CN101705212A - N-酰基高丝氨酸内酯酶及其生产方法与专用重组菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其生产方法与专用重组菌。该蛋白是序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还公开了一种工程菌，该工程菌是是上述蛋白的编码基因导入毕赤酵母GS115中，得到的重组菌。该重组菌经过发酵，酶活可达4034.71U/ml。

Description

N-酰基高丝氨酸内酯酶及其生产方法与专用重组菌

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其生产方法与专用重组菌。

背景技术

N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone)，简称AHL，是一种环状内酯类小分子物质，由一个相同的高丝氨酸内酯环和一个不同碳链长度的酰基侧链组成。AHLs是许多革兰氏阴性细菌合成的自诱导物，是细菌细胞通讯中的一类重要的信号物质，广泛存在于革兰氏阴性细菌群体感应系统中，参与调控多种致病基因的表达。AHLs可以透过细胞膜，在细胞与环境之间以及细胞之间扩散，当环境中的细菌达到一定的数量，AHLs积累到一定浓度，AHLs重新返回细菌胞内，与相关受体蛋白结合，诱导相关基因的表达，引起细菌间的群体感应现象。许多人类和动植物的病原菌的致病性依赖于AHLs的群体感应现象，如可使人患病的铜绿假单胞杆菌(Waters C M andBassler B L，Annual Review of Cell and Developmental Biology.21：319-346)；水产养殖中的主要致病菌费氏弧菌、嗜水气单胞菌等；食品腐败中的食源假单胞菌(Austin B J and Allen-Austin D，Journal of Applied Bacteriolog.y 58：483-506)；以及导致植物腐败的胡萝卜欧文氏菌等诸多致病菌的致病性均依赖AHLs调控的群体感应现象(VonBodman S B，et al.Annual review of phytopathology.41：455-482)。因此，降解AHLs，切断菌间交流，进而破坏群体感应系统，可以达到控制毒性因子表达的目的，这可能成为一种可行的防病策略。

N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acyl-homoserine lactonase，AHL-lactonase)是一类能够降解AHLs的水解酶，该酶将信号分子的高丝氨酸内酯环切开，生成酰化的高丝氨酸内酯。对N-酰基高丝氨酸内酯酶的研究开始于本世纪初，2000年，Yi-Hu Dong首次芽胞杆菌中克隆N-酰基高丝氨酸内酯水解酶-aiiA。研究表明N-酰基高丝氨酸内酯酶基因的转基因植物提高大白菜抗病原菌胡萝卜软腐欧文氏菌感染的能力(Dong YH，et al.Proceedings of the National Academy of Sciences.97：3526-3531)；aiiA类基因导入细菌中如铜绿假单菌(Pseudolnonas aerugjnosa PA01)中表达，大大减弱AHL信号分子的数量，显著抑制某些毒性因子和细胞毒素的产生(Reimmann C，etal.Microbiology.148：923-932)；aiiA类基因在大肠杆菌原核系统活性表达，并有效提高植物抗病能力(Dong Y H，et al.Proceedings of the National Academy ofSciences 97：3526-3531)。但是N-酰基高丝氨酸内酯酶基因在真核表达系统中如毕赤酵母表达中鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白，命名为AiiA-B546，是一种N-酰基高丝氨酸内酯酶。

本发明提供的蛋白是序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述蛋白的编码基因命名为aiia-B546，也属于本发明的保护范围之内。

本发明提供的基因来源于芽孢杆菌(Bacillus sp.)B546 CGMCC 3228(已于2009年09月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)。

上述基因具体是如下1)或2的基因：

1)编码序列是序列表中序列1的自5’端第1位-第750位所示的基因；

2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的基因。

含有所述基因的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体具体可以是将上述的基因插入pPIC9的多克隆位点得到的重组表达载体。

含有上述基因的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围之内。

上述重组菌具体可以是将所述的基因通过所述的重组表达载体导入毕赤酵母中，得到的转基因重组菌。

上述重组菌具体是巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)AiiA-B546 CGMCC №.3369(已于2009年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)。

任一所述的重组菌在生产所述蛋白AiiA-B546中的应用也属于本发明的保护范围之内。

任一所述的重组菌或者上述的蛋白AiiA-B546在水产养殖抗病性或水产品保鲜中的应用也属于本发明的保护范围之内。

采用本发明的重组菌和方法进行发酵培养，可高效表达N-酰基高丝氨酸内酯水解酶，酶活高达3560U/ml。

本发明将从Bacillus sp.B546克隆到的AiiA基因连接pPIC9表达载体，将重组的表达载体电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，进行毕赤酵母高效表达，获得重组蛋白AiiA-B546，并对其性质进行了研究。同时扩大培养，进行发酵罐高密度发酵。重组蛋白AiiA-B546具有糖基化修饰，酶学性质优良。在60℃处理30min后酶活保持在100％，在70℃处理15min后仍剩余95％以上的酶活。AiiA-B546在中性和碱性条件下非常稳定，具有很好的抗胰蛋白酶，α-糜蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，胶原蛋白酶，碱性蛋白酶的水解的能力，并且底物具有广谱性。

本发明公开了一种具有良好热稳定性和蛋白酶抗性的毕赤酵母高效表达的重组N酰基高丝氨酸内酯酶。该重组N-酰基高丝氨酸内酯酶可以作为一种新型抗菌药物和防腐剂应用于水产养殖业和保藏。

附图说明

图1aiia-B546基因PCR扩增电泳图。1，对照；2，aiia-B546；M，1kb plus LadderDNA maker。

图2活性平板法筛选阳性转化子；CK，未经酶液处理的对照；17、49和13为阳性转化子酶液处理的样品(其中13号酶活最高)。

图3酵母表达的重组酶AiiA-B546的纯化；1，为酵母表达的重组AiiA-B546粗酶液(发酵液上清)；2，纯化的重组AiiA-B546；3，纯化的重组AiiA-B546N端脱糖基化；M，低分子量蛋白marker.

图4pH和温度对N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiAB546的影响；a，AiiA-B546的最适pH；b，AiiA-B546的pH稳定性；c，AiiA-B546的最适温度；d，AiiA-B546的温度稳定性。

图5各蛋白酶对重组酶AiiA-B546的影响。

图6发酵罐中酵母表达的重组酶AiiA-B546的SDS-PAGE分析；1～7分别为诱导12、36、60、84、108、132和156小时的发酵液上清。

图7发酵罐中的细胞湿重和单位酶活随诱导时间的变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明中依赖的遗传资源是芽孢杆菌(Bacillus sp.)B546CGMCC No 3228由中国农业科学院饲料研究所(北京市海淀区中关村南大街12号，邮政编码100081)筛选并保存。该菌种按史晓翀等(史晓翀等，中国海洋大学学报。37：728-732)方法自池塘底泥(由周志刚，于2007年6月，采集自天津市武清区水产技术推广站鱼塘)分得。

本发明中的其它材料如下：

1.菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及毕赤酵母(P.pastoris)GS115购自于Invitrogen公司。检测菌株Agrobacterium tumefaciens KYC55由南京农业大学朱军教授馈赠，记载过该材料的非专利文献是(Zhu J，et al.Applied and EnvironmentalMicrobiology.69：6949-6953)，中国农业科学院饲料研究所已保存一份。pEASY-T3载体和Escherichia coli TOP 10购自北京全式金生物公司。

2.酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，T₄DNA连接酶连接酶和EndoH脱糖基化酶购NEB公司。实验中使用的底物包括C6-HSL(N-Hexanoyl-DL-homoserinelactone)，C8-HSL(N-Octanoyl-DL-homoserine lactone)，C10-HSL(N-Decanoyl-DL-homoserine lactone)，C12-HSL(N-Dodecanoyl-DL-homoserinelactone)，3-OXO-C6-HSL(N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserine lactone)，3-OXO-C8-HSL(N-(β-Ketooctanoyl)-L-homoserine)均购自Sigma公司。SDS-PAGE的Low Molecular Weight Caiibration Kit购自GE公司。脱糖基化酶Endo H购自NEB公司。

3.培养基：

LB培养基：0.5％酵母提取物，1.0％蛋白胨，1.0％NaCl，用NaOH调至pH7.0，(固体培养基含1.5％琼脂)121℃灭菌15min。

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

MM固体培养基：1.34％YNB，0.00004％生物素(Biotin)，0.5％甲醇，1.5％琼脂。

MD固体培养基：1.34％YNB，0.00004％生物素(Biotin)，2％葡萄糖，1.5％琼脂。

BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB酵母氮源，不含氨基酸(美国BD公司)，0.00004％生物素(Biotin)，1％(体积百分比)甘油。

BMMY培养基：除了以0.5％(体积百分比)甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同。

基础盐培养基：26.7ml H₃PO₄，0.93g CaSO₄·2H₂O，18.2g K₂SO₄，14.9gMgSO₄·7H2O，4.13g KOH，40.0g甘油(Glycerol)，定容至1L。

PTM1：6.0g CuSO₄·5H₂O，0.08g Na₂I，3.0g MnSO₄，0.2g Na₂MoO₄·2H₂O，0.02g H₃BO₃，0.5g CoCl₂·6H₂O，20.0g ZnCl₂，65.0g FeSO₄·7H₂O，0.2g生物素(Biotin)，5.0ml H₂SO₄，定容至1L，过滤除菌，室温保存。

说明：本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Sambrooket J，et al.Version III2001)；Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(Kriegler M，1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel M，et al.1994)；PichiaExpression Kit(Invitrogen，Version M)。

实施例1基因工程重组菌的获得

1、N-酰基高丝氨酸内酯水解酶基因的克隆

芽孢杆菌(Bacillus sp.)B546 CGMCC No 3228的基因组为模板，利用特异性引物BT1(5’-GCGGAATTCATGACAGTAAAGAAGCTTTATTTCG-3’)和BT2(5’-ATAGCGGCCGCCTATATATACTCTGGGAACAC-3’)(下划线部分分别为EcoR I和Not I酶切位点)，按如下条件进行扩征：94℃5min；94℃1min，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10min。

扩增得到750bp左右的片段(见图1中2)，将该片段回收后的连接pEASY-T3载体转化E.coli TOP 10感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，测序结果表明扩增得到的片段具有序列表中序列2的自5’端第1位到753位所示的序列，其中，编码区是自5’端第1位到750位，编码序列1所示的蛋白，将该蛋白的编码基因命名为aiia-B546。

2、重组表达载体的构建

pPIC9载体和连有aiia-B546的pEASY-T3载体用EcoR I，Not I双酶切片段，T₄DNA连接酶后转化E.coli TOP 10感受态细胞，筛选阳性克隆子进行测序，得到重组表达载体，命名为pPIC9-aiia-B546。

3、基因工程重组菌的构建

测序正确的阳性克隆大量提取重组载体pPIC9-aiia-B546，Bal II酶切使重组载体线性化，线性化的重组载体电击转化毕赤酵母(P.pastoris)GS115。按PichiaExpression Kit中方法挑选并诱导阳性转化子。通过Gram et al.(Gram L，et al.Applied and Environmental Microbiology.68：4111-4116)的方法对基因工程重组菌的N-酰基高丝氨酸内酯水解酶活性进行检测，酶活检测方法如下：

配制200μl的反应体系，包括1μl 3-OXO-C8-HSL(以无水乙醇溶解为0.1mg/ml的溶液)，10μl酶液和189μl的1x PBS(pH 8.0)。以上体系在25℃反应45min后加入50μl 10％SDS终止反应。对照以10μl 100℃失活5min的酶液代替。

活性平板法按Gram et al.的方法制备的制备：将3ml过夜培养的报告菌株KYC55与20ml含有1.5％琼脂的LB混合，倒平板，凝固后打孔备用。取10μl上述反应体系溶液加到活性平板的加样孔中，30℃培养24h，量取平板中蓝色区域半径。蓝色区域半径小，则N-酰基高丝氨酸内酯水解酶酶活性高。

而N-酰基高丝氨酸内酯水解酶酶活性的定量结果还需根据信号分子(3-OXO-C8-HSL)的质量(y，μg)的对数和平板中蓝色区域半径(R，cm)的关系，构建标准曲线方程为Ln(y)＝1.3809R²-11.95，根据该方程计算酶活。一个酶活单位(U)定义为在pH 8.0 25℃条件下，每分钟降解1nmol 3-OXO-C8-HSL所需要的酶量。

通过上述方法将标记为17号、49号和13号的阳性转化子的上清液的酶活进行定性检测，结果如图2所示，13号的阳性转化子的蓝色区域半径最小，其N-酰基高丝氨酸内酯水解酶酶活性高，将13号阳性转化子作为工程菌，用于以下实验。

该工程菌是巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)AiiA-B546 CGMCC №.3369。已于2009年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3369。

另制备出以下两种菌作为对照：

1、空载体菌株：按照获得工程菌的方法，得到转空表达载体的pPIC9的重组酵母菌，作为空载体对照。

2、重组大肠杆菌菌株：通过EcoR I和Not I双酶切位点将aiiAB546克隆到pET-22b(+)载体；T₄连接酶连接酶切后的基因和载体；电击转化大肠杆菌BL21感受态细胞；通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆送上海生工测序；通过序列分析，得到正确转化aiiAB546的重组大肠杆菌，作为大肠杆菌对照。

实施例2AiiA-B546在P.pastoris AiiA-B546中的高效表达

1、工程菌在摇瓶水平上的表达及其分析

将上述工程菌、空载体菌株对照重新接种于装有200mL BMGY培养基的1000mL三角瓶，30℃，250-280rpm摇床培养48h，3000×g离心5min，弃上清(尽量将上清除尽)，沉淀细胞中加入200mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基，重新在25℃，250-280rpm诱导培养，为补偿甲醇的损失，在菌液中每隔12h补加甲醇溶液，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，直至诱导72h，于12000×g离心5min，按照实施例1中提供的方法测定上清酶活。

将重组的大肠杆菌接种于加有Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，添加终浓度为1mM的IPTG，25℃、200rpm摇床诱导培养12h。收集菌体，重悬于1x PBS(pH 8.0)，超声波细胞破碎，于12000×g离心10min，按照实施例1中提供的方法测定上清酶活。

检测工程菌株酶活为27.1U/ml发酵液，比原核表达(重组大肠杆菌表达)的酶活(0.24U/ml发酵液)提高了111.7倍。试验中空载体对照组未检测到酶活。

2、酵母表达重组酶AiiA-B546的纯化及蛋白分析

摇瓶表达的上清液(工程菌培养72小时的上清)经中空纤维(天津纺织工学院膜分离工程研究所)进行浓缩并更换为低盐缓冲液(pH 8.0的20mM Tris-HCl)。然后通过5kDa膜包(Sartorius，German)做进一步的浓缩处理。浓缩后酶液用80％的硫酸氨使蛋白质沉淀，沉淀物用pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液溶解，透析过夜，通过PEG8000吸附透析袋中的水分。2mL的样品上预先用20mM、pH 8.0的Tris-HCl平衡的HiTrapQ Sepharose XL阴离子柱(Amersham Pharmacia Biotech)。用NaCl(0-1M)盐梯度洗脱结合在柱子上的蛋白，在0.3M的盐梯度下，含有N-酰基高丝氨酸内酯水解酶的蛋白被洗脱下来，至此，得到纯化后的AiiA-B546酶液。

SDS-PAGE显示，纯化的酵母表达AiiA-B546蛋白(约35kDa)比理论分子量(28.06kDa)偏大，可能存在糖基化修饰(图3中2).纯化蛋白用Endo H脱糖基化酶进行处理后分子量接近理论分子量(约28kDa)(图3中3)，说明酵母表达AiiA-B546存在N糖基化修饰。

从上述SDS-PAGE胶(图3中2)中，切取约35kDa大小的条带，送中科院微生物所进行质谱测序。结果表明有5段不相邻的序列，与目的蛋白相匹配，说明此蛋白为表达的N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-B546。

取以上纯化后的AiiA-B546酶液，通过考马斯亮蓝法测定酶液中的蛋白含量，计算每mg蛋白中N-酰基高丝氨酸内酯酶活力，得到比活为3333U/mg。

实施例3酵母表达AiiA-B546酶学性质的研究

酶促反应体系：除步骤4外，其余步骤中均以3-OXO-C8-HSL为底物，采用活性平板法测定N-酰基高丝氨酸内酯酶酶学性质。

本实施例所用酶液是实施例2纯化后的AiiA-B546酶液。

1、AiiA-B546的pH和温度适应性。

经纯化的AiiA-B546在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为50mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0和5.8)，0.2M的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.8、6.0、7.0和8.0)，50mM Tris-HCL缓冲液(pH 8.0和9.0)。纯化的AiiA-B546在不同pH的缓冲体系，25℃下测定的pH适性结果如图4a(以最高酶活为100％，其余pH的酶活与该最高酶活的比值为纵坐标)所示：其的最适作用pH为8.0，pH6.5-8.5范围内，酶活性均能维持在80％以上，pH在5.0以下和9.0以上无法测得酶活。这说明该酶在中性范围及附近均具有非常好的酶活性。

将酶液在不同pH值的缓冲液中，包括50mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，0.2M的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0和7.0)，50mM Tris-HCL缓冲液(pH 8.0和9.0)，50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0、10.0、11.0和12.0)。于25℃下预处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果如图4b(以未经过预处理的酶活定为100％，以经过预处理的酶活与未经预处理的酶活的比值为纵坐标)所示，AiiA-B546在pH 7.0-12.0之间均很稳定。

最适温度的测定在pH 8.050mM的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲体系中及不同的温度(0、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果如图4c所示(以最高酶活为100％，其余各温度下测得的酶活与最高酶活的比值为纵坐标)，AiiA-B546的最适作用温度20℃，0℃及20-37℃，具有60％以上的酶活。

测定AiiA-B546在不同的温度(60℃和70℃)下分别保温2、5、10、15、20、30和60min时的相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在50℃下处理30min后酶活剩余约50％，热稳定性较好。酶反应温度稳定性结果如图4d所示(以不经处理的酶测得的酶活为100％，以经过预处理的酶活与未经预处理的酶活的比值为纵坐标)，AiiA在60℃下保温60min，酶活性基本维持不变，70℃下处理60min后，酶活仍在65％以上。说明该酶在60℃和70℃条件下，具有非常好的热稳定性。

2、金属离子及相关化学试剂对酵母表达AiiA-B546酶活的影响

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度分别为1mM和10mM.在25℃、pH8.0条件下测定酶活性.结果如表1所示.

表1.不同金属离子及相关化学试剂对AiiA-B546的影响

表1中CK未加任何金属离子或相关化学试剂，相对酶活是以CK的酶活为100％，其余处理的酶活与CK的酶活的比值。

3、AiiA-B546抗蛋白酶的能力的研究

将蛋白酶分别用下列溶液配制成1mg/mL的溶液：用pH 7.0 0.1 M Tris-HCl配制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶溶液；用pH 7.5 0.1M Tris-HCl配制枯草杆菌蛋白酶、胶原蛋白酶溶液；用pH10.0 0.1 M甘氨酸-NaOH配制碱性蛋白酶溶液。蛋白酶/N-酰基高丝氨酸内酯酶(质量之比)≈0.1，37℃处理30和60min取样，25℃、pH8.0条件下保温45min测定处理酶的剩余酶活。结果如图5所示，用不同蛋白酶处理后AiiA-B546酶活没有下降。因此，该酶对多种蛋白酶具有良好的抗性。

4、AiiA-B546对不同底物的降解情况。

本步骤酶活的测定方法与实施例1提供的酶活测定方法相同。不同之处在于将底物分别换成C6-HSL，C8-HSL，C10-HSL，C12-HSL，3-OXO-C6-HSL。结果显示AiiA-B546对C6-HSL，C8-HSL，C10-HSL，C12-HSL，3-OXO-C6-HSL 3-OXO-C8-HSL均可有效降解。

实施例4AiiA-B546重组酵母菌株的高密度发酵

重组酵母的高密度发酵是在3.7L的发酵罐(Bioengineering KLF 2000，公司，公司所在城市，Switzerland).中进行的，首先挑取产N-酰基高丝氨酸内酯酶的高酶活阳性克隆，在YPD的液体酵母培养基中30℃摇瓶培养48h获得一级种子，一级种子接种到200ml的YPD的液体酵母培养基中30℃过夜培养获得二级种子，然后移至3.7L的发酵罐30℃发酵，发酵罐中含有2L的基础盐培养基中，其中含有PTM1.(4.5ml PTM1/L基础盐培养基)

I.接种。发酵培养基基础盐培养基在接种前首先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0，然后每毫升培养基添加4.37mL的PTM1。5-10％接种种子液，通气搅拌培养18-24h，在培养过程中随着菌体的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低。当碳源消耗完后溶氧量会再度升高，当溶氧升高至80％以上时，开始碳源添加阶段。

II.碳源添加阶段。流加25％葡萄糖(12mL/L PTM1)，流加量为36mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。

III.碳源-甲醇混合添加阶段。流加25％葡萄糖∶甲醇(8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，控制溶氧量始终大于20％。

IV.诱导表达阶段。加入诱导剂甲醇(12mL/L PTM1)，使甲醇的终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。

发酵12h后开始取样，以后每隔24h取样。测定样品单位酶活及湿重(湿重是指每毫升发酵液含有的菌体量)。酶活测定方法按实施例1的标准方法。同时对不同时间点的取样进行SDS-PAGE分析。

高密度发酵不同时间取样单位酶活及湿重变化如图6所示，随着甲醇诱导时间的延长，发酵上清液中AiiA-B546酶活力显著增加。诱导132h后活性可达3560U/ml发酵液，菌体湿重达333g/L(图6)，上清中累计蛋白达0.3mg/mL。

高密度发酵不同时间取样SDS-PAGE分析显示(图7)，蛋白表达量随诱导时间的延长而增加，在发酵132h时，蛋白表达量开始无明显变化，此时细胞湿重增加变缓，发酵液的单位酶活开始下降。

对AiiA-B546酵母工程菌在摇瓶水平和高密度发酵水平的最高表达酶活进行测定和比较。结果显示，AiiA-B546酵母高密度发酵酶活(3560U/ml)比摇瓶水平发酵酶活(27.1U/ml发酵液)提高了131倍。

实施例5酵母表达AiiA-B546的应用研究

1、AiiA-B546在对Aeromonas hydrophila引起的爆发性鱼病的防控作用

酵母高密度发酵的AiiA-B546酶液通过中空纤维将缓冲液置换为1x PBS(pH7.4)，滤灭。以80日龄锦鲤(长约4cm)作为实验动物，Aeromonas hydrophila ATCC7966作为攻毒菌株(实验验证产生AHLs)。设置4个实验组，每组10尾鱼，取10μl溶液进行腹腔注射。其中，I-CK组只注射1x PBS；II-酶液组，注射终浓度为100U/ml的上述酶液；III-菌组，注射终浓度为10⁸CFU/ml ATCC 7966菌体(pH 7.41x PBS冲洗并重悬)；VI-酶液加菌组，同时注射终浓度为10⁸CFU/ml ATCC 7966菌体和终浓度为100U/ml的上述酶液。

实验结果表明酵母高密度发酵表达的AiiA-B546单独注射不会引发鱼体的免疫反应导致其死亡，但是可以显著延长ATCC 7966攻毒实验动物的死亡时间降低死亡率。

2、AiiA-B546对低温保藏食品鱼类的防腐作用

上述处理的酶液按终浓度100U/ml喷洒于鱼体(超市购买的活罗非鱼)表面，4℃冰箱中放置，在3、7、14、21和28天时分别取1g鱼肉检测组胺含量和总菌数统计。

实验结果表明AiiA-B546的加入可以使鱼肉中的组胺含量和总菌数明显下降.处理28d后，未加酶处理的鱼肉腐败变质，失去弹性；酶液处理过的鱼肉未腐败，弹性良好，符合国家鱼类的食用标准.

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>N-酰基高丝氨酸内酯酶及其生产方法与专用重组菌

<160>2

<210>1

<211>250

<212>PRT

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400>1

Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu

1               5                   10                  15

Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Thr Pro Gly Asn Leu Leu Asn

            20                  25                  30

Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu

        35                  40                  45

Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Asn Leu Phe

    50                  55                  60

Asp Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Ile Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu

65                  70                  75                  80

Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Glu Asp

                85                  90                  95

Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly

            100                 105                 110

Asn Gly Ala Phe Thr Asn Thr Pro Ile Leu Val Gln Arg Ala Glu Tyr

        115                 120                 125

Glu Thr Ala Gln His Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Cys Ile Leu Pro

    130                 135                 140

Asn Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly

145                 150                 155                 160

Val Gln Leu Leu Tyr Thr Pro Gly His Thr Pro Gly His Gln Ser Leu

                165                 170                 175

Phe Ile Glu Thr Glu Asn Ser Gly Pro Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala

            180                 185                 190

Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asp Glu Val Pro Phe Ala Gly Val

        195                 200                 205

Asp Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Ile Val

    210                 215                 220

Arg Lys Glu Asn Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu

225                 230                 235                 240

Lys Ser Cys Lys Val Phe Pro Glu Tyr Ile

                245                 250

<210>2

<211>753

<212>DNA

<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400>2

atgacagtaa agaagcttta tttcgtgcca gctggtcgtt gtatgttaga tcattcttct   60

gttaatagta cgctcacacc ggggaattta ttaaacttac cagtatggtg ttatttattg   120

gagacagaag aagggccaat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc ggttaataat   180

gaaaatttat ttgacggtac atttgttgaa gggcagattt taccgaaaat gactgaagaa   240

gataggatcg tgaatatttt aaaacgcgtt ggttatgagc cggaagacct tctttatatt   300

attagttctc acttgcattt tgatcatgca gggggaaatg gtgcttttac aaatacaccg   360

attcttgtgc agcgtgctga atatgagacg gcacaacata gtgaagaata tttgaaagaa   420

tgtatattgc cgaatttaaa ctacaaaatc attgaagggg attatgaagt cgtaccaggt   480

gttcaattat tgtatacgcc aggacatact ccaggacatc agtcactatt cattgagacg   540

gaaaactctg gcccagtgtt attaacgatt gatgcatcgt atacgaaaga gaattttgaa   600

gatgaagtgc cgttcgcggg ggttgattcg gaattagctt tatcttcaat taagcgttta   660

aaagaaattg ttaggaaaga gaatccaatt gttttctttg gacatgatat agaacaggaa   720

aagagctgta aagtgttccc agagtatata tag                                753

Claims (10)

1.一种蛋白，是序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2的基因：

1)编码序列是序列表中序列1的自5’端第1位-第750位所示的基因；

2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的基因。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求2或3所述的基因插入pPIC9的多克隆位点得到的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求2或3所述的基因通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入毕赤酵母中，得到的转基因重组菌。

8.如权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)AiiA-B546 CGMCC №.3369。

9.权利要求6-8任一所述的重组菌在生产权利要求1所述蛋白中的应用。

10.权利要求6-8任一所述的重组菌在水产养殖抗病性或水产品保鲜中的应用。

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