGTAATATGTGTCATGCGTCACGAGTCATGTAATATTGGAAATGTGACATGAGCCGTGTGATATGTGTCATCTAATATGTAATATGTGCGATGTGATATATGATATGTGTTGTGTGATGTGTCATATGATATGTGTGTGATGTGTATTGTGTTTTTTTGTCATAGTTCATGCGATATTTTATGTTTGCAATTCATCAAGTGCAATGTGATATGTGTCATGTGTCATGCTATTTGTATAATGTGATAAACGACGGGTAATAGGTGATATATATGTGTAATGTGATATGTGACATGTGACATGTGATATATGTCATGAGACGTTTTATGCGCCAAG

Hd2：

GGCCTATATTGGATGATTCATAGGTTTGATTACTGGTTGGGTTTTTGGGTTGTGCTTGCTTGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAATGTCTGTAGGGGTGGGGGTGTCTGGTGTTGATGATATCTGTCTGCGTCTTCTCTGACTTTCTGAATGGACAGGAGTGTGCCTGTGCGGGCCTGTGTGTGTTGTGACCGTTCTTCTGTGTGTGAGTGTGTGTGTGGGAGGGTGTGATATATTTATGTGTGGAATGAAGGATAGAATGAGTGAGGGTGAGTGCTTGTGTTGTGATGTGAAATGAGTCTTCCTGTGTAGGTACATATGAGGAGGTTGACTGCTTGTGTTGTGTTG

Hd3：

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Hd4: TGGATTGTGTGTCGTTTGTGTTCCATTTCTGTTATGGATTATTTGTCGTTTGTGTTGCATTACATAGATCGTATGTTGTTTGTGTTGCATTACTTGGATTGTTTGTTGTTTGTGTTCCTTTACAATAATGGATTGTATGTCGTTTGTGTTGCATTACTGTCATGGATTGTATGTCGTTTGTGTTGCATTACTTAGATTGTATGTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGCAGAATGTAAGATGGTATGTATT

Hd5:

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Hd6:

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Hd7:

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Hd8:

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Hd9:

TGTGGGGTGAGTGTGTGTGTGTGTGGGTATATGTGACGTAAAAGAAGTGTCCTTCTGTGTGTGTGTCTGTGCGTGTGCGTGTGTGTGAGTGTGAGTGTGTGTGTGTGTTGTGCATGTCCTCTCCACCGCCTACCTTAGATTATTGTACATTCTAAGACAATTCAGTCTACTCAACGTTGGATTGTCGGTGGAAATCTAGTTGTTTGGTTTGTCATCACAAGTCGATGGGGATTACCTTTATAATTGT

Hd10:

TATAGTTCTACCTGAATTTATATATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGAGAGTGCTTGTGGCGTCCCTGTGTGAAAGCGTGTAAATGGTGTTTGTATGAGAAGTGTGAATGGCTGTTGTTTTTATGATAAAAAAAAGGGGACTCCATCATGTAATACATATATATTATGTA

一种上述皱纹盘鲍微卫星分子标记的制备方法，包括微卫星引物的设计、PCR扩增及筛选等步骤，其特征在于：所述微卫星引物的设计及PCR扩增按下表进行：

表中F表示上游引物，R表示下游引物。

本发明通过皱纹盘鲍微卫星(AC)_n文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选、微卫星引物的设计、PCR扩增及筛选等步骤，得到了10个高度多态的微卫星分子标记Hd1、Hd2、Hd3、Hd4、Hd5、Hd6、Hd7、Hd8、Hd9、Hd10，通过多态性检测证实，本发明的微卫星分子标记有重复性好的特点，是一种有效可靠的分子标记，可以建立皱纹盘鲍微卫星DNA标记技术体系，用于皱纹盘鲍的遗传多样性评估、遗传结构分析以及鉴定养殖群体之间的亲缘关系等。

附图说明

图1：本发明实施例Hd1位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图2：本发明实施例Hd2位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图3：本发明实施例Hd3位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图4：本发明实施例Hd4位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图5：本发明实施例Hd5位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图6：本发明实施例Hd6位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图7：本发明实施例Hd7位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图8：本发明实施例Hd8位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图9：本发明实施例Hd9位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

图10：本发明实施例Hd10位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图。

具体实施方式

按照以下方法制备皱纹盘鲍微卫星分子标记

（1）皱纹盘鲍基因组DNA的制备

剪取活皱纹盘鲍外套膜约100mg左右于1.5 ml离心管中，用干净的剪刀将组织剪碎，向离心管中依次加入如下试剂：500ul STE缓冲液；25ul蛋白酶K（10 mg/ml）；75ul 10%的SDS，混匀后置56℃下消化过夜（隔一段时间混匀一次）。之后再加入等体积饱和酚溶液，轻轻颠倒混合5min以上，7000r/min离心5min，小心将上清液移至另一干净的离心管中。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，12000 r/min离心10 min。再加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次，12000 r/min离心10分钟，取上清。在上清液中加入1/10体积的3mol/L的NaAc (pH=5.2)，2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，-70℃下沉淀2h。12000r/min离心10min，再以70%预冷的乙醇洗涤DNA沉淀一次，自然晾干后以200~500ulTE溶液溶解DNA样品。

（2）基因组酶切及目的大小片段的回收

使用MseI酶切（1）步骤所得皱纹盘鲍基因组DNA，37℃孵育3h。酶切完成后，1.5%的琼脂糖检测酶切效果。使用赛百盛公司（上海）胶回收试剂盒回收酶切后产物中的400-1200bp片段，操作步骤如下：紫外灯下，切取含400-1200bpDNA片段的琼脂糖凝胶，每0.1g胶加300μl溶胶液。50℃水浴10min，每2-3min震荡一次，使凝胶充分溶解。将溶胶液小心滴加于分离柱上，12000r/min离心1min。倒掉收集管中的液体，在分离柱中加入500μl漂洗缓冲液，放置5min，12000r/min离心1分钟，倒掉收集管中的废液，重复此步骤一次。将倒掉液体后的离心柱和离心管再次以12000r/min离心5min，倒掉残余的液体，室温放置5 min。将分离柱放置于一个新的1.5ml离心管中，分离柱中央硅胶膜上加入300μl洗脱缓冲液，60℃水浴2min，12000r/min离心2min，收集离心下来的液体。1.5琼脂糖凝胶电泳检测回收结果，使用核算蛋白仪测定DNA浓度，稀释至100ng/μl。

（3）DNA片段与接头的连接

首先制备接头：将接头引物A（5’-TACTCAGGACTCAT-3’）和接头引物B（5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’）分别溶解至50 μmol/l，等比例混合两组寡核苷酸链，95℃变性10 min，然后自然冷却至室温，-20 ℃保存待用。将接头与回收后皱纹盘鲍基因组DNA片段按照3:1的摩尔比混合，T4 DNA连接酶16℃连接4h，连接产物保存于-20℃备用。

（4）连接产物的预扩增

以上一步的连接产物稀释10倍为模板，使用MseI-N引物（5’-GA TGAGTCCTGAGTAAN-3’）进行扩增，PCR反应设置为：72℃反应7分钟以补齐接头，94℃预变性4min，（94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min）反应30个循环，最后72℃延伸7min。所得PCR产物4℃保存待用。

（5）生物素探针杂交

取上述预扩增PCR产物18μl，100℃水浴解链10min，加入55℃预热的杂交缓冲液77μl和生物素标记的探针5μl，构成100μl杂交体系。55℃水浴30min后缓慢冷却至室温，加入300μl TEN₁₀₀缓冲液混匀，4℃保存备用。

（6）磁珠法富集微卫星DNA片段

向上一步获得的生物素杂交反应液中加入磁珠，室温反应30min。用磁力架固定磁珠，吸去杂交反应液，TEN₁₀₀溶液洗涤3次，每次300μl。用磁力架固定磁珠，使用预冷的TEN₁₀₀₀溶液洗涤3次，每次300μl。加入预热的50μl洗脱缓冲液，涡旋震荡悬浮磁珠，室温孵育2min，70℃水浴10min，用磁力架固定好离心管后，迅速吸取上清，保存备用。按1：2的比例加入100μl冰冻乙醇，再加入3 mol/l NaAc，4℃，12000r/min离心20min，弃上清后用70%的无水乙醇洗涤2遍。然后4℃，12000r/min离心20分钟，小心吸出乙醇，室温下干燥5min，加入20μl无菌水溶解。

（7）微卫星富集文库的构建

以从磁珠洗脱下的DNA片段为模板，使用MseI-N引物扩增微卫星富集产物，反应体系及程序同步骤（4）。使用T-A克隆技术，以Promega 公司PGEM-T easy连接扩增后的微卫星富集产物片段，16℃连接过夜。吸取50μl感受态细胞（大肠杆菌DH5α菌株，Promega公司）于1.5ml离心管中，冰浴下缓慢融化；向管中加入连接产物，体积不超过感受态细胞体积的5%，轻轻混匀。将离心管置于42℃水浴中热机90s，然后立即置于冰上5min。向离心管中加入600μl SOC培养基，以水浴将培养基加热至37℃，恒温振动器中37℃，200r/min转速，震荡培养培养1h。将200μl细菌悬浮液加入4μl IPTG（10mmol/L）和40μl X-GAL（2%）后，均匀地涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，待液体彻底吸收后，于37℃条件下倒置培养12h。

（8）微卫星阳性克隆的筛选及测序

首先进行蓝白斑筛选，牙签法挑取白色菌斑，接种到500μl LB培养基（含Amp50μg/ml）中，37℃震荡培养12h。以菌液为模板，MseI-N引物扩增片段有无及条带大小。对有条带且大小合适的克隆进行进一步筛选，使用载体正向测序引物M13（-47）（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）和（AC）₈探针进行PCR，有条带者直接测序，无条带者再使用M13(-48)引物（5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’）和（AC）₈探针进行PCR反应，有条带者测序，无条带者丢弃。测序工作由南京金斯瑞公司进行。

（9）微卫星引物的设计、PCR扩增与筛选

使用 Primer Premier 5.0软件进行引物设计。根据计算得到的微卫星引物的Tm值，以Tm温度以下8度为最低退火温度值，进行梯度PCR实验，确定最佳扩增温度后，进行PCR扩增。

微卫星引物的设计及PCR扩增按下表进行：

表中F表示上游引物，R表示下游引物。

对PCR扩增产物进行PAGE电泳检测，以琼脂糖电泳条带清晰、不拖尾、无影子带为佳。

本发明取24头皱纹盘鲍进行上述方法，共得到10个有多态性的微卫星标记，Hd1为287bp，Hd2为250bp，Hd3为138bp，Hd4为224bp，Hd5为130bp，Hd6为352bp，Hd7为180bp，Hd8为437bp，Hd9为170bp，Hd10为171bp。Hd1~Hd10位点特异性引物扩增部分的银染PAGE图分别如图1~图10所示。

各标号微卫星DNA分子标记的核苷酸序列分别为：

Hd1：

Hd2：

Hd3：

Hd5:

Hd6:

Hd7:

Hd8:

Hd9:

Hd10:

微卫星引物通用性检测及多态性分析：

基因频率及基因型数据采用Popgene 1.32(Yeh and Boyle, 1997)分析，并利用此数据计算团头鲂群体观测杂合度及期望杂合度，进而进行哈代-温伯格平衡检验(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。由图1-10可以看出，本发明的10个微卫星序列在供试的个体中均表现出多态性，由此可见，本发明的10个微卫星标记能用于分析皱纹盘鲍的遗传多样性和遗传结构，是一种有效可靠的分子标记。

序列表

<110> 大连海宝渔业有限公司

<120> 皱纹盘鲍微卫星分子标记及制备方法

<160> 35

<210> 1

<211> 574

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 1

ATACATCATATATATGCATCATTCAGTATGAAAGTCGAGTGTGTGTATATCGGACACGTTACATACATCATTCAGAATGAAAGGCGAGTGTGTGTATATGGGAAATGTATCATACATCATTCAGAATGAAAGACGATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGTGTTTGTTTTGTGTGGTGTGTGATATTTGACATATTTTATGTGATATGTGCCATTATATTTCACATATGTAAGATATGTCATGTAATATGTGTCATGCGTCACGAGTCATGTAATATTGGAAATGTGACATGAGCCGTGTGATATGTGTCATCTAATATGTAATATGTGCGATGTGATATATGATATGTGTTGTGTGATGTGTCATATGATATGTGTGTGATGTGTATTGTGTTTTTTTGTCATAGTTCATGCGATATTTTATGTTTGCAATTCATCAAGTGCAATGTGATATGTGTCATGTGTCATGCTATTTGTATAATGTGATAAACGACGGGTAATAGGTGATATATATGTGTAATGTGATATGTGACATGTGACATGTGATATATGTCATGAGACGTTTTATGCGCCAAG 574

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 2

GGCCTATATTGGATGATTCATAGGTTTGATTACTGGTTGGGTTTTTGGGTTGTGCTTGCTTGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAATGTCTGTAGGGGTGGGGGTGTCTGGTGTTGATGATATCTGTCTGCGTCTTCTCTGACTTTCTGAATGGACAGGAGTGTGCCTGTGCGGGCCTGTGTGTGTTGTGACCGTTCTTCTGTGTGTGAGTGTGTGTGTGGGAGGGTGTGATATATTTATGTGTGGAATGAAGGATAGAATGAGTGAGGGTGAGTGCTTGTGTTGTGATGTGAAATGAGTCTTCCTGTGTAGGTACATATGAGGAGGTTGACTGCTTGTGTTGTGTTG 369

<210> 3

<211> 238

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 3

CACCTAACGCTGTAGAGTCCGATCTTCACACACAAAGGCTGGACTGTGTGTCTTCACAATTGCACATAAATTCTGGAAAGTCACATCTACACACACACACACTGACACGCCCGGGGTGATCATCACCTTCACCACCTCCACATCCACGCCTTGCCACACCTGCCCACTTAAAAGGACCGGTCCCTATAATGCGGGTGTTCTAATTTCAACTACCGTAGAATGTCGATATGCATTTCGC 238

<210> 4

<211> 256

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 4 TGGATTGTGTGTCGTTTGTGTTCCATTTCTGTTATGGATTATTTGTCGTTTGTGTTGCATTACATAGATCGTATGTTGTTTGTGTTGCATTACTTGGATTGTTTGTTGTTTGTGTTCCTTTACAATAATGGATTGTATGTCGTTTGTGTTGCATTACTGTCATGGATTGTATGTCGTTTGTGTTGCATTACTTAGATTGTATGTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGCAGAATGTAAGATGGTATGTATT 256

<210> 5

<211> 218

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 5

GTAGATTGTGTAATGTGTAAAGTAGATTGTGTAATGTGTAAAATAGATTGTGTAATGTGTTATGCTATTGATGATGAGTCCTGAGTAAGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAAATCATATTGTTACAAAATACATTTTCCTGTTTTCAACAGATATATAGCTCCTTCGTGATTTTTCTTTAGACAGGCTGTGATATGAATTTCTGAAATGCAGTA 218

<210> 6

<211> 594

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 6

GTATGCAATGTCATCTTGCAAGTAAGAATCCAGAGAATTTGCTTAGCTGTGTGTCCACATCTCTCTGTATGTATTGTGTGTGCAACTTCTGAGTGTCCACATCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACGTATGTATAAACAAGTAAACCTTTGAGGTGTATATGCGAGGCACAATAACTGTATTTGTGTCGCCATAATGCCTACGACGTATATATGCATACATCTATATGAGTACGGATTATTTCAGGAAACATGATATTTGAACTATGATGAATAAACGCAGCTGTTGTTCACTCGTGATTCATTCCATGTATGATCAAACATGTCAGATGACATATAAATTCACGTTTCCTACCTGTGGAGCAGTTGTCTCCCACCCAGCCTGGGCGGCAGTCACCAGGACACACCCCTGTCACGTGGTCGCATGTTGAATTCAGACAGTGACAGAACTCGCTGCAATTTGGGCCGAAAGTCCCATTTGAACATACTGTGATGGAAAATAAAATATGGTATTACAATGCAGTACACATTGGTTTCAAATGAAAATGACATCAGTTCACAGTTATCAATCACTCTTGCTTTTGACTTCCTAGGAT 594

<210> 7

<211> 207

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 7

207

<210> 8

<211> 472

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 8

CGCTTATTGAATAATATAAGTAGTTGTCAGCAGGACTCTGGGACCGCTCCTGGCTTCTGATTGGCCTAGAGGATCACGTGACCTCTGTGACGTTATTTTTTAGATAGACGGTCGTCTGAATGCTAAAGGTGGACCTTCATAGGTAGGCATGAACGTGATGTGATGTACGTGATGTACGTTGTGTCACCCCCATGCAAATCGGGATGTCATGTGTGTGTGTGTCTTCAAACAGACGTTGACGTTGATCAATAGAATTGTTATGCCATGCCTACGTGATGTACGTCATGTTGACAGACACACGTGGTGTTTCACGCGTGTCTTTGTGCAAAACGTGGTGTCATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGACTACAAACATTTATTTATTATTTACAGAAAGAAAGATCGATACACATACGTGACGTTTGCACACGTGATGTACTTCGTGTCGCGATGCGAACGTAGTGTTTCATCCGTGTC 472

<210> 9

<211> 247

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 9

TGTGGGGTGAGTGTGTGTGTGTGTGGGTATATGTGACGTAAAAGAAGTGTCCTTCTGTGTGTGTGTCTGTGCGTGTGCGTGTGTGTGAGTGTGAGTGTGTGTGTGTGTTGTGCATGTCCTCTCCACCGCCTACCTTAGATTATTGTACATTCTAAGACAATTCAGTCTACTCAACGTTGGATTGTCGGTGGAAATCTAGTTGTTTGGTTTGTCATCACAAGTCGATGGGGATTACCTTTATAATTGT 247

<210> 10

<211>185

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 微卫星分子标记

<400> 10

TATAGTTCTACCTGAATTTATATATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGAGAGTGCTTGTGGCGTCCCTGTGTGAAAGCGTGTAAATGGTGTTTGTATGAGAAGTGTGAATGGCTGTTGTTTTTATGATAAAAAAAAGGGGACTCCATCATGTAATACATATATATTATGTA 185

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

TACTCAGGACTCAT 14

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

GACGATGAGTCCTGAG 16

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

GATGAGTCCTGAGTAAN 17

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24

<210> 16

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ATCGGACACGTTACATAC 18

<210> 17

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

CACATCGCACATATTACA 18

<210> 18

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

TTTGGGTTGTGCTTGCTT 18

<210> 19

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

CACCCTCACTCATTCTATCCTT 22

<210> 20

<211>19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

CCTAACGCTGTAGAGTCCG 19

<210> 21

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

TGGAGGTGGTGAAGGTGA 18

<210> 22

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

TATGGATTATTTGTCGTTTGTG 22

<210> 23

<211>25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

AATACATACCATCTTACATTCTGCT 25

<210> 24

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

TTGATGATGAGTCCTGAG 18

<210> 25

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

ATCACAGCCTGTCTAAAG 18

<210> 26

<211>19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

TTGCAAGTAAGAATCCAGA 19

<210> 27

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

CAACTGCTCCACAGGTAG 18

<210> 28

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

TGATGATGAGTCCTGAGT 18

<210> 29

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

TAGACTTGGGTAGACAGA 18

<210> 30

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

TGTCAGCAGGACTCTGGG 18

<210> 31

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

AACACTACGTTCGCATCG 18

<210> 32

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

TGGGTATATGTGACGTAAAAGA 22

<210> 33

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

TTCCACCGACAATCCAAC 18

<210> 34

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

GTTCTACCTGAATTTATA 18

<210> 35

<211>18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

ATATGTATTACATGATGG 18

Claims

1.一种皱纹盘鲍微卫星分子标记的组合，其特征在于：所述微卫星分子标记的标号为Hd1、Hd2、Hd3、Hd4、Hd5、Hd6、Hd7、Hd8、Hd9和Hd10；各标号微卫星DNA分子标记的核苷酸序列分别为：

Hd1：

Hd2：

Hd3：

Hd5:

Hd6:

Hd7:

Hd8:

Hd9:

Hd10:

TATAGTTCTACCTGAATTTATATATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGAGAGTGCTTGTGGCGTCCCTGTGTGAAAGCGTGTAAATGGTGTTTGTATGAGAAGTGTGAATGGCTGTTGTTTTTATGATAAAAAAAAGGGGACTCCATCATGTAATACATATATATTATGTA。