CN100410380C

CN100410380C - 一种β-甘露糖酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN100410380C
Application number: CNB2005100853772A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 李雅楠; 王亚茹; 史秀云; 李江; 柏映国
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Wuhan Sunhy Biology Co., Ltd.
Priority date: 2005-07-26
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2008-08-13
Anticipated expiration: 2025-07-26
Also published as: CN1904052A

Abstract

本发明涉及一种β-甘露糖酶MANB48及其编码基因和应用。以环状芽孢杆菌的基因组DNA为模板，通过反向PCR克隆得到β-甘露糖酶基因。该基因全长2079bp，编码一个含有372个氨基酸的成熟β-甘露糖酶，以及一个含有31个氨基酸的信号肽。本发明的β-甘露聚糖酶具有较好的耐热性和抗胰蛋白酶能力，可作为一种饲料添加剂应用于饲料业。

Description

一种β-甘露糖酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种β-甘露糖酶MANB48，及其编码基因和应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶(β-mannanase endo-1，4-β-D-mannanmannohydr-oase EC3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，存在于微生物，动植物中。植物半纤维素的数量仅次于纤维素，甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以1，4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。在β-甘露聚糖外切酶和甘露糖苷内切酶的作用下，甘露聚糖可被分解为甘露糖。

在许多微生物、植物(瓜儿豆等豆类植物的种子，西红柿的种子和果实)和一些低等动物(蓝贻贝Mytilus deulis，海洋软体动物Littorinabrevicula)中都存在β-甘露聚糖酶(Millward-Sadler，et al Microbiol.Lett.141，183-188)。微生物则是产β-甘露聚糖酶的重要来源，已报道的有芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌等。真菌中有曲霉、链霉菌、里氏木酶等。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点，已在实际生产和基础研究中得到应用(McCleary，B.V.Carbohydr.Res.119，191-219.)。

豆粕、棉粕、菜粕是最常用的植物蛋白原料，但豆粕中含有22.7％左右的半纤维素(Coon CN，et al.Poult Sci.1990 May；69(5)：774-80)。而这些非淀粉多糖是不能被单胃动物消化，因此单胃家禽(包括猪和鸡)对豆粕的能量利用率很低，仅有50-60％。β-甘露聚糖在豆粕中的含量比其它的常用饲料都高，作为一种抗营养因子β-甘露聚糖在动物的消化道内形成凝胶状，使消化道内容物具有较强的粘性，从而影响动物的营养吸收。在饲料中添加β-甘露糖酶则可提高猪和肉鸡对饲料的消化吸收能力，提高日增重量(S.W.Kim，et al.J.Anim.Sci.2003.81：2496-2504.)。

甘露聚糖酶降解甘露聚糖产生的甘露寡糖具有一定的免疫原性，可刺激机体产生免疫应答，并能与一定的毒素、病毒和真菌细胞表面结合，增加这些抗原的效价，进而增强动物体的细胞和体液免疫反应(Kim S.J Anim Sci 2000 13(8))。甘露寡糖还可调控动物胃肠道微生态环境，促进有益菌的生长和繁殖，抑制有害菌对动物肠道壁的粘附和定植，维持正常的消化道环境(王兰芳中国饲料2001(6)21-21)。

利用β-甘露聚糖酶水解含有丰富甘露聚糖的植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶、魔芋粉和田菁胶等)，生成由不同单糖分子(2-10个)组成的甘露低聚糖。大量研究表明：甘露低聚糖是一种双歧因子，能显著的促进人体和动物肠道内双歧杆菌(Bifidobacterium)为代表的有益菌的增殖，减少肠道的病原菌，提高肠粘膜的完整性，调节人的免疫反应。甘露低聚糖还可降低人体胆固醇、减轻便秘、降低血糖(Gilbert M，et al.Appl Microbiol Biotechnol.1993 Dec；40(4)：508-14)。

这些研究结果表明，甘露聚糖酶可广泛的应用于饲料行业。本研究得到了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有较好的耐热性和抗胰蛋白酶能力，可作为一种饲料添加剂应用于饲料业。

发明内容

本发明人基于对上述问题的研究提出并完成本发明。

本发明的目的之一是提供一种新的β-甘露糖酶基因manB48。

本发明的另一目的是提供一种新的β-甘露糖酶MANB48。

本发明的另一目的是提供包括上述β-甘露糖酶基因manB48的重组质粒。

本发明的另一目的是提供经上述重组质粒转化寄主细胞而获得的转化体。

本发明的再一目的是提供制备重组β-甘露糖酶MANB48的方法。

本发明的再一目的是提供上述β-甘露糖酶MANB48在饲料工业中的应用。

根据本发明的一个技术方案，本发明的β-甘露糖酶基因manB48具有SEQ ID NO.1(如图2)所示的核苷酸序列，其长度为2079bp，其结构基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(如图2中的阴影部分所示)。

根据本发明的另一技术方案，本发明的β-甘露糖酶MANB48具有SEQ ID NO.3(如图3)所示的氨基酸序列，本发明的β-甘露糖酶基因manB48编码一个含有327个氨基酸的成熟甘露聚糖酶，其具有SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列；以及一个含有31个氨基酸的信号肽，其具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，编码该信号肽的基因具有SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。

根据本发明的另一技术方案，本发明提供了含有上述β-甘露糖酶基因manB48的重组质粒。对于本领域技术人员，根据公知的基因工程理论和技术，可以使用适当的限制性内切酶，经过一系列的酶切、连接、转化和筛选的过程将本发明的β-甘露糖酶基因manB48与本领域常规使用的、市售可得的或者本实验室经过改造而获得的质粒重组，从而获得含有该基因的重组质粒。具体地，本发明提供了一种含有β-甘露糖酶基因manB48的重组质粒pET-22b(+)-manB48。

根据本发明的另一技术方案，可以将得到的上述重组质粒转化寄主细胞，从而获得含有β-甘露糖酶基因manB48的转化体。对于本领域普通技术人员，结合遗传工程和基因工程等的常规技术，可以根据需要，将上述重组质粒转化到各种常规使用的、市售可得的、和本实验室筛选而得的转化体系中，然后经常规使用的筛选技术，而得到含有β-甘露糖酶基因manB48的转化体，并进一步应用于科学研究和工业生产中。具体地，本发明使用大肠杆菌BL21作为受体细胞，得到重组大肠杆菌菌株BL21MAN48。

根据本发明的另一技术方案，本发明提供了一种制备重组β-甘露糖酶的方法，该方法包括培养上述含有β-甘露糖酶基因manB48的转化体、然后分离纯化从而获得重组β-甘露糖酶的步骤。

根据本发明的再一技术方案，根据本发明的β-甘露糖酶MANB48可以应用于饲料工业。

本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的β-甘露聚糖酶具有较好的耐热性和抗胰蛋白酶能力，可作为一种饲料添加剂应用于饲料业。该酶还可应用于纸浆工业，即提高纸浆溶解的效率，又减少了大量使用碱液带来的环境污染。此外，该酶作用含有丰富甘露聚糖的植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶、魔芋粉和田菁胶等)可生成甘露寡糖，甘露寡糖作为一种双歧因子，能显著的促进人体和动物肠道内双歧杆菌(Bifidobacterium)为代表的有益菌的增殖，调节人的免疫反应。甘露寡还可降低人体胆固醇、减轻便秘、降低血糖。因此该酶在保健品和食品工业中也有很大的作用。

附图说明

图1为β-甘露聚糖酶基因manB48的核酸电泳，1、DNA标准分子量；2、β-甘露聚糖酶基因manB48的PCR产物

图2为β-甘露聚糖酶基因manB48的核苷酸序列，阴影部分为β-甘露聚糖酶基因manB48的结构基因。

图3为β-甘露聚糖酶MANB48的氨基酸序列。

图4为大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶MANB48的蛋白电泳图，1.蛋白标准分子量；2.含质粒pET-22b(+)的E.coli对照；3.含重组质粒pET-22b(+)-manB48的E.coli。

图5为β-甘露聚糖酶ManB48纯化的蛋白电泳图，

1.蛋白标准分子量；2培养液上清；3离子交换层析后的样品；4经分子筛后的样品。

图6说明β-甘露聚糖酶MANB48的最适pH和pH稳定性。

图7说明β-甘露聚糖酶MANB48的最适温度和热稳定性。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株及载体：环状芽孢杆菌(Bacillus circulansB48)于2005年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，100080)，保藏编号为CGMCC No.1416，大肠杆菌表达载体PET22b(+)为购自TAKARA公司。

2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自Takara公司，连接酶购自Invitrgon公司，角豆胶及甘露糖均购自Sigma公司，其它都为国产市售可得的试剂。

3、培养基：环型芽孢杆菌培养基为营养肉汁培养基(1％蛋白胨、O.3％牛肉提取物、O.5％NaCl，pH7.0)；

诱导产酶培养基(2％魔芋粉、2％酵母提取物、0.3％NH4Cl、0.03％KH2PO4、0.3％CaCl2、0.06％MgCl26H2O、0.35％Na2CO3，pH7.0)；

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、O.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

实施例1环型芽孢杆菌β-甘露聚糖酶编码基因manB48的克隆

提取环型芽孢杆菌(Bacillus circulans)B48基因组DNA：取30℃培养1天后的Bacillus circulansB48菌液10000rpm离心10min。取50mg菌泥加500μL无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重悬于500μL溶菌酶混合液，于37℃温育30min，再补加酶液100μL于40-50℃继续保温30min，至菌液透明后，加10％SDS至终浓度2％，搅拌约5min至菌液粘度显著下降，15000rpm离心10min去碎片。上清用等体积酚、酚

氯仿、氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。16000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30μL无菌水溶解，备用。

根据已发表的甘露聚糖酶基因序列设计合成了兼并引物P1，P2(

P1 5’AAGTHCATGAYGCYACRGG 3’

P2 5’CCWGCATAYTCRTACATATGG 3’

)。以环型芽孢杆菌B48总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，32个循环后72℃保温8min。得到一约300bp片段，将该片段回收后测序。

根据测序得到的核甘酸序列设计两队反向PCR引物P3，P4和P5，P6(

P3 5’cgggagccaataccgtacgagtcgtcttgt 3’

P4 5’cgttctggaggtgcatgatgcgacaggca 3’

P5 5’cggaaaagaagaccgcgtcatcgtcaatattgc 3’

P6 5’tggaaattggaacagcagcggatgggccg 3’

)。分别用限制性内切酶AccI和HindIII切Bacillus circulansB48基因组DNA，然后用T₄DNA连接酶使酶切片段自身环化，以此自身环化的DNA片段作为PCR反应的模板进行反向PCR扩增。扩增得到产物回收后测序。

通过反向PCR得到长2079bp的基因片段(图1)，编码一个含有327个氨基酸的成熟甘露聚糖酶，以及一个含有31个氨基酸的信号肽(图2)。所测出的基因manB48的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的甘露聚糖酶基因序列进行同源比较，最高同源性为62％，氨基酸序列最高同源性也为62％。证明为新基因。

实施例2含有β-甘露聚糖酶编码基因manB48的重组酶制备

将表达载体pET-22b(+)进行双酶切(NcoI+HindIII)，同时将Bacillus circulansB48的基因manB48双酶切(NcoI+HindIII)，切出编码成熟甘露聚糖酶的部分基因片段与表达载体pET-22b(+)连接，获得含有环型芽孢杆菌甘露聚糖酶基因manB48的重组质粒pET-22b(+)-manB48，并转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌菌株BL21MAN48。

取含有重组质粒的BL21菌株和含有pET-22b(+)空质粒的BL21菌株(作对照)，分别接种于5mL LB(加有100μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃快速振荡培养过夜。分别取100μL过夜培养液加入含100μg/mL氨苄青霉素的8mL LB培养液(1％接种量)中，快速振荡培养约3小时(OD₆₀₀达到0.6-0.8)，加入8μL 1mol/L的诱导剂IPTG(终浓度1mM/L)，使其表达目的蛋白，继续在37℃振荡培养3小时。

SDS-PAGE结果(图4)表明，manB48在大肠杆菌中得到了表达。取包含表达产物的菌体破碎液，稀释后进行酶活性的生物学测定，结果表明，在含空载体的菌株中检测不到甘露聚糖酶活性，在含有pET-22b-manB48的细胞破碎液及菌液离心的上清液中均能检测到甘露糖酶活性。说明重组大肠杆菌菌株BL21MAN48表达甘露聚糖酶活性。

实施例3β-甘露聚糖酶MANB48的纯化

将环型芽孢杆菌B48用诱导产酶培养基培养2天后，将培养液10000rpm离心30分钟去菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至30％饱和度，冰浴2小时，然后13000rpm离心20min，将上清继续用硫酸铵沉淀至80％，13000rpm离心20min，取沉淀，用柠檬酸-氢氧化钠缓冲液重新溶解，得到浓缩酶液，进一步用HPLC(

FPLC，Pharmacia公司)纯化。

经硫酸铵沉淀后上HiTrap_Q_Sepharose_XL(amersham pharmaciabiotech预装柱)阴离子柱。加样2mL，先用pH8.0，0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液洗脱平衡柱子，然后用相同缓冲液配制的0～0.6mol/L NaCl梯度洗脱10个柱床(约50mL)，流速为5mL/min，分部收集，每管1mL。然后对收集管中的溶液测酶活及蛋白电泳分析。

将经离子交换柱层析后的检测有酶活的收集样再经一次分子筛Sephacryl S-200(amersham pharmacia biotech预装柱)，加样0.5mL，用pH7.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，分部收集，每管1mL，得到电泳纯甘露聚糖酶MANB48(见图5)。

对纯化过程中的离子交换层析，凝胶层析各步分别进行了酶活性测定及蛋白浓度测定，结果见表1。纯化完成后，比活性从粗酶液的5.20U/mg提高到纯酶的927.84U/mg，纯化倍数为178倍，得率7％。SDS-PAGE结果(图5)表明，纯化后的甘露聚糖酶蛋白仅有一条单一的条带，分子量约为35kD。

表1：甘露聚糖酶MANB48纯化结果

注：蛋白浓度用考马斯亮兰G250法测定

实施例4β-甘露聚糖酶的活性分析

用国际通用的Somogyi-Nelson法：将0.4mL 0.3％(w/v)Locust beangum(Sigma公司)溶液(柠檬酸-氢氧化钠缓冲液配制)加入试管(实验和对照都用三个平行样)，放入50℃水浴中预热3min。再将0.1mL已经稀释好的酶液加入到试管中，继续在50℃水浴中反应10min，向试管中加入0.5mL Somogyi试剂(碱性铜试剂)终止反应，将试管在沸水中加热15min，立即用流动水冷却到室温，向试管中加入0.5mL Nelson试剂(砷钼酸盐试剂)显色，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，室温下放置10min，加入1mL蒸馏水，10000rpm离心5分钟，去除絮状物。500nm处测吸光值。对照为先将0.05mL酶液加入到0.2mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，在100℃沸水中煮20分钟灭活，再加入同体积的底物保温。甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成1μmol甘露糖所需的酶量为1个活性单位(IU)。

实施例5β-甘露聚糖酶MANB48的最适pH及pH稳定性

经纯化的甘露聚糖酶MANB48在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.2～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶MANB48在不同pH的缓冲体系，52℃下测定的pH适性结果(图6)表明：MANB48的最适pH为6.4，在pH4.6～9.0范围内，酶活性维持在50％以上，而在pH3.0以下，基本检测不到酶活性，但在pH10.0时仍保持酶活的25％。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于52℃下处理30min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图6)，在pH5.0～8.0之间保持最适pH下酶活的70％以上，在pH10.0时仍保持酶活的44％这说明此酶具有较好的耐碱性。

实施例6β-甘露聚糖酶MANB48酶反应最适温度及热稳定性

最适温度的测定在柠檬酸-氢氧化钠(pH6.4)缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为在不同温度下处理30min，再进行酶活测定。酶反应最适温度测定结果(图7)表明，MANB48最适温度为50℃。在20℃～60℃范围内，酶活性维持在55％以上。

酶的热稳定性试验表明(图7)，在60℃下保温60min，剩余酶活性为90％。70℃下保温30min，剩余酶活性为20％。80℃保温20min，剩余酶活性为18％，说明此酶具有较好的耐热性。

实施例7不同化学试剂对β-甘露聚糖酶MANB48酶活性的影响

在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度为1mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。结果表明，只有SDS，PMSF对MANB48有一定的抑制作用。其余化学试剂对MANB48的酶促反应无显著影响(表2)。

表2各种化学试剂对甘露聚糖酶MANB48活力的影响

实施例8β-甘露聚糖酶MANB48的底物特异性

将不同的底物用柠檬酸-氢氧化钠(pH6.4)缓冲液溶解浓度为0.3％。在酶反应最适温度和最适pH值下，测定甘露聚糖酶对不同底物的作用。结果表明，甘露聚糖酶MANB48对甲基纤维素，甘露糖没有活性。对瓜儿豆胶和可溶性淀粉有21％和26％的酶活性。角豆胶是甘露聚糖酶MANB48的最适底物。

表3甘露聚糖酶MANB48对不同底物的作用

实施例9β-甘露聚糖酶MANB48的抗胰蛋白酶能力

0.1mL甘露聚糖酶溶液，加入0.05mL 0.5mL胰蛋白酶(0.1mg/mL，用pH7.0、Tris-HCl缓冲液配制)，于37℃处理120min，稀释后再用常规方法测酶活性。甘露聚糖酶MANB48用胰蛋白酶分别处理后，剩余60％以上的酶活性。说明甘露聚糖酶MANB48具有较好的抗胰蛋白酶水解的能力。

序列表2

Application Project

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<110>applicant：中国农业科学院饲料研究所

<120>Title：一种β-甘露糖酶及其编码基因和应用

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<211>Length：2079

<212>Type：DNA

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<213>OrganismName：环状芽孢杆菌(Bacillus circulansB48)

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atttcttgaa caggcaatcc cgcctttggc tgcttgttca tcaatcttta aatcggcgtt 60

cacttggccg taaaacccgc cgttggtttc gtccttcaat cctccccaaa aaggcaggat 120

atgctccagc cattcttttc ggatttcaga acccagggta tgtaaagtca ttgtcatata 180

aagcctccgt tattaagtta tcgttaacct taaaaaatat tttaagaaag agtatcgttc 240

gatgtcaacg aaatctttta cacgcaacat tattataaac atatatacac cattgacagg 300

tgaaggtgag gcatataaaa ttcggattat tacttaaacg attacctaaa taatctacac 360

acttcggttt tgattcatca tctagtgtcg aggctagaaa tcaaatgata tgaatccaga 420

gggaggaaga tgatgttgat atggatgcag ggatggaagt ctattctagt cgcgatcttg 480

gcgtgtgtgt cagtaggcgg tgggcttcct agtccagaag cagccacagg attttatgta 540

aacggtacca agctgtatga ttcaacgggc aaggcctttg tgatgagggg tgtaaatcat 600

ccccacacct ggtacaagaa tgatctgaac gcggctattc cggctatcgc gcaaacggga 660

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tccgtcaaca gtatcatctc gctggtgtcg cagcatcaaa tgatagccgt tctggaggtg 780

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MET MET Leu Ile Trp MET Gln Gly Trp Lys Ser Ile Leu Val Ala Ile 16

Leu Ala Cys Val Ser Val Gly Gly Gly Leu Pro Ser Pro Glu Ala Ala 32

Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly Lys 48

Ala Phe Val MET Arg Gly Val Asn His Pro His Thr Trp Tyr Lys Asn 64

Asp Leu Asn Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Gln Thr Gly Ala Asn Thr 80

Val Arg Val Val Leu Ser Asn Gly Ser Gln Trp Thr Lys Asp Asp Leu 96

Asn Ser Val Asn Ser Ile Ile Ser Leu Val Ser Gln His Gln MET Ile 112

Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Glu Tyr Ala Ser 128

Leu Glu Ala Ala Val Asp Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Gly Ala Leu Ile 144

Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly 160

Asn Trp Asn Ser Ser Gly Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro 176

Lys Leu Arg Asn Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala Ala 192

Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Glu Gly Ala Ala Val 208

Phe Ala Ser Asp Gln Leu Lys Asn Thr Val Phe Ser Ile His MET Tyr 224

Glu Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Thr Asn MET Asp Asp 240

Val Leu Asn Lys Gly Leu Pro Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly Tyr 256

His Gln Gly Ala Asp Val Asp Glu Ile Ala Ile MET Lys Tyr Gly Gln 272

Gln Lys Glu Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Ser Pro 288

Glu Leu Asn Asp Leu Asp Leu Ala Ala Gly Pro Ser Gly Asn Leu Thr 304

Gly Trp Gly Asn Thr Val Val His Gly Thr Asp Gly Ile Gln Gln Thr 320

Ser Lys Lys Ala Gly Ile Tyr*** 327

<210>SEQ ID NO：4

<211>Length：296

<212>Type：PRT

Sequence

--------

<213>OrganismName：环状芽孢杆菌(Bacillus circulansB48)

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Ala Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Tyr Asp Ser Thr Gly 16

Lys Ala Phe Val MET Arg Gly Val Asn His Pro His Thr Trp Tyr Lys 32

Asn Asp Leu Asn Ala Ala Ile Pro Ala Ile Ala Gln Thr Gly Ala Asn 48

Thr Val Arg Val Val Leu Ser Asn Gly Ser Gln Trp Thr Lys Asp Asp 64

Leu Asn Ser Val Asn Ser Ile Ile Ser Leu Val Ser Gln His Gln MET 80

Ile Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Lys Asp Glu Tyr Ala 96

Ser Leu Glu Ala Ala Val Asp Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Gly Ala Leu 112

Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Ile Val Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr 128

Gly Asn Trp Asn Ser Ser Gly Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala Ile 144

Pro Lys Leu Arg Asn Ala Gly Ile Lys Asn Thr Leu Ile Val Asp Ala 160

Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Gln Ser Ile Val Asp Glu Gly Ala Ala 176

Val Phe Ala Ser Asp Gln Leu Lys Asn Thr Val Phe Ser Ile His MET 192

Tyr Glu Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ala Thr Val Lys Thr Asn MET Asp 208

Asp Val Leu Asn Lys Gly Leu Pro Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly Gly 224

Tyr His Gln Gly Ala Asp Val Asp Glu Ile Ala Ile MET Lys Tyr Gly 240

Gln Gln Lys Glu Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Ser 256

Pro Glu Leu Asn Asp Leu Asp Leu Ala Ala Gly Pro Ser Gly Asn Leu 272

Thr Gly Trp Gly Asn Thr Val Val His Gly Thr Asp Gly Ile Gln Gln 288

Thr Ser Lys Lys Ala Gly Ile Tyr*** 296

<210>SEQ ID NO：5

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<212>Type：PRT

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<213>OrganismName：环状芽孢杆菌(Bacillus circulansB48)

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MET MET Leu Ile Trp MET Gln Gly Trp Lys Ser Ile Leu Val Ala Ile 16

Leu Ala Cys Val Ser Val Gly Gly Gly Leu Pro Ser Pro Glu Ala 31

210>SEQ ID NO：6

<211>Length：93

<212>Type：DNA

Sequence

--------

<213>OrganismName：环状芽孢杆菌(Bacillus circulansB48)

<400>PreSequenceString：SEQ ID NO：6

atgatgttga tatggatgca gggatggaag tctattctag tcgcgatctt ggcgtgtgtg 60

tcagtaggcg gtgggcttcc tagtccagaa gca 93

Claims

1. 一种β-甘露糖酶基因manB48，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 如权利要求1所述的β-甘露糖酶基因manB48，其特征在于，所述β-甘露糖酶基因manB48的结构基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 含有权利要求1所述的β-甘露糖酶基因manB48的重组质粒。

4. 含有权利要求1所述的β-甘露糖酶基因manB48的重组质粒pET-22b(+)-manB48。

5. 通过将权利要求3所述的重组质粒转化寄主细胞而获得的转化体。

6. 如权利要求5所述的转化体，其特征在于寄主细胞为大肠杆菌。

7. 一种β-甘露糖酶MANB48，其特征在于，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8. 如权利要求7所述的β-甘露糖酶MANB48，其特征在于成熟的β-甘露糖酶MANB48的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

9. 如权利要求7所述的β-甘露糖酶MANB48，其特征在于该酶的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

10. 一种编码β-甘露糖酶MANB48的信号肽的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

11. 一种制备重组β-甘露糖酶的方法，其特征在于包括培养权利要求5所述的转化体、然后分离纯化从而获得重组β-甘露糖酶的步骤。

12. 如权利要求7所述的β-甘露糖酶MANB48在饲料工业中的应用。