CN101818135B - 一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和应用。根据本发明的α-半乳糖苷酶AgalB，其具有如SEQ ID NO.1或3所示的氨基酸序列，编码上述α-半乳糖苷酶有如SEQ IDNO.4或6所示的核苷酸序列。本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶具嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶。

Description

一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶或蜜二糖酶(α-galactosidase，α-D-galactoside galactohydrolase，EC 3.2.1.22)是一种外切型糖苷酶，它能从各种半乳糖苷上将非还原性末端的α-(1，6)键连接的半乳糖基催化水解下来。这类糖苷包括半乳糖寡糖(如蜜二糖、棉子糖和水苏糖)、分支多糖(如半乳甘露聚糖)和半乳糖脂(Margolles-Clark E，et al.Eur J Biochem，1996，240(1)：104-11.)。

α-半乳糖苷酶作为一种新型饲用酶制剂在饲料工业中得到了广泛的应用。豆粕是饲料中用量最大的蛋白质原料，在大豆粕中棉子糖和水苏糖的含量约为7％，它们不能被动物消化道的内源酶降解，只有经过消化道微生物发酵以后才能被利用，发酵过程中产生的CO₂，CH₄和H₂等气体使机体出现一系列的胀气恶心等症状。通过添加α-半乳糖苷酶不仅可以降解不溶性的低聚糖提高豆粕的代谢能，同时还可以消除肠道的胀气现象增加动物的采食量(Brenes，A.Poultry Science，1993，72：2281-2293)。在食品工业中α-半乳糖苷酶可用于豆奶的发酵水解豆奶中易使胃胀气的蜜三糖和水苏糖，从而获得低α-半乳糖基寡聚糖含量的豆奶制品有利于人体消化(Cruz R，et al.Journal of Food Science，1981，46：1196-1200)。除此以外，利用α-半乳糖苷酶的转移酶活性可改造环糊精改变药物的理化性质，增加药物的稳定性，从而延长药效。α-半乳糖苷酶在临床医学上可用于治疗法布里病及B-O型血的转换(Zhu A，et al.ArchBiochem Biophys，1996，327(2)：324-329)。

瓜尔豆胶(guar gum)中含有38％～40％的α-半乳糖，半乳糖是以残基的形式连接在以甘露糖为主链的聚糖链上。由于α-半乳糖侧链的存在对甘露聚糖的特性有很大影响，瓜尔豆胶凝胶能力和它在水中的溶解度决定于其侧链的多少和位置。用α-半乳糖苷酶来处理，适量除去其侧链的半乳糖苷残基而不使甘露聚糖主链断裂，可提高其水溶性，也可大幅度提高瓜尔豆胶的高凝胶能力，从而提高它的商品性能。利用酶法(α-半乳糖和甘露聚糖酶的共同作用)改良瓜尔豆胶可以进一步提高其利用范围。有报道，经酶解后的改性瓜尔豆胶被用作口服的结肠定向给药载体，在胃肠道中控制药物释放，以及在结直肠癌的治疗上载运结肠靶向药物(Burke MD，et al.Journal ofControlled Release，2005，104：141-153)。

α-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体内。不同来源的微生物α-半乳糖苷酶这根据其性质特性的不同被应用于不同的领域。而在食品及饲料工业中则要求添加的α-半乳糖苷酶对各种α-半乳糖苷类寡糖都要具有较高的水解能力，而以前报道的α-半乳糖苷酶其底物特异性不能水解多种底物，在应用上各具有其局限性。

本发明得到了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶具有耐酸性，作用pH范围较广，较好的耐热性，极好的抗蛋白酶能力，较好的水解各种底物的能力，其对半乳甘露聚糖支链的降解可显著促进甘露聚糖酶对底物主链的降解能力，该酶作为一种新型的酶制剂，可广泛的应用于饲料、食品、医药等行业。

发明内容

本发明的目的是提供一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB。

本发明的再一目的是提供编码上述α-半乳糖苷酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述α-半乳糖苷酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述α-半乳糖苷酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备上述嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB的基因工程方法。

本发明的再一目的是提供上述嗜酸α-半乳糖苷酶的应用。

本发明从嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1获得了一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB，所述嗜酸真菌Bispora sp在公开号为CN101457207的专利申请文献中公开，其保藏号为：CGMCC 2500，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)。

根据本发明的具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MAILFACFAT LVGHSIALNN GVGKVPPMGY DTFNAYGCDY NASSVLAQGEAMKRTGLVDA 60GYNIFILDDC YALKERNATG YMVADPKKFP NGIPALSKQM NDLGISLAAYGDNGYYTCAG 120YPGSYGHEMK DLETWHSWGM SYLKYDNCYI PADNITQENM FGRYTRMSDAIAAFAAKIHR 180PPFIFYLCEW GWQQPWIWGR RISQGWRIDG DIKPYWSAIA SIIDQASFQYWASDFYGRND 240MDILEVGNTG QGTPPGNLTY EESKTHFTAW ALMKSPLIIG TDLTNATQETIDILGNRDLI 300KINQDPHVGE SISPFRWGVN PDYVSNPDHP AEYWSGNSSY GVVFMIINSQNTEQTMFFNL 360TESWAIRAGR QYSVYDMWTH TYEGVAVWNL TFSLPPHGVR ALLLNDAGPQPANLDGTCAF 420YYQCSV    426

其中，该酶全长426个氨基酸，N端17个氨基酸为其预测的信号肽序列“MAILFACFATLVGHSIA”(SEQ ID NO.2)。

因此，成熟的嗜酸α-半乳糖苷酶的理论分子量为46.8kDa，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示：LNNGVGKVPP MGYDTFNAYG CDYNASSVLA QGEAMKRTGL VDAGYNIFILDDCYALKERN 60ATGYMVADPK KFPNGIPALS KQMNDLGISL AAYGDNGYYT CAGYPGSYGHEMKDLETWHS 120WGMSYLKYDN CYIPADNITQ ENMFGRYTRM SDAIAAFAAK IHRPPFIFYLCEWGWQQPWI 180WGRRISQGWR IDGDIKPYWS AIASIIDQAS FQYWASDFYG RNDMDILEVGNTGQGTPPGN 240LTYEESKTHF TAWALMKSPL IIGTDLTNAT QETIDILGNR DLIKINQDPHVGESISPFRW 300GVNPDYVSNP DHPAEYWSGN SSYGVVFMII NSQNTEQTMF FNLTESWAIRAGRQYSVYDM 360WTHTYEGVAV WNLTFSLPPH GVRALLLNDA GPQPANLDGT CAFYYQCSV 409

根据本发明的α-半乳糖苷酶AgaB，最适pH为3.5，最适温度为55℃，具有很好的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，具多种底物降解能力。

本发明还提供了编码上述嗜酸α-半乳糖苷酶的基因。该酶的全基因序列如SEQID NO.4所示：ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACG CTTGTGGGCC ACTCGATCGCCTTGAACAAT 60GGCGTGGGCA AAGTCCCTCC AATGGGCTAC GACACATTCA ATGCGTACGGTTGCGATTAC 120AATGCTAGCA GTGTTCTCGC GCAAGGCGAG GCAATGAAAC GAACAGGCCTAGTTGACGCC 180GGTTATAACA TTTTCATTTT AGACGATTGT TATGCCTTGA AGGAGCGTAATGCTACCGGC 240TACATGGTTG CTGATCCAAA GAAATTTCCG AATGGTATTC CGGCTCTATCTAAGCAAATG 300AATGATCTCG GAATTAGCCT TGCTGCGTAT GGTGACAATG GTTATTATACATGCGCCGGC 360TATCCAGGCT CTTATGGCCA TGAGATGAAG GACTTGGAGG TAGGGCGAACCCGTCGATTA 420ACGGAACGGT GGCTGATTCC TTCGACAGAC CTGGCATTCT TGGGGCATGTCTTACCTGAA 480GTATGACAAC TGCTGTGAGT TCCAAGTCCC TAATCGATTC TGCTGCATCCTCACATGGGA 540ATCGTCAAGA TATACCGGCC GACAACATTA CTCAAGAGAA CATGTTCGGTCGGTACACTC 600GCATGTCGGA CGCAATCGCG GCCTTTGCGG CCAAGATTCA TCGACCGCCGTTCATCTTCT 660ACCTTTGCGA ATGGGGCTGG CAGCAACCTT GGATCTGGGG TCGCCGGATTTCCCAAGGTT 720GGCGTATTGA TGGTGACATC AAGCCATATT GGAGCGCGAT CGCCTCTATTATTGATCAGG 780CGTCATTCCA GTACTGGGCT TCCGACTTCT ACGGACGCAA TGACATGGACATCCTCGAGG 840TTGGAAACAC CGGACAAGGC ACTCCGCCGG GGAACCTAAC GTACGAAGAATCTAAGACTC 900ATTTCACAGC CTGGGCGTTG ATGAAAAGTC CACTGATCAT CGGCACTGATCTTACGAACG 960CAACGCAGGA GACGATCGAC ATCCTCGGCA ACCGAGACTT GATCAAAATCAATCAGGACC 1020CTCATGTTGG TGAGTCGATT TCCCCTTTTC GATGGGGAGT TAATCCAGACTATGTCTCTA 1080ATCCGGACCA TCCCGCCGAG TACTGGTCGG GCAACTCTAG CTACGGAGTAGTGTTTATGA 1140TTATTAATAG CCAAAACACC GAGCAAACCA TGTTCTTCAA TTTGACGGAGAGTTGGGCTA 1200TTCGAGCTGG CAGGCAGTAT TCCGTGTATG ACATGTGGAC ACATACGTATGAAGGGGTGG 1260CAGTCTGGTA AGTCGACTGA TCACACAGCT TCTGAGTCTG AATACGATATCGGAGAGGGT 1320GACATTGATG CCGTGATCGC TCAGGAACCT AACATTCTCG CTGCCTCCACACGGCGTCCG 1380CGCACTCTTA CTGAACGACG CGGGTCCACA ACCTGCAAAT CTGGATGGCACATGCGCCTT 1440CTACTATCAA TGTTCGGTAT GA 1462

本发明通过EST表达序列标签和Tail-PCR的方法分离克隆了这一α-半乳糖苷酶基因AgalB，DNA全序列分析结果表明，α-半乳糖苷酶AgalB结构基因AgalB全长1462bp，含有3个内含子，+400～+448bp、+495～549bp、+1269～1345bp为其内含子序列，cDNA长1281bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.5所示。ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACG CTTGTGGGCC ACTCGATCGCCTTGAACAAT 60GGCGTGGGCA AAGTCCCTCC AATGGGCTAC GACACATTCA ATGCGTACGGTTGCGATTAC 120AATGCTAGCA GTGTTCTCGC GCAAGGCGAG GCAATGAAAC GAACAGGCCTAGTTGACGCC 180GGTTATAACA TTTTCATTTT AGACGATTGT TATGCCTTGA AGGAGCGTAATGCTACCGGC 240TACATGGTTG CTGATCCAAA GAAATTTCCG AATGGTATTC CGGCTCTATCTAAGCAAATG 300AATGATCTCG GAATTAGCCT TGCTGCGTAT GGTGACAATG GTTATTATACATGCGCCGGC 360TATCCAGGCT CTTATGGCCA TGAGATGAAG GACTTGGAGA CCTGGCATTCTTGGGGCATG 420TCTTACCTGA AGTATGACAA CTGCTATATA CCGGCCGACA ACATTACTCAAGAGAACATG 480TTCGGTCGGT ACACTCGCAT GTCGGACGCA ATCGCGGCCT TTGCGGCCAAGATTCATCGA 540CCGCCGTTCA TCTTCTACCT TTGCGAATGG GGCTGGCAGC AACCTTGGATCTGGGGTCGC 600CGGATTTCCC AAGGTTGGCG TATTGATGGT GACATCAAGC CATATTGGAGCGCGATCGCC 660TCTATTATTG ATCAGGCGTC ATTCCAGTAC TGGGCTTCCG ACTTCTACGGACGCAATGAC 720ATGGACATCC TCGAGGTTGG AAACACCGGA CAAGGCACTC CGCCGGGGAACCTAACGTAC 780GAAGAATCTA AGACTCATTT CACAGCCTGG GCGTTGATGA AAAGTCCACTGATCATCGGC 840ACTGATCTTA CGAACGCAAC GCAGGAGACG ATCGACATCC TCGGCAACCGAGACTTGATC 900AAAATCAATC AGGACCCTCA TGTTGGTGAG TCGATTTCCC CTTTTCGATGGGGAGTTAAT 960CCAGACTATG TCTCTAATCC GGACCATCCC GCCGAGTACT GGTCGGGCAACTCTAGCTAC 1020GGAGTAGTGT TTATGATTAT TAATAGCCAA AACACCGAGC AAACCATGTTCTTCAATTTG 1080ACGGAGAGTT GGGCTATTCG AGCTGGCAGG CAGTATTCCG TGTATGACATGTGGACACAT 1140ACGTATGAAG GGGTGGCAGT CTGGAACCTA ACATTCTCGC TGCCTCCACACGGCGTCCGC 1200GCACTCTTAC TGAACGACGC GGGTCCACAA CCTGCAAATC TGGATGGCACATGCGCCTTC 1260TACTATCAAT GTTCGGTATG A 1281

其中，信号肽的碱基序列为：ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACGCTTGTGGGCC ACTCGATCGC C(SEQ ID NO.4)。

成熟蛋白理论分子量为46.8kDa，该酶属于糖基水解酶第27家族。将α-半乳糖苷酶基因AgalB cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因与来源于Postiaplacenta Mad-698-R的假使蛋白有最高的核苷酸一致性为54％，与Laccaria bicolor S238N-H82来源的属于27家族的糖苷水解酶蛋白的核苷酸序列一致性为47.1％，与Penicillium simplicissimum验证活性α-半乳糖苷酶核苷酸序列一致性为36％，氨基酸序列一致性为35％。说明AgalB是一种新的α-半乳糖苷酶。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因AgalB的重组载体，优选为pPIC9-AgalB。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因AgalB的重组菌株，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到优选重组菌株GS115/AgalB。

本发明还提供了一种制备嗜酸α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶AgalB。

本发明还提供了上述嗜酸α-半乳糖苷酶的应用。

本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶具嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶。

附图说明

图1显示在毕赤酵母中表达的α-半乳糖苷酶AgalB的SDS-PAGE分析，1：纯化的重组α-半乳糖苷酶AgalB；2：脱糖基化AgalB；3：低分子量Marker。

图2显示本发明重组α-半乳糖苷酶的最适pH值。

图3显示本发明α-半乳糖苷酶的pH稳定性。

图4显示本发明α-半乳糖苷酶最适反应温度。

图5显示本发明α-半乳糖苷酶热稳定性。

图6显示α-半乳糖苷酶对蛋白酶抗性分析。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：Bispora sp.MEY-1由本实验室分离获得，在公开号为CN101457207的专利申请文献中公开，其保藏号为：CGMCC 2500，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Ivitrogen公司。对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷，蜜二糖、棉子糖，水苏糖，角豆胶和瓜尔豆胶均购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Bispora sp.MEY-1培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1α-半乳糖苷酶编码基因AgalB的克隆

提取嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

通过cDNA文库的构建和EST测序及Blast比对，得到编码α-半乳糖苷酶3’端的部分核苷酸序列，根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物usp1、usp2、usp3(见表1)。以Bispora sp.MEY-1基因组DNA为模板，通过TAIL-PCR得到已知基因序列的5’端侧翼序列，将扩增产物回收后送上海生工测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。

表1.半乳糖苷酶基因克隆TAIL-PCR特异性引物

实施例2α-半乳糖苷酶基因的RT-PCR分析

提取Bispora sp.MEY-1的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(AgalB F1：5′-ATGGCGATACTTTTTGCTTGCTTTGCGACGCTTG-3′，AgalB R：5′-TCATACCGAACATTGATAGTAGAAGGCGCATGTGC-3′)扩增该单链cDNA，获得α-半乳糖苷酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送上海生工测序。

通过比较α-半乳糖苷酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有3个内含子，cDNA长1281bp，编码426个氨基酸和一个终止密码子，N端17个氨基酸为其预测的信号肽序列，所测出的基因AgalB的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的α-半乳糖苷酶基因序列进行同源比较，氨基酸序列最高一致性为35％，核苷酸序列一致性为36％，证明从Bispora sp.MEY-1中分离克隆得到的编码α-半乳糖苷酶的基因为新基因。

实施例3重组α-半乳糖苷酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将编码α-半乳糖苷酶的基因AgalB双酶切(SnaBI+NotI)，切出编码成熟α-半乳糖苷酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Bispora sp.MEY-1α-半乳糖苷酶基因AgalB的重组质粒pPIC-AgalB并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/AgalB。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，20℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定α-半乳糖苷酶的活力。重组α-半乳糖苷酶的表达量为2.2U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了表达，且所表达的α-半乳糖苷酶为糖蛋白，表达的α-半乳糖苷酶经过纯化并脱糖基化之后，其分子量与理论分子量一致(图1)。

实施例4重组α-半乳糖苷酶的活性分析

酶活性测定方法采用pNPG法。将pNPG溶于0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，使其终浓度为5mmol/L。将100μL酶液，150μL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和250μL 5mmol/L的pNPG混合，摇匀。55℃温育5min后，反应液中加入1.5mL 1mol/L的Na₂CO₃溶液来终止反应。在405nm处测其OD值，以对硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。对照管加酶液和缓冲液后，先加Na₂CO₃溶液再加pNPG溶液。

酶活(U/mL)单位定义：在55℃下每分钟分解pNPG释放1μmol pNP需的酶量被定义为一个酶活单位。

实施例5α-半乳糖苷酶AgalB的最适pH及pH稳定性

将纯化的重组α-半乳糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物pNPG用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制，55℃下进行α-半乳糖苷酶酶活力测定。结果(图2)表明，AgalB的最适pH为3.5，在2.2～5.0的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60％以上。α-半乳糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH3.5缓冲液体系中55℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明α-半乳糖苷酶在pH 2.2-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上，说明此酶具有较好的pH稳定性。

实施例6α-半乳糖苷酶AgalB最适温度及热稳定性。

α-半乳糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH3.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐热性测定为α-半乳糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在55℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为55℃。酶的热稳定性性试验结果表明(图5)，重组酶有较好的热稳定性。65℃下保温60min，剩余酶活性为55.1％。

实施例7不同化学试剂对α-半乳糖苷酶AgalB酶活性的影响。

在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度分别为1mmol/L和5mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。结果表明：低浓度的K⁺、Ca²⁺、Ni²⁺对酶活有略微的激活作用。Ag²⁺，Hg²⁺和SDS对AgalB有极强的抑制作用，其余金属离子在低浓度时对AgalB的酶促反应无显著影响。高浓度的Ni⁺，Zn²⁺，Cu²⁺对酶活有一定的激活作用。高浓度的Mn²⁺对酶活有一定的抑制作用，而高浓度的Hg²⁺和SDS对酶活有极强的抑制作用。高浓度的其它离子对AgalB酶活影响不大。(表2)。

表2各种化学试剂对α-半乳糖苷酶AgalB活力的影响

实施例8α-半乳糖苷酶AgalB的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶能力。

用pH2.0Gly-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。将纯化的α-半乳糖苷酶与蛋白酶按10∶1(w/w)比例在该蛋白酶缓冲液中处理120min后，不用的时间取样，按标准方法检测处理酶的剩余酶活。结果表明，α-半乳糖苷酶AgalB用胃蛋白酶处理120min后，剩余相对酶活力为80.1％，用胰蛋白酶处理120min后，剩余相对酶活力89.7％。说明α-半乳糖苷酶AgalB具有较好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力(图6)。

实施例9α-半乳糖苷酶AgalB的底物特异性。

AgalB能够作用多种不同的底物，对不同底物的比活如表3所示。对不同底物的水解能力pNPG＞瓜尔豆胶＞角豆胶＞棉籽糖＞蜜二糖＞水苏糖。

表3AgalB对不同底物的比活

底物              比活(U/mg)

pNPG              581

瓜尔豆胶          16.6

角豆胶            11.0

棉籽糖            4.0

蜜二糖            2.0

水苏糖            0.44

实施例10α-半乳糖苷酶AgalB和甘露聚糖酶共作用实验。

在1mlL 0.5％的瓜尔豆胶底物中以4*10^-5U的量加入第一种酶，分别在37和55作用5h或12h后，灭活第一种酶，再以相同的量加入第二种酶，继续作用5h后，加入1.5mlDNS并煮沸5min，然后在540nm下测定生成的还原糖含量。结果表明，不论同时加入还是顺序加入，AgalB对底物支链的先降解作用均能有效地促进甘露聚糖酶对主链的降解。

表4AgalB和甘露聚糖酶共作用

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和应用

<160>6

<210>1

<211>426

<212>PRT

<213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>1

MAILFACFAT LVGHSIALNN GVGKVPPMGY DTFNAYGCDY NASSVLAQGE

AMKRTGLVDA 60

GYNIFILDDC YALKERNATG YMVADPKKFP NGIPALSKQM NDLGISLAAY

GDNGYYTCAG 120

YPGSYGHEMK DLETWHSWGM SYLKYDNCYI PADNITQENM FGRYTRMSDA

IAAFAAKIHR 180

PPFIFYLCEW GWQQPWIWGR RISQGWRIDG DIKPYWSAIA SIIDQASFQY

WASDFYGRND 240

MDILEVGNTG QGTPPGNLTY EESKTHFTAW ALMKSPLIIG TDLTNATQET

IDILGNRDLI 300

KINQDPHVGE SISPFRWGVN PDYVSNPDHP AEYWSGNSSY GVVFMIINSQ

NTEQTMFFNL 360

TESWAIRAGR QYSVYDMWTH TYEGVAVWNL TFSLPPHGVR ALLLNDAGPQ

PANLDGTCAF 420

YYQCSV    426

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>2

MAILFACFATLVGHSIA                                    17

<210>3

<211>410

<212>PRT

<213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>3：

LNNGVGKVPP MGYDTFNAYG CDYNAS SVLA QGEAMKRTGL VDAGYNIFIL

DDCYALKERN 60

ATGYMVADPK KFPNGIPALS KQMNDLGISL AAYGDNGYYT CAGYPGSYGH

EMKDLETWHS 120

WGMSYLKYDN CYIPADNITQ ENMFGRYTRM SDAIAAFAAK IHRPPFIFYL

CEWGWQQPWI 180

WGRRISQGWR IDGDIKPYWS AIASIIDQAS FQYWASDFYG RNDMDILEVG

NTGQGTPPGN 240

LTYEESKTHF TAWALMKSPL IIGTDLTNAT QETIDILGNR DLIKINQDPH

VGESISPFRW 300

GVNPDYVSNP DHPAEYWSGN SSYGVVFMII NSQNTEQTMF FNLTESWAIR

AGRQYSVYDM 360

WTHTYEGVAV WNLTFSLPPH GVRALLLNDA GPQPANLDGT CAFYYQCSV 409

<210>4

<211>1462

<212>DNA

<213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>4：

ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACG CTTGTGGGCC ACTCGATCGC

CTTGAACAAT 60

GGCGTGGGCA AAGTCCCTCC AATGGGCTAC GACACATTCA ATGCGTACGG

TTGCGATTAC 120

AATGCTAGCA GTGTTCTCGC GCAAGGCGAG GCAATGAAAC GAACAGGCCT

AGTTGACGCC 180

GGTTATAACA TTTTCATTTT AGACGATTGT TATGCCTTGA AGGAGCGTAA

TGCTACCGGC 240

TACATGGTTG CTGATCCAAA GAAATTTCCG AATGGTATTC CGGCTCTATC

TAAGCAAATG 300

AATGATCTCG GAATTAGCCT TGCTGCGTAT GGTGACAATG GTTATTATAC

ATGCGCCGGC 360

TATCCAGGCT CTTATGGCCA TGAGATGAAG GACTTGGAGG TAGGGCGAAC

CCGTCGATTA 420

ACGGAACGGT GGCTGATTCC TTCGACAGAC CTGGCATTCT TGGGGCATGT

CTTACCTGAA 480

GTATGACAAC TGCTGTGAGT TCCAAGTCCC TAATCGATTC TGCTGCATCC

TCACATGGGA 540

ATCGTCAAGA TATACCGGCC GACAACATTA CTCAAGAGAA CATGTTCGGT

CGGTACACTC 600

GCATGTCGGA CGCAATCGCG GCCTTTGCGG CCAAGATTCA TCGACCGCCG

TTCATCTTCT 660

ACCTTTGCGA ATGGGGCTGG CAGCAACCTT GGATCTGGGG TCGCCGGATT

TCCCAAGGTT 720

GGCGTATTGA TGGTGACATC AAGCCATATT GGAGCGCGAT CGCCTCTATT

ATTGATCAGG 780

CGTCATTCCA GTACTGGGCT TCCGACTTCT ACGGACGCAA TGACATGGAC

ATCCTCGAGG 840

TTGGAAACAC CGGACAAGGC ACTCCGCCGG GGAACCTAAC GTACGAAGAA

TCTAAGACTC 900

ATTTCACAGC CTGGGCGTTG ATGAAAAGTC CACTGATCAT CGGCACTGAT

CTTACGAACG 960

CAACGCAGGA GACGATCGAC ATCCTCGGCA ACCGAGACTT GATCAAAATC

AATCAGGACC 1020

CTCATGTTGG TGAGTCGATT TCCCCTTTTC GATGGGGAGT TAATCCAGAC

TATGTCTCTA 1080

ATCCGGACCA TCCCGCCGAG TACTGGTCGG GCAACTCTAG CTACGGAGTA

GTGTTTATGA 1140

TTATTAATAG CCAAAACACC GAGCAAACCA TGTTCTTCAA TTTGACGGAG

AGTTGGGCTA 1200

TTCGAGCTGG CAGGCAGTAT TCCGTGTATG ACATGTGGAC ACATACGTAT

GAAGGGGTGG 1260

CAGTCTGGTA AGTCGACTGA TCACACAGCT TCTGAGTCTG AATACGATAT

CGGAGAGGGT 1320

GACATTGATG CCGTGATCGC TCAGGAACCT AACATTCTCG CTGCCTCCAC

ACGGCGTCCG 1380

CGCACTCTTA CTGAACGACG CGGGTCCACA ACCTGCAAAT CTGGATGGCA

CATGCGCCTT 1440

CTACTATCAA TGTTCGGTAT GA                          1462

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>5：

ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACG CTTGTGGGCC ACTCGATCGC C

51

<210>6

<211>1281

<212>DNA

<213>真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>6：

ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACG CTTGTGGGCC ACTCGATCGC

CTTGAACAAT 60

GGCGTGGGCA AAGTCCCTCC AATGGGCTAC GACACATTCA ATGCGTACGG

TTGCGATTAC 120

AATGCTAGCA GTGTTCTCGC GCAAGGCGAG GCAATGAAAC GAACAGGCCT

AGTTGACGCC 180

GGTTATAACA TTTTCATTTT AGACGATTGT TATGCCTTGA AGGAGCGTAA

TGCTACCGGC 240

TACATGGTTG CTGATCCAAA GAAATTTCCG AATGGTATTC CGGCTCTATC

TAAGCAAATG 300

AATGATCTCG GAATTAGCCT TGCTGCGTAT GGTGACAATG GTTATTATAC

ATGCGCCGGC 360

TATCCAGGCT CTTATGGCCA TGAGATGAAG GACTTGGAGA CCTGGCATTC

TTGGGGCATG 420

TCTTACCTGA AGTATGACAA CTGCTATATA CCGGCCGACA ACATTACTCA

AGAGAACATG 480

TTCGGTCGGT ACACTCGCAT GTCGGACGCA ATCGCGGCCT TTGCGGCCAA

GATTCATCGA 540

CCGCCGTTCA TCTTCTACCT TTGCGAATGG GGCTGGCAGC AACCTTGGAT

CTGGGGTCGC 600

CGGATTTCCC AAGGTTGGCG TATTGATGGT GACATCAAGC CATATTGGAG

CGCGATCGCC 660

TCTATTATTG ATCAGGCGTC ATTCCAGTAC TGGGCTTCCG ACTTCTACGG

ACGCAATGAC 720

ATGGACATCC TCGAGGTTGG AAACACCGGA CAAGGCACTC CGCCGGGGAA

CCTAACGTAC 780

GAAGAATCTA AGACTCATTT CACAGCCTGG GCGTTGATGA AAAGTCCACT

GATCATCGGC 840

ACTGATCTTA CGAACGCAAC GCAGGAGACG ATCGACATCC TCGGCAACCG

AGACTTGATC 900

AAAATCAATC AGGACCCTCA TGTTGGTGAG TCGATTTCCC CTTTTCGATG

GGGAGTTAAT 960

CCAGACTATG TCTCTAATCC GGACCATCCC GCCGAGTACT GGTCGGGCAA

CTCTAGCTAC 1020

GGAGTAGTGT TTATGATTAT TAATAGCCAA AACACCGAGC AAACCATGTT

CTTCAATTTG 1080

ACGGAGAGTT GGGCTATTCG AGCTGGCAGG CAGTATTCCG TGTATGACAT

GTGGACACAT 1140

ACGTATGAAG GGGTGGCAGT CTGGAACCTA ACATTCTCGC TGCCTCCACA

CGGCGTCCGC 1200

GCACTCTTAC TGAACGACGC GGGTCCACAA CCTGCAAATC TGGATGGCAC

ATGCGCCTTC 1260

TACTATCAAT GTTCGGTATG A 1281

Claims (10)

1.一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的α-半乳糖苷酶AgalB，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶AgalB的信号肽序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种嗜酸α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，编码权利要求1或3所述的α-半乳糖苷酶。

5.如权利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO.4所示。

6.如权利要求5所述的α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶基因编码信号肽的核苷酸如SEQ ID NO.5所示。

7.如权利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO.6所示。

8.包含权利要求4所述α-半乳糖苷酶基因的重组载体。

9.包含权利要求4所述α-半乳糖苷酶基因的重组菌株。

10.权利要求1或3所述的嗜酸α-半乳糖苷酶用于降解半乳甘露聚糖的应用。 

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