CN101948818A - N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其编码基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明将具有淬灭酶活性的N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因与木聚糖酶基因融合，得到了融合蛋白(N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白)SL2B-6。本发明提供的融合蛋白具有适宜的作用pH值，较强的金属离子和表面活性剂抗性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可作为一种新型饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
Description
技术领域
本发明涉及一种N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)是一类广泛存在于革兰氏阴性细菌中，调控群体感应(quorum-sensing)系统中的信号分子。这些信号分子是由病原菌本身产生，可自由穿透细菌的细胞壁和细胞膜同时参与许多病原菌致病基因的表达调控，当分子浓度达到一定阈值时，就可启动病原菌致病基因的表达。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)不同亚种中广泛存在着对AHLs分子有降解作用的非分泌性蛋白N-乙酰高丝氨酸内酯酶(AiiA)，这类蛋白通过水解进入胞内的AHLs分子的内酯键，降低其浓度，使致病基因不能表达，从而阻止了病原菌对生物的侵染，是一类群体感应淬灭酶。
内切-1，4-β-D-木聚糖酶，简称木聚糖酶，能够随机的切割木聚糖主链骨架的β-1，4-糖苷键，其水解产物主要是木二糖和木寡糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶作为环保型饲料添加剂广泛应用于畜牧业，具有改善畜禽消化道功能，降低食糜粘度和抗营养性，提高饲料利用率和减少环境污染等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且同时具有N-乙酰高丝氨酸内酯酶与木聚糖酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)序列表中序列2自5’末端第10至1677位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码且同时具有N-乙酰高丝氨酸内酯酶与木聚糖酶活性的的DNA分子；
4)与1)或2)或限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码且同时具有N-乙酰高丝氨酸内酯酶与木聚糖酶活性的的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pPIC9的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述宿主菌为大肠杆菌或酵母菌；所述酵母菌优选为毕赤酵母。所述重组菌优选为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)XynAS27-L2-AiiAB546(SL2B)，其保藏号为CGMCC No.3974。
本发明还保护一种生产所述蛋白质的方法，是发酵培养所述的重组菌，得到所述蛋白质。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均可用于制备饲料添加剂。
本发明还保护一种饲料添加剂，它的活性成分为所述蛋白。
嗜水气单胞菌广泛存在淡水、污水、淤泥及土壤中，经常从人体、鱼体、两栖类以及人的食物中分离到，对水产动物、家畜和人均有致病性，同时是暴发性水产鱼类疾病的主要致病菌。据报道导致嗜水气单胞菌具有致病性的毒力因子受信号分子的调控，因此研究对信号分子具有降解作用的N-乙酰高丝氨酸内酯酶，通过N-乙酰高丝氨酸内酯酶对信号分子的降解从而抑制信号分子的积累阻断病原菌对鱼类的侵染是非常有可行的。将N-乙酰高丝氨酸内酯制成饲料添加剂添加到饲料中通过饲喂增强鱼的免疫力来抑制病原菌对鱼类的侵染为本发明的首要创新点。
本发明的优点如下：(1)利用木聚糖酶具有高效表达能力的特点带动N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因的高效表达；(2)通过检测木聚糖酶活性间接的检测N-乙酰高丝氨酸内酯酶活性，即方便了N-乙酰高丝氨酸内酯酶的表达筛选；(3)增加了N-乙酰高丝氨酸内酯酶在鱼肠道中的稳定性；(4)木聚糖酶是一种在饲料添加剂中应用较广的酶制剂，具有多种功能；(5)该工程菌可以同时高效表达木聚糖酶和N-乙酰高丝氨酸内酯酶，具有很高的应用价值。
本发明将具有淬灭酶活性的N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因与木聚糖酶基因融合，得到了融合基因，通过表达融合基因得到了融合蛋白(N-乙酰高丝氨酸内酯酶-木聚糖酶融合蛋白)SL2B-6。本发明提供的融合蛋白具有适宜的作用pH值，较强的金属离子和表面活性剂抗性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可作为一种新型饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
附图说明
图1为纯化前培养液和纯化后溶液的电泳图。
图2为融合蛋白SL2B-6最适pH的确定。
图3为融合蛋白SL2B-6的pH稳定性。
图4为融合蛋白SL2B-6最适作用温度的确定。
图5为融合蛋白SL2B-6的热稳定性。
图6为融合蛋白SL2B-6的蛋白酶抗性分析。
图7为融合蛋白SL2B-6的动力学。
图8为融合蛋白SL2B-6对罗非鱼血清溶菌酶活力的影响。
图9为融合蛋白对罗非鱼血清CAT活力的影响。
图10为融合蛋白对罗非鱼血清SOD活力的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法(Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A LaboratoryManual(1990)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编，1994)。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的培养基，如无特殊说明，溶剂均为水。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
内切酶购自TaKaRa公司。燕麦木聚糖购自sigma公司。连接酶购自Invitrogen公司。
胰蛋白酶(Trypsin)、α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)、蛋白酶K(Proteinase K)、枯草杆菌蛋白酶A(Subtilisin A)、胶原蛋白酶(Collagenase)：五种蛋白酶均为sigma产品。
C4-HSL(N-Butyryl-DL-homoserine lactone)和C6-HSL(N-Hexanoyl-DL-homoserinelactone)购自Fluka公司。
C7-HSL(N-Heptanoyl-DL-homoserine lactone)、
C8-HSL(N-Octanoyl-DL-homoserine lactone)、
C10-HSL(N-Decanoyl-DL-homoserine lactone)、
C12-HSL(N-Dodecanoyl-DL-homoserine lactone)、
C14-HSL(N-Tetradecanoyl-DL-homoserine lactone)、
3-Oxo-C6-HSL(N-(3-Oxo-hexanoyl)-L-homoserine lactone)、
3-Oxo-C8-HSL(N-(3-Oxo-octanoyl)-L-homoserine lactone)、
3-Oxo-C10-HSL(N-(3-Oxo-decanoyl)-L-homoserine lactone)、
3-Oxo-C12-HSL(N-(3-Oxo-dodecanoyl)-L-homoserine lactone)、
3-Oxo-C14-HSL(N-(3-Oxo-tetradecanoyl)-L-homoserine lactone)、
3-hydroxy-C12-HSL(N-(3-Hydroxy-dodecanoyl)-L-homoserine lactone)和
3-hydroxy-C14-HSL(N-(3-Hydroxy-tetradecanoyl)-L-homoserine lactone)为Sigma(USA)产品。
YPD培养基：2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物。
BMGY培养基：2％蛋白胨、1％酵母提取物、1％甘油、1.34％YNB、生物素0.0004g/L。
BMMY培养基：2％蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％甲醇1.34％YNB、生物素0.0004g/L。
ATMM盐溶液：KH2PO40.079mol/L，NaOH 0.044mol/L，(NH4)2SO40.015mol/L，MgSO4·7H2O 0.6mmol/L，CaCl20.06mmol/L，FeSO4·7H2O 0.027mmol/L，MnSO4·H2O0.007mmol/L。
葡萄糖基础培养基：葡萄糖0.75g，琼脂粉3g，超纯水138g，灭菌冷却后加入ATMM盐溶液15mL，X-gal溶液200μL。
N-乙酰高丝氨酸内酯的酶活测定方法：
①将信号分子溶于无水乙醇中，使其终浓度为1mg/mL(母液)。
②将20μL待测溶液、180μL缓冲液和1μL母液混合摇匀，35℃温育30min后，加入50uL 10％SDS水溶液终止反应，得到反应液；将20μL待测溶液、180μL缓冲液、1μL母液和50uL 10％SDS水溶液混合摇匀，35℃温育30min，作为对照液。
③用琼脂平板扩散法检测AiiA酶的反应液；
制备琼脂条：将葡萄糖基础培养基倒入直径为18cm的大平板中，凝固后，按照方格纸的线条用无菌小刀将培养基切成间隔4mm的20个长方形细条(8mm×6cm)；在每个细条的前8mm处用直径为6mm的无菌打孔器压成圈环，之后每隔4mm用无菌牙签接入KYC55指示菌，再将反应液(或对照液)10μL加入到打孔的圈环中，待渗入培养基后，用封口膜封好放入30℃温箱，培养24h后观察结果，计数变蓝的点，换算成距离，根据已制好的标准曲线计算酶活。
标准曲线制备：用无水乙醇将信号分子稀释成系列的浓度梯度，并等体积加入上述琼脂条的加样圈内，每个稀释度设定三个平行，平板置于30℃培养24h。计数变蓝的点，换算成距离，即测量显色半径，分析信号分子物质的量(nmol/L)与半径(cm)的关系，构建标准曲线。
U＝6.52*(1.4163Rck-1.4163Rs)*50/30/106 (待测溶液为20μl)；
e＝2.718281828459045，R(距离mm)。Rck：对照液样品的扩散距离。Rs：反应液样品的扩散距离。以上两个公式相同，第二个式子是对第一个式子的简化。
酶活单位(U)的定义：在35℃，pH8.0条件下，每分钟降解1nmol信号分子所需要的酶量定义为一个酶活单位。
木聚糖酶的酶活测定方法：
①将信号分子溶于pH7.4的0.1mol/LPBS中。使其终浓度为10g/L(母液)
②将20μL待测溶液、80μL缓冲液和900μL母液混合摇匀，55℃温育10min后，加入1.5mL DNS溶液终止反应，得到反应液；将20μL待测溶液、80μL缓冲液、900μL母液和1.5mL DNS溶液混合摇匀，55℃温育10min，作为对照液；
③将反应液(或对照液)于沸水浴中保温5mim后取出，待冷却到室温后在OD540处测定光度值。
酶活单位(U)的定义：在55℃，pH8.0条件下，每分钟产生1umol木聚糖需要的酶量定义为一个酶活单位。
实施例1、融合蛋白SL2B-6的制备
一、融合基因sb2b-6的制备
1、木聚糖酶基因片段的制备
①人工合成序列表的序列2自5’末端第10至909位核苷酸所示的木聚糖酶基因xynAS27的CD区域xynAS27cd。
②以步骤①合成的基因为模板，用xynAS27-F(下划线标注EcoR I酶切位点)和L2-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。
xynAS27-F：5′-CTTGAATTCGCCGAGAGCACGCTCG-3′；
L2-R：5′-AGAGCCGCCGCCGCCGAGTGCGTCGAGGACG-3′。
PCR扩增所用过的酶为LA Taq(Takara，Japan)。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
④回收PCR产物。
2、N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因的制备
①人工合成序列表的序列2自5’末端第925至1677位核苷酸所示的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiA-B546。
②以步骤①合成的基因为模板，用L2-F和SL2B-YR(下划线标注Spe I酶切位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。
L2-F：5′-GGCGGCGGCGGCTCTATGACAGTAAAGAAGC-3′；
SL2B-YR：5′-CGGACTAGTCTATATATACTCTGGGAAC-3′。
PCR扩增所用过的酶为LA Taq(Takara，Japan)。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
④回收PCR产物。
3、融合基因sb2b-6的制备
同时以步骤1回收的PCR产物(xynAS27cd)和步骤2回收的PCR产物(aiiA-B546)为模板，用xynAS27-F和SL2B-YR组成的引物对进行overlap PCR，得到PCR产物(融合基因sb2b-6)。
PCR扩增所用过的酶为LA Taq(Takara，Japan)。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，65℃到55℃(前10个循环中，每循环降低1℃，剩余循环保持在55℃)30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。
将PCR产物与pEASY-T3载体(购自北京全式金生物公司)连接后进行测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如序列表的序列2所示。序列2所示DNA编码序列1所示的蛋白质。序列2所示DNA中，自5’末端第10至909位核苷酸为木聚糖酶基因片段，第925至1677位核苷酸为N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因。
二、重组质粒和重组菌的获得
1、重组质粒的获得
(1)用限制性内切酶EcoR I和Spe I双酶切融合基因sb2b-6，回收酶切产物。
(2)用限制性内切酶EcoR I和Spe I双酶切质粒pPIC9(购自Invitrogen公司)，回收载体骨架。
(3)将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，得到连接产物。
(4)将连接产物进行测序，结果表明得到了重组质粒pPIC9/sb2b-6(在pPIC9的EcoR I和Spe I酶切位点间插入了序列表的序列2所示的融合基因)。
2、重组菌的获得
(1)制备GS115感受态细胞
①将毕赤酵母GS115(购自北京全式金生物公司)接种到含5mL YPD液体培养基的100mL三角瓶中，28-30℃摇床过夜培养。
②将过夜培养物按1/1000-5/1000的接种量(体积比)转接到含500mL YPD液体培养基的1000mL三角瓶中培养至OD600＝1.3-1.5。
③于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。
④用500mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。
⑤用250mL冰预冷的去离子水轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。
⑥用20mL冰预冷的1mol/L山梨醇水溶液轻柔重悬沉淀，4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。
⑦用1mL预冷的1mol/L山梨醇水溶液轻柔重悬沉淀，按每管80μL分装成备用的毕赤酵母感受态细胞，保存于-70℃。
(2)重组菌的获得
将步骤1获得的重组质粒pPIC9/sb2b-6电击转化GS115感受态细胞，得到重组菌。
筛选得到一株高效表达融合蛋白的重组菌，将其命名为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)XynAS27-L2-AiiAB546(SL2B)。该菌株已于2010年7月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.3974。
(3)对照菌的获得
将质粒pPIC9电击转化GS115感受态细胞，得到对照菌I。
三、融合蛋白SL2B-6的表达化
1、挑取重组菌XynAS27-L2-AiiAB546(SL2B)(或对照菌I)单克隆，接种于3mL BMGY培养液中，30℃振荡培养48h；
2、5000rpm离心15min，去上清，向装有菌体的管中加入1mL BMMY培养液30℃振荡培养72h；
3、取培养液12,000rpm离心5min，收集上清液(含融合蛋白SL2B-6)，作为待测溶液检测N-乙酰高丝氨酸内酯酶和木聚糖酶的活性。N-乙酰高丝氨酸内酯的酶活性测定时，信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃；木聚糖酶的酶活性测定时，底物为燕麦木聚糖，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为55℃。
对照菌I的上清液的N-乙酰高丝氨酸内酯酶比活力约为0U/mL，木聚糖酶比活力约为0U/mL。重组菌的上清液的N-乙酰高丝氨酸内酯酶比活力为0.35U/mL，木聚糖酶比活力为60.56U/mL，即对于同一蛋白溶液，60.56U/mL的木聚糖酶相当于0.35U/mL的N-酰基高丝氨酸内酯。目前已报道的N-乙酰高丝氨酸内酯的酶活测定方法都比较繁琐且测定时间较长，淬灭酶与木聚糖酶融合表达后通过检测木聚糖酶的酶活性即可间接得到N-乙酰高丝氨酸内酯的酶活性，大大方便了重组工程菌的筛选以及N-乙酰高丝氨酸内酯的酶活性的检测。
四、融合蛋白SL2B-6的纯化
1、将置于冰浴中的步骤三得到的上清液放在磁力搅拌器上低速搅拌。并向上清液中缓慢加入研磨后的硫酸铵粉末，按照30％、50％、60％、80％、100％的硫酸铵饱和度进行蛋白沉淀，每个饱和度的沉淀时间都在20min-30min之间。
2、分别收集各个硫酸铵饱和度的溶液，13000rpm离心15min，收集沉淀。
3、将60％、80％的硫酸铵饱和度的沉淀混合，进行分子筛纯化。
4、分子筛纯化
分子筛采用的型号是Hiprep 16/60sephacryls-100High Resolution，柱长60cm，内径1.6cm；填充物是烯丙基葡聚糖与N、N’-甲级双丙烯酰胺共价交联形成的复合物(粒径为25-75um)；先将分子筛用水清洗3-4个柱体积，再换成pH7.4的0.01molPBS缓冲液清洗2-3个柱体积后上样纯化；洗脱液(0.01mol Na2HPO4，0.01molNaH2PO4；pHpH7.4)；洗脱液的体积为2L，流速是0.6mL/min，压力是0.15Mpa；收集39mL至63mL的洗脱液，混合后即为融合蛋白溶液。
2、SDS-PAGE鉴定
将融合蛋白溶液(SL2B-6溶液)进行SDS-PAGE(12％的分离胶、5％的浓缩胶)，电泳图见图1。结果表明，工程菌纯化后的融合蛋白溶液显示电泳纯的单一条带(分子量约为64kDa)，
3、酶活鉴定
将融合蛋白溶液作为待测溶液检测N-乙酰高丝氨酸内酯酶和木聚糖酶的活性。N-乙酰高丝氨酸内酯的酶活性测定时，信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃；木聚糖酶的酶活性测定时，底物为燕麦木聚糖，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为55℃。
融合蛋白溶液的N-乙酰高丝氨酸内酯酶比活力为0.452U/mL，木聚糖酶比活力为99.53U/mL。融合蛋白主要在毕氏酵母菌的胞外表达。
实施例2、融合基因与N-酰基高丝氨酸内酯基因表达量的差异
一、对照菌II的制备
1、N-酰基高丝氨酸内酯酶基因的制备
①人工合成序列表的序列2自5’末端第925至1677位核苷酸所示的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因aiiA-B546。
②以步骤①合成的基因为模板，用P1和P2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。
P1：5′-CTTGAATTCGGCGGCGGCGGCTCTATGACAGTAAAGAAGC-3′；
P2：5′-CGGACTAGTCTATATATACTCTGGGAAC-3′。
PCR扩增所用过的酶为LA Taq(Takara，Japan)。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。
④回收PCR产物(N-酰基高丝氨酸内酯酶基因)。
2、重组质粒和重组菌的获得
N-酰基高丝氨酸内酯酶基因代替融合基因sb2b-6，其它同实施例1的步骤二，得到对照菌II。
二、基因表达量的差异
1、分别将实施例1制备的工程菌XynAS27-L2-AiiAB546(SL2B)和对照菌II的阳性克隆接种于PDA培养基中30℃振荡培养48h；
2、分别转接于300mL BMGY培养液中，30℃振荡培养48h；
3、5000rpm离心15min，去上清，分别将菌体用BMMY培养液重悬后加入100mL BMMY培养液30℃振荡培养72h；
4、分别取培养液12,000rpm离心5min，收集上清液，作为待测溶液检测N-乙酰高丝氨酸内酯的酶活；信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。
工程菌上清的比活力为0.35U/mL，对照菌II上清的比活力为0.33U/mL。
实施例3、融合蛋白SL2B-6和N-乙酰高丝氨酸内酯在鱼肠液中的稳定性
一、融合蛋白SL2B-6在鱼肠液中的稳定性
1、将饱食一小时后的鲤鱼麻醉取肠道，用pH 7.5、0.01moL的PBS缓冲液冲洗肠道内部。
2、将肠道剪开，用无菌刀片将肠道粘液轻轻刮到pH 7.5、0.01moL的PBS缓冲液中，分装于1.5moL的Ep管中，200g/min离心3min取上清，得到鱼肠液。
3、将实施例1的步骤三制备工程菌上清与鱼肠液混合(体积比为1∶10)，常温处理1h，将混合液作为待测溶液分别测定N-乙酰高丝氨酸内酯酶活性和木聚糖酶酶活性。
N-乙酰高丝氨酸内酯酶活性测定时，信号分子为3-oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。木聚糖酶活性测定时，底物为燕麦木聚糖，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为55℃。
与鱼肠液混合前，工程菌上清的N-乙酰高丝氨酸内酯酶比活性为0.35U/mL，木聚糖酶比活性为60.56U/mL。将混合前的比活力作为100％，与鱼肠液混合处理后，工程菌上清的N-乙酰高丝氨酸内酯酶比活力保持60％以上的酶活(0.23U/mL)，木聚糖酶比活力保持95％以上的酶活(58.53U/mL)。结果表明，SL2B-6在鱼肠液中较稳定。
二、N-乙酰高丝氨酸内酯在鱼肠液中的稳定性
将实施例2制备的对照菌II上清代替实施例1的步骤三制备工程菌上清，方法同步骤一。
与鱼肠液混合前，对照菌II上清的N-乙酰高丝氨酸内酯酶比活性为0.33U/mL。将混合前的比活力作为100％，与鱼肠液混合处理后，对照菌II上清的N-乙酰高丝氨酸内酯酶比活力保持55％的酶活(0.19U/mL)。
实施例4、融合蛋白SL2B-6的酶学性质
一、最适pH
将实施例1制备的融合蛋白溶液作为待测溶液，检测25℃时不同的pH条件下的N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活，以测定其最适pH。
酶活测定时信号分子为3-Oxo-C8-HSL，分别采用以下几种缓冲液：
pH 5.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；
pH 6.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 6.5、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 7.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 7.5、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 8.5、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液；
pH 9.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；
pH 10.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。
以最高比活力为100％，各个pH下的比活力与最高比活力的比值作为相对酶活力(相对活性)。结果见图2。SL2B-6的最适作用pH为8.0，在pH6.5-8.0保持80％以上的酶活。
二、pH稳定性
将实施例1制备的融合蛋白溶液用10kD超滤管超滤浓缩后分别在如下缓冲液中25℃处理1h：
pH 5.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；
pH 6.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 7.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；
pH 9.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；
pH 10.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；
pH 11.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；
pH 12.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。
将处理后的溶液作为待测溶液，检测35℃下N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活，信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液。
以最高比活力为100％，各个pH处理后溶液的比活力与最高比活力的比值作为相对酶活力。结果见图3。SL2B-6在pH范围为6.0-11.0间都很稳定，保持80％以上的酶活。
三、最适温度
将实施例1制备的融合蛋白SL2B-6溶液作为待测溶液，检测的pH8.0不同温度下的N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活，以测定其最适温度。
酶活测定时信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液。温度分别为0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃和70℃。
以最高比活力为100％，各个温度下的比活力与最高比活力的比值作为相对酶活力。结果见图4。SL2B-6的最适作用温度35℃，温度高于60℃时仍有30％左右的酶活。
四、温度稳定性
将实施例1制备的融合蛋白溶液在50℃下分别保温2、5、10、15、20、30、60分钟后，处理后的溶液作为待测溶液测定35℃下N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活。信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液。
以最高比活力为100％，各个处理时间后溶液的比活力与最高比活力的比值作为相对酶活力。结果见图5。处理60min后仍有95以上％的酶活，温度稳定性较好。
实施例5、融合蛋白SL2B-6对相关化学试剂的抗性
①将信号分子溶于缓冲液中，使其终浓度为1mg/mL(母液)；
②将20μL待测溶液、180μL缓冲液和1μL母液混合摇匀，分别加入不同的金属离子或化学试剂(K+、Na+、Ca2+、Li+、Co+、Cr3+、Ni2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Hg2+、Pb+、EDTA、巯基乙醇和SDS；终浓度为1mmol/L或10mmol/L)，35℃温育30min后，加入50uL 10％SDS水溶液终止反应，得到反应液；将20μL待测溶液、180μL缓冲液和1μL母液混合摇匀，35℃温育30min后，加入50uL 10％SDS水溶液终止反应，作为对照液；
③用琼脂平板扩散法检测反应液，计算N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活。
待测溶液为实施例1制备的融合蛋白溶液，信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。
对照液的比活力为0.45U/mL，将对照的比活力作为100％，其它各个处理的比活力与最高比活力的比值作为该体系的相对酶活力，结果见表2。
表2加入金属离子及相关化学试剂后的相对酶活力
| 化学试剂 | 1mmol/L | 10mmol/L | 化学试剂 | 1mmol/L | 10mmol/L |
| Na+ | 99.10 | 99.10 | Mn2+ | 98.10 | 97.22 |
| K+ | 98.10 | 98.10 | Zn2+ | 98.10 | 98.84 |
| Ca2+ | 98.10 | 98.10 | Pb+ | 98.10 | 98.10 |
| Li+ | 98.10 | 98.10 | SDS | 65.97 | 0.00 |
| Co2+ | 98.10 | 98.10 | Ag+ | 0.00 | 0.00 |
| Cr3+ | 96.17 | 0.00 | Hg2+ | 29.79 | 29.79 |
| Ni+ | 98.10 | 98.10 | EDTA | 98.10 | 98.84 |
| Cu2+ | 50.94 | 41.27 | 巯基乙醇 | 99.47 | 98.84 |
| Mg2+ | 98.10 | 97.22 | Fe2+ | 98.10 | 98.10 |
SDS、Ag+、Cr3+、Hg2+、Cu2+对融合蛋白的酶活具有抑制作用，其中SDS、Cr3+、Cu2+随的离子浓度提高对酶活的抑制作用增强。其余离子或化学试剂对酶活没有显著影响。
实施例6、融合蛋白SL2B-6对蛋白酶的抗性
用pH 7.0 0.1mol/L Tris-HCl将胰蛋白酶配成1mg/mL的溶液(溶液A)；
用pH 7.0 0.1mol/L Tris-HCl将α-糜蛋白酶配成1mg/mL的溶液(溶液B)；
用pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl将蛋白酶K配成1mg/mL的溶液(溶液C)；
用pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl将枯草杆菌蛋白酶A配成1mg/mL的溶液(溶液D)；
用pH7.5 0.1mol/L Tris-HCl将胶原蛋白酶配成1mg/mL的溶液(溶液F)。
将10体积份实施例1制备的融合蛋白SL2B-6溶液与1体积份蛋白酶溶液(溶液A、溶液B、溶液C、溶液D或溶液F)混合，不同时间(0、10、20、30或60min)后取样，作为待测溶液检测N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活。检测信号分子为3-Oxo-C8-HSL，缓冲液为缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。
将0min时刻待测溶液的比活力作为100％，其它各个时刻待测溶液的比活力与0min时刻待测溶液的比活力的比值作为该体系的相对酶活力，结果见图6。用不同蛋白酶处理60min时间后融合蛋白的剩余酶活分别为96.28％(胰蛋白酶)，98.16％(α-糜蛋白酶)，76.08％(蛋白酶K)，81.29％(枯草芽孢杆菌蛋白酶A)，97.30％(胶原蛋白酶)。由此可以看出融合蛋白SL2B-6对多种蛋白酶都具有较强的抗性。
实施例7、融合蛋白SL2B-6的底物特异性
分别用C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-H-C8-HSL和3-H-C14-HSL作为信号分子，检测实施例1制备的融合蛋白溶液的N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活。缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。
结果如下：C7-HSL(1.897U/mL)、C8-HSL(1.287U/mL)、C10-HSL(11.188U/mL)、3-oxo-C8-HSL(1.454U/mL)、3-oxo-C10-HSL(9.696U/mL)、3-oxo-C12-HSL(3.082U/mL)、3-oxo-C14-HSL(312.399U/mL)、3-H-C8-HSL(5.219U/mL)；对C4-HSL、C6-HSL、C14-HSL也具有一定的降解作用，但对3-oxo-C6-HSL、C12-HSL、3-H-C14-HSL降解作用不明显。
实施例8、融合蛋白SL2B-6的动力学
动力学的标准曲线见图7。融合蛋白SL2B-6动力学的测定结果为Km＝0.012mg/mL。
实施例9、融合蛋白SL2B-6作为饲料添加剂的应用
以罗非鱼为实验动物，探讨融合蛋白SL2B-6(实施例1的融合蛋白溶液)的免疫保护效应、及对生长、存活、生长、饲料转化效率的影响。实验期平均水温为26℃，投饲率5％(饲料质量为鱼质量的5％)，每天6:00和19:00各投喂日投饲量的40％和60％，每周微调一次。每3天换水1次，全天充氧。实验在全自动循环水中进行。
一、免疫保护实验
罗非鱼(平均体重10g)分成6个实验组，每组3个重复，每个重复20尾鱼；同时开始实验，即分别进行如下饲喂和攻毒处理：
第I组(CK组)：饲喂市售罗非鱼饲料；
第II组：饲喂混合饲料丙(市售罗非鱼饲料和SL2B-6融合蛋白混合，每克混合饲料中含有40U N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活的SL2B-6融合蛋白)；
第III组：饲喂市售罗非鱼饲料；
第IV组：饲喂混合饲料甲(市售罗非鱼饲料和SL2B-6融合蛋白混合，每克混合饲料中含有4U N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活的SL2B-6融合蛋白)；
第V组：饲喂混合饲料乙(市售罗非鱼饲料和SL2B-6融合蛋白混合，每克混合饲料中含有40U N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活的SL2B-6融合蛋白)；
第VI组：饲喂混合饲料丙(市售罗非鱼饲料和SL2B-6融合蛋白混合，每克混合饲料中含有400U N-乙酰高丝氨酸内酯酶酶活的SL2B-6融合蛋白)；
实验期间水中：DO＞5.0mg O/L、氨氮＜0.5mg N/L、亚硝酸盐氮＜0.05mgN/L。第III组、第IV组、第V组、第VI组，于实验开始96小时后进行急性注射攻毒(所用的毒株为Aeromonas hydrophila，简称ah，ATCC 7966)。攻毒后每天观察并统计存活率，每天检测各组罗非鱼血清Ah抗体滴度。攻毒后第7、14、21和28天取血液样品测定各免疫指标(溶菌酶活力、过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力)。
溶菌酶活力的检测参见文献：曹宏梅，李健，战文斌，2006.鳗弧菌和藻溶弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果.中国水产科13，397-402.。过氧化氢酶(CAT)活力的检测参见文献：徐镜波，袁晓凡，郎佩珍，1997.过氧化氢酶活性及活性抑制的紫外分光光度法测定.环境化学16，73-76。超氧化物歧化酶(SOD)活力的检测参见文献：刘成荣，陈振平，张之文，2008.嗜水气单胞菌脂多糖及绣球菌多糖对泥鳅免疫功能及消化功能的影响.海洋科学32，1-9。
二、与免疫效果相关的各指标的检测结果
1、免疫保护效应
实验结果见表3。
表3攻毒后不同时间各组罗非鱼的死亡率
结果显示，融合蛋白本身不会对罗非鱼的存活造成不良影响，可对攻毒的鱼体起到显著的保护作用，显著降低了鱼的死亡率(P＜0.01)，不同融合蛋白饲喂水平之间差异不显著(P＞0.05)。目前，注射法、浸浴法和口服法是鱼用疫苗的给予方式。这三种方法在实际应用中均有各自的优缺点：注射法剂量准确，诱导免疫应答强，但费时费力，鱼的应激反应也大，对鱼苗和较小的鱼类并不适用，实际操作也不方便；浸泡免疫省时方便，但其吸收效果受到多种因素的影响；口服免疫对鱼体无损伤，操作方便，不受时间、地点、鱼体大小的限制，如果可以通过饲添高效的类免疫刺激剂解决以上问题，将极大地促进我国的健康养殖水平。从实验效果上看融合蛋白满足了这种要求。另外，融合蛋白本质解决了一些疫苗安全性的问题。
2、血清Ah抗体滴度
抗原为Aeromonas hydrophila，抗原浓度为108cfu/mL，实验各组(I、II、III及IV组)血清Ah抗体滴度检测结果如表4所示。
表4实验各组罗非鱼血清抗体滴度
融合蛋白极显著提高了罗非鱼血清Ah抗体滴度(P＜0.01)，可为实现对罗非鱼的长效保护。
3、溶菌酶活力、过氧化氢酶活力、超氧化物歧化酶活力
溶菌酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶是鱼类免疫中重要的免疫指标，其中溶菌酶具有溶菌作用；SOD活性与机体免疫水平密切相关，对于增强巨噬细胞的防御功能和整个机体的免疫机能有重要作用。
溶菌酶活力见图8。过氧化氢酶活力见图9。超氧化物歧化酶活力见图10。
从图8可以看出：第III组和第V组由于进行了攻毒，引发了溶菌酶活性的上升，并在14天时达到最高值；第V组的酶活力高于第III组，即融合蛋白通过调控Ah的群体感应体系而降低其部分毒性因子的表达。
由图9和图10可以看出：在CAT和SOD活性的检测中第III组和第V组的变化趋势相近，虽然第V组早期的酶活性稍低，但长期看来第V组可以引发长期稳定的免疫效果。
4周生长实验表明，添加淬灭酶可以对染毒的鱼体起到明显保护作用(以存活率计，P＜0.05)，其中推荐淬灭酶剂量4U/g饲料；同时饲喂淬灭酶可以极显著提高罗非鱼的血清抗体滴度(P＜0.01)；酶类免疫指标的检测显示淬灭酶的饲喂可以诱发长期稳定的免疫效果。
二、池塘网箱养殖实验，设置对照组与加酶组(4U/g饲料)。
在10亩池塘进行，内置2.0m×2.0m×1.5m浮式网箱12个，每个网箱放30尾罗非鱼(平均初重50g)；罗非鱼按网箱分成两组(实验组饲喂混合饲料甲，对照组饲喂市售罗非鱼饲料)，每组6个平行；实验进行8周，实验在高温季节进行(2009年7月15日至9月15日，平均水温29.5℃)，为罗非鱼细菌病高发期；每天投喂3次，接近饱食投喂，每周上调一次；实验期间水中：DO＞5.0mg O/L、氨氮＜0.5mg N/L、亚硝酸盐氮＜0.05mgN/L；实验结束时统计各组存活率、增重率及饲料系数(饲料系数＝饲料消耗量/增重量×100％)，结果见表5。
表5网箱养殖实验结果
$同一行数值具有相同肩注字母的表示差异不显著(P＞0.05)。
实验组罗非鱼体重增加了18.7％(P＜0.05)、饲料系数降低了17.8％(P＜0.05)，存活率提高41.8％(P＜0.05)，养殖效益提高96.5％。8周养殖结果表明饲喂淬灭酶可明显改善罗非鱼的存活率、生长及饲料系数(P＜0.05)，显著提高养殖效益(P＜0.05)。
以上结果表明，采用本发明的融合蛋白作为饲料添加剂，阻断了病原菌对鱼类的侵染，增强了鱼的免疫力，可显著提高罗非鱼对病原性细菌的免疫保护效应，并具备类似减毒活疫苗的生理效应，是一种免疫刺激剂；高温池塘养殖条件下饲喂淬灭酶可明显改善罗非鱼的存活率、生长及饲料转化效率，提高养殖效益。
Claims (10)
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且同时具有N-乙酰高丝氨酸内酯酶与木聚糖酶活性的的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：它为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)序列表中序列2自5’末端第10至1677位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且同时具有N-乙酰高丝氨酸内酯酶与木聚糖酶活性的的DNA分子；
4)与1)或2)或限定的DNA序列具有90％以上同源性，且同时具有N-乙酰高丝氨酸内酯酶与木聚糖酶活性的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pPIC9的多克隆位点得到的重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求4或5所述重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述宿主菌为大肠杆菌或酵母菌；所述酵母菌优选为毕赤酵母。
7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)XynAS27-L2-AiiAB546(SL2B)，其保藏号为CGMCC No.3974。
8.生产权利要求1所述蛋白质的方法，是发酵培养权利要求4或6所述的重组菌，得到权利要求1所述蛋白质。
9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4至6中任一所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备饲料添加剂中的应用。
10.一种饲料添加剂，它的活性成分为权利要求1所述蛋白。
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