CN102363762B

CN102363762B - 转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌及制品和应用

Info

Publication number: CN102363762B
Application number: CN201110283387.2A
Authority: CN
Inventors: 赵振升; 丁轲; 钟社普; 王国永; 余祖华; 白东英; 周变华; 孔涛
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2011-12-05
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2031-12-05
Also published as: CN102363762A

Abstract

本发明介绍了一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌及其制品及应用，将a-淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体pIlac的多克隆位点，再将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中；α－淀粉酶基因为GU591658的淀粉液化芽孢杆菌，所用于扩增的序列是1-1545bp碱基；信号肽基因为Z14250的短小乳酸杆菌L.brevis1.2028，所用于扩增的序列是260-349bp碱基。该重组乳酸杆菌可以应用于饲料中富含淀粉的动物生产中，尤其是对初生仔猪和雏鸡，对于提高生长速度、降低料肉比、增加经济效益等具有重要的意义。

Description

转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌及制品和应用

技术领域

本发明涉及一种基因重组技术，特别是一种转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌及制品和应用。

背景技术

众所周知，动物的生长是依赖于营养丰富的饲料，而动物的生长速度的快慢是取决于动物对饲料的消化利用率，而饲料的消化利用率又取决于其消化道内的消化酶的多少，因为饲料中的营养物质大多都是以高分子形式存在的，所以必须有相应的酶将其降解后方能被肠道吸收利用，因此肠道消化酶的多少对于动物的生长、料肉比和经济效益至关重要。目前，很多消化酶如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等已被开发，在饲料中也有广泛的应用。而在饲料成分中，淀粉是其中最主要的营养物质之一，所以淀粉在肠道中的分解率在很大程度上影响着动物的生长速度。因此研究淀粉酶以适当的形式应用于动物生产具有重要的实践意义。

淀粉酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶及葡糖淀粉酶的总称，由于淀粉酶在工业、农业和畜牧业上应用广泛，因此，在酶家族中它是非常重要的一种酶。淀粉酶的来源很广泛，可以来自于植物、动物以及微生物。大部分的α-淀粉酶存在于微生物中，α-淀粉酶是胞外酶，可以随机的切断线状直链淀粉链中连接相邻的两个葡萄糖单位的1，4-α-糖苷键。β-淀粉酶主要来源于植物，但也有少部分微生物产生，它是在外面起作用的酶，可以分解直链淀粉、支链淀粉以及糖原分子的非还原性末端链，它可以水解交替的糖苷键，产生麦芽糖。葡糖淀粉酶可以水解单个的葡萄糖。α-淀粉酶已经从多种细菌、真菌和酵母中分离获得。由于细菌淀粉酶具有多种优良的特性，因此，细菌淀粉酶应用比较多，其中曲霉和杆菌，特别是淀粉液化芽孢杆菌已用于工业化生产。

在动物养殖业中，从某种程度上，淀粉酶主要被用作消化助剂，补充面粉的糖化活性，改善一些动物饲料的可消化性。淀粉酶存在于单胃动物的消化道内，由动物的消化道自身分泌。但是幼禽幼畜消化机能尚未发育健全，淀粉酶分泌量往往不足，而且动物年老时消化酶分泌能力降低，另外动物在受到应激或疾病感染后引起消化酶分泌紊乱(McTigue MA et al. The alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp. IMD 370. Enzyme and Microbial Technology, 1995, 20 (17): 45～47)。由于消化酶的分泌不足，大量的饲粮无法被顺利的消化吸收，较多的饲粮进入后肠发生腐败分解，引起大肠杆菌等有害菌群增殖，产生多量的胺类毒性物质，对肠壁组织造成损伤，使肠道蠕动加快和分泌增加，造成腹泻。在这些情况下，在其日粮中添加外源淀粉酶，不但能补充体内内源酶的不足，而且能激活内源酶的分泌，增强动物对饲料养分的消化吸收能力，明显提高饲料利用率，同时无毒、无副作用、无残留(Yasuji Minoa et al. Developments in the use of Bacillus species　for Industrial production. Canadian Journal of Microbiology, 2004, 23(2): 1-17)。20世纪90年代初，我国开始淀粉酶制剂的研究与应用，在短短十几年的时间里，淀粉酶已被逐步应用到畜、禽、水产动物等各个养殖领域，具有显著增强消化功能、提高饲料利用率、促进生长、提高动物的生产性能等功效(刘庆华等，添加淀粉酶与复合酶对蛋种鸡生产性能及养分利用率的影响.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，8：23-25)。

但是自然分离的菌株往往α-淀粉酶酶活不是很高，很难直接用于工业化生产或作为添加剂使用，所以一般要对野生型菌株进行改造，如通过诱变育种、构建基因工程菌和基因突变，使α-淀粉酶能够在特定的宿主菌中表达，而且产酶量也大大提高。随着分子生物学和基因工程技术的不断完善，通过基因工程技术改造菌株已成为一种广泛应用的手段。目前，世界上一些大的酶制剂公司生产酶制剂的菌种50％是基因工程菌。最大的酶制剂生产商丹麦诺维信公司，生产酶制剂的菌种80％是基因工程菌。在国内，很多企业还处于传统诱变菌种生产酶制剂的落后状态。Richardson等利用高通量筛选方法从构建的a-淀粉酶基因文库中筛选到3株耐酸(低pH值4．5)耐高温(105℃)的不依赖Ca²⁺高性能菌株，又利用基因重组技术、鉴定与优化评价构建了一个稳定、高产、耐酸、耐高温的重组酶蛋白。刘逸寒等(刘逸寒等.耐酸性高温a-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究.食品与发酵工业，2007，33(2):36-41)将去信号肽的耐酸性高温a-淀粉酶突变基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a上并实现高效表达，表达量达到141 mg／L，重组酶比活达到354．6U／mg蛋白。王磊等(王磊等.耐高温a-淀粉酶基因在枯草杆菌染色体上的整合、扩增及表达的研究.工业微生物，1998，28(1):7-12)进行了耐高温a-淀粉酶基因在枯草杆菌染色体上的整合、扩增及表达的研究。通过构建一套整合载体，将来自嗜热脂肪芽胞杆菌的耐高温a-淀粉酶基因以及质粒pC194上的一段Cm抗性基因随机整合至枯草杆菌1A289染色体上，通过提高整合菌的抗氯霉素能力和反复进行整合，提高耐高温a-淀粉酶基因在染色体上的拷贝数，最终a-淀粉酶基因在染色体上的拷贝数由整合初的1个增至7个以上，在无选择压力情况下，产酶220U／mL。

乳酸杆菌是近年发展起来的一种最具发展潜力的细菌表达系统，因为乳酸杆菌具有太多的优点：(1)乳酸杆菌在人类已经有上千年的应用历史，是唯一一个没有致病性的菌种，是一种公认的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。(2)乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源目的基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；(3)若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的食品提供了可能(María J G et al. Integrative food-grade expression system based on the lactose regulon of lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(11): 4822~4828)；(4)它在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统作为口服益生菌，较其它菌株更易达到较高的表达量(Scheppler L, Vogel M, Zuercher A W, et al. Recombinant Lactobacillus johnsonii as a mucosal vaccine delivery vehicle. Vaccine. 2002 20(23-24):2913-2920)；(5)乳酸杆菌不具有内在免疫原性；(6)乳酸杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的蛋白。因此乳酸杆菌表达系统近年来得到了较快的发展，如使乳酸杆菌携带赖氨酸、蛋氨酸等基因，通过直接饲喂乳酸杆菌可减少向饲料中添加相应的物质，从而可降低饲料成本。Hashiba等(Hashiba H et al. Establishment of a host-vector system in Lactobacillus helveticus with β-galactosedase activity as a selection marker. Biosci Biotechnol Biochem, 1992,50:190~194)将Bacillus.Licheniformis的α-淀粉酶结构基因插入pBG10的红霉素抗性基因启动子区下游，在L.helveticus SBT2195中获得成功表达。Pouwels等(Kanatani K et al. Isolation and characterization of acidocin A and cloning of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol, 1995, 61:1061~1067)也成功地构建了携带乳酸杆菌L-1dh基因强启动子和Lactoamylovorus淀粉酶基因的调节启动子的表达和分泌载体。另外如胰岛素酶、蛋白酶、葡聚糖酶、脂酶和细菌素等外源基因都已在乳酸杆菌中得到了表达。另外一个重要的用途就是作为抗原呈递载体，从而实现疫苗的口服免疫。Zegers等(Zegers N D et al. Expression of the protective antigen of bacillus antracis by Lactobacillus Casei: towards the development of an oral vaccine against anthrax. J Appl Microbiol, 1999,87:309~314)和Maassen等(Maassen C B M et al. Instruments for oral disease-intervention strategies: recombinant Lactobacillus Casei expressing tetanus toxin fragment C for vaccination or myelin proteins for oral tolerance induction in multiple sclerosis. Vaccine, 1999,17(25): 2117~2128)利用乳酸杆菌作为疫苗载体，携带表达外源抗原，通过粘膜免疫动物，可诱发抗感染免疫。Pouwels等(Pouwels P H et al. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. Int J food Microbiol, 1998,41(2):155~167)则构建了乳杆菌的一系列表达载体，用于表达破伤风毒素C片段、幽门螺杆菌脲酶A和B亚单位等抗原。他还用pLPCR2载体表达两个并列重复口蹄疫病毒和大肠杆菌β-半糖苷酶基因的融合蛋白，在干酪乳杆菌中融合蛋白的表达大约为细胞总蛋白的0.1%。实验发现，外源抗原基因表达于细胞内或细胞表面，均能诱发针对该抗原的全身和局部粘膜免疫反应；通过口服、鼻粘膜或腹腔注射等途径接种，也均可引起有效的免疫应答。更有意义的是，法国和巴西已于2000年联手开展在乳酸杆菌中表达rotavirus的抗原基因，然后用重组的乳酸杆菌发酵生产酸奶，来预防儿童轮状病毒性腹泻。近年来国内也相继开展了这方面的工作，何召庆等(何召庆，秦泽荣，徐镔蕊，等.降钙素基因在乳酸杆菌中的克隆.中国兽药杂志，2002，36(6)：20-22)将鲑降钙素基因克隆并表达在乳酸杆菌质粒pW425t中，然后转化到ThyA基因缺陷的乳酸杆菌中表达。王春凤等(王春凤等.柔嫩艾美尔球虫SO7基因在乳酸杆菌中的表达.自然科学进展.王春凤等. 饲喂转球虫基因功能乳酸杆菌后对雏鸡体重的影响. 畜牧兽医学报，2002，33(6)：591-593)在质粒pW425t中成功地表达了鸡球虫SO7基因，将该重组的乳酸杆菌给刚出壳的雏鸡饲喂，一周后攻球虫卵囊5×105个/只，通过测定试验雏鸡的体重未发生变化，表明了基因工程乳酸杆菌的有效性。这些结果都证明重组乳酸杆菌是一种良好的口服载体，无论是让其携带促生长的酶蛋白还是抗原蛋白都能在体内显示其具有诱人的应用前景。

本发明是利用PCR技术从淀粉液化芽孢杆菌基因组中扩增出淀粉酶amy基因和从短小乳杆菌基因组中扩增出信号肽sp基因，构建了含有sp基因和amy基因的重组表达质粒pIlac-sp-amy，通过电转化整合到了乳酸杆菌的基因组上，并实现了稳定表达，从而获得了能够分泌表达淀粉酶的重组乳酸杆菌。该重组乳酸杆菌可以应用于饲料中富含淀粉的动物生产中，尤其是对初生仔猪和雏鸡，对于提高生长速度、降低料肉比、增加经济效益等具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，以及该重组乳酸杆菌的制品及应用。通过提供一种能够分泌表达淀粉酶的基因工程乳酸杆菌，巧妙设计将乳酸杆菌的信号肽基因与芽孢杆菌的淀粉酶基因重组到乳酸杆菌的表达载体上，再电转化整合到乳酸杆菌，研制成能特异表达淀粉酶的重组乳酸杆菌，作为益生菌活菌饲料添加剂用于动物的生产。

为了实现解决上述技术问题的目的，本发明采用了如下技术方案：

一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其特征是：该转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌是将a-淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体pIlac的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中获得的产品；所述的α－淀粉酶基因来源于GenBank上的登陆号为GU591658的淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens，ATCC 23842)，所用于扩增的序列是1-1545bp位碱基；信号肽基因来源于在GenBank上的登陆号为Z14250的短小乳酸杆菌L.brevis1.2028，所用于扩增的序列是260-349bp位的碱基。

本发明的一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，所述的α－淀粉酶的DNA序列，其包含如下序列或经修饰的序列，所述修饰不改变所编码的氨基酸序列：

ATGATTCAAA AACGAAAGCG GACAGTTTCG TTCAGACTTG TGCTTATGTG CACGCTCTTA 60

TTTGTCAGTT TGCCGATTAC AAAAACATCA GCTGTAAATG GCACGCTGAT GCAGTATTTT 120

GAATGGTATA CGCCGAACGG CGGCCAGCAT TGGAAACGAT TGCAGAATGA TGCGGAACAT 180

TTATCGGATA TCGGAGTCAC TGCCGTCTGG ATTCCTCCCG CATACCAAGG ATTGAGCCAA 240

TCCGATCACG GATACGGACC TTATGATTTG TATGATTTAG GAGAATTCCA GCAAAAAGGG 300

ACGGTCAGAA CGAAATACGG CACAAAATCA GACCTTCAAG ATGCGATCGG CTCACTGCAT 360

TCCCGGAACG TCCAAGTATA CGGAGATGTG GTTTTGAATC ATAAGGCTGG TGCTGATGCA 420

GCAGAAGATG TAACTGCCGT CGAAGTCAAT CCGGCCAATA GAAATCAGGA AACTTCGGAG 480

GAATATCAAA TCAAAGCGTG GACGGATTTT CGTTTTCCGC GCCGTGGAAA CACGTACAGT 540

GATTTTAAAT GGCATTGGTA TCATTTCGAC GGAGCGGACT GGGATGAATC CCGGAAGATC 600

AGCCGCATCT TTAAGTTTCG TGGGGAAGGA AAAGCGTGGG ATTGGGAAGT ATCAAGTGAA 660

AACGGCAACT ATGACTATTT AATGTATGCT GATGTTGACT ACGACCACCC TGATGTCGTG 720

GTAGAGACAA AAAAATGGGG TATCTGGTAT GCGAATGAAC TGTCATTAGA CGGCTTCCGT 780

ATTGATGCCG CCAAACATAT TAAATTTTCA TTTCTGCGTG ATTGGGTTCA GGCGGTCAGA 840

CAGGCGACGG GAAAAGAAAT GTTTACGGTT GCGGAGTATT GGCAGAATAA TGCCGGGAAA 900

CTCGAAAACT ACTTGAATAA AACAAGCTTT AATCAATCCG TGTTTGGTGT TCCGCTTCAT 960

TTCAATTTAC AGGCGGCTTC CTCACAAGGA GGCGGATATG ATATGAGGCG TTTGCTGGAC 1020

GGTACCGTTG TGTCCAGGCA TCCGGAAAAG GCGGTTACAT TTGTTGAAAA TCATGACACA 1080

CAGCCGGGAC AGTCATTGGA ATCGACAGTC CAAACTTGGT TTAAACCGCT TGCATACGCC 1140

TTTATTTTGA CAAGAGAATC CGGTTATCCT CAGGTGTTCT ATGGGGATAT GTACGGGACA 1200

AAGGGGACAT CGCCAAAGGA AATTCCCTCA CTGAAAGATA ATATAGAGCC GATTTTAAAA 1260

GCGCGTAAGG AGTACGCATA CGGGCCCCAG CACGATTATA TTGAGCACCC GGATGTGATC 1320

GGATGGACGA GGGAAGGTGA CAGCTCCGCC GCCAAATCAG GTTTGGCCGC TTTAATCACG 1380

GACGGACCCG GCGGATCAAA GCGGATGTAT GCAGGCCTGA AAAATGCCGG CGAGACATGG 1440

TATGACATAA CGGGCAACCG TTCAGATACT GTAAAAATCG GATCTGACGG CTGGGGAGAC 1500

TTTCATGTAA ACGATGGGTC CGTCTCCATT TATGTTCAGA AATAA 1545

乳酸杆菌(Lactobacillus brevis 1.2028)信号肽基因，序列如下：

ATGCAATCAA GTTTAAAGAA ATCTCTTTAC TTGGGCCTTG CCGCATTGAG CTTTGCTGGT 60

GTTGCTGCCG TTTCAACGAC TGCTTCAGCT 90

将α－淀粉酶基因和信号肽基因插入到乳酸杆菌的表达载体pIlac的NdeI和SmaI位点，然后将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276中，得到转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌。

进一步的，所述的重组乳酸杆菌含有表达质粒pIlac-sp-amy，重组表达质粒pIlac-sp -amy含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、乳酸杆菌信号肽基因(signal peptide,sp)、淀粉酶基因(amylase, amy)、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery(erythromycin, Ery)基因，其表达式为：-ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-。

利用本专利所述的转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，可以制备含上述转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌菌种发酵形成的液态、固态产品。

所述转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌可以在制备仔猪饲料中的得到应用。重组乳酸杆菌可以作为一种口服饲料添加剂应用于养猪业，可以补充猪尤其是仔猪肠道淀粉酶不足，具有促进饲料的消化，提高料重比，增加经济效益的作用。此外，宿主菌乳酸杆菌是一种干酪乳杆菌，其本身对动物机体也有益生功能，因此本发明是提供了一种人工产淀粉酶益生基因工程乳酸杆菌，在仔猪生产中具有重要的应用价值。

本专利的一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌的构建方法，包括使用一种淀粉液化芽孢杆菌基因组和一种来自乳酸杆菌的信号肽，将淀粉液化芽孢杆菌基因和来自乳酸杆菌的信号肽基因插入到乳酸杆菌的表达载体pIlac的NdeI和SmaI位点，然后将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276中，得到转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌；其详细的工艺如下：

一、α－淀粉酶基因引物获得和淀粉液化芽孢杆菌基因组的提取，包括步骤1-4：

1、α－淀粉酶基因引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，引物序列如下：

上游引物P1: 5’- GCTCTAGATATATGTTACAATTGAAGTGCA-3’ (XbaI位点为“TCTAGA”)；

下游引物P2: 5’- AACCCGGGGTTTATTTTCCGCTTCT-3’ (SmaI位点为“CCCGGG”)；

2、淀粉液化芽孢杆菌基因的提取：

将活化的淀粉液化芽孢杆菌培养18h后，取3ml菌液，然后参照北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA 快速提取试剂盒（离心柱型）提取其基因组DNA，方法按使用说明书步骤进行；

3、α－淀粉酶amy基因的PCR扩增：

以步骤2提取的基因组DNA为模板，扩增淀粉液化芽孢杆菌的α－淀粉酶基因，反应体系如下：

表1 α－淀粉酶基因PCR扩增体系

上游引物(20pM)	1.5μl
		下游引物(20pM)	1.5μl
10×PCR Buffer	5.0μl
		Pyrobest DNA Polymerase (5U/μl)	1.0μl
dNTPs (10pM)	0.25μl
		模板DNA	0.5μl
加灭菌超纯水至	50μl

轻轻混匀，2000×g瞬时离心后进行PCR；

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性40s，56℃退火50s，72℃延伸70s，循环35次，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用；取5μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，以Marker105为对照，观察扩增片段的长度，若电泳片段的大小为1152bp左右即初步判定正确；

4、amy基因与pMD18-T载体的连接与转化

将上述鉴定正确的PCR产物按照北京艾德莱生物科技有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行回收，然后再按照大连宝生物有限公司的pMD18-T试剂盒说明进行连接，连接产物的转化按照常规方法将其转化入大肠杆菌JM109中，例如可以使用J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 最尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版第96页介绍的方法；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pMD-amy。

二、来自短小乳酸杆菌的信号肽的获得，包括步骤5-8：

5、信号肽基因引物的获得：

信号肽基因引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，引物序列如下：

P3：5’- AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG-3’(PstI位点为“CTGCAG”)

P4：5’- CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3’(XbaI位点为 “TCTAGA”)

6、短小乳杆菌L.brevis 1.2028基因组的提取

将短小乳杆菌L.brevis 1.2028培养18h后，取3ml菌液，然后按照北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA 快速提取试剂盒（离心柱型）提取其基因组DNA，方法按使用说明书步骤进行；

7、信号肽SP基因的PCR扩增

以步骤6提取的基因组为模板，扩增短小乳杆菌的信号肽基因，反应体系如下：

表2 信号肽SP基因PCR扩增体系

轻轻混匀，2000×g瞬时离心后进行PCR；

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性40s，58℃退火1min，72℃延伸20s，循环35次，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用；取5μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，以Marker105为对照，观察扩增片段的长度，若片段大小在90bp左右即初步判定正确；

8、sp基因与pMD18-T的连接

将上述鉴定正确的PCR产物按照北京艾德莱生物科技有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行回收，然后再按照大连宝生物有限公司的pMD18-T试剂盒说明进行连接，连接产物的转化按照常规方法将其转化入大肠杆菌JM109中，例如可以使用J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 最尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版第96页介绍的方法；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pMD-sp；

9、sp基因和amy基因的连接：

分别将pMD-amy和pMD-sp用XbaI/SmaI双酶切，回收相应的目的片段，按照常规方法进行连接，例如按照同步骤4的方法进行连接；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pMD-sp-amy；

10、sp-amy基因与表达载体pIlac的连接

将质粒pMD-sp-amy和质粒pIlac同时用PstI/SmaI双酶切，按照常规方法进行连接，例如按照同步骤4的方法进行连接；其中表达载体pIlac按照M. J .Gosalbes et al. Integrative food-grade expression system based on the lactose regulon of Lactobacillus casei. Applied and Environmetal Microbiology，2000，66(11)：4822-4828的方法进行，利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pIlac-sp-amy，获得了重组表达载体；

11、重组表达载体pIlac-sp-amy的转化，包括

11.1 乳酸杆菌感受态细胞的制备

(1) 挑取新鲜平板上的单个菌落，在3ml MRS中培养过夜(16h)；

(2) 以1:50的比例接种于含1.2％甘氨酸的MRS培养液中，37℃孵育4～5h (OD=0.6)；

(3) 冰浴使细菌停止生长，4℃ 6000×g 离心10min；

(4) 无菌条件下弃上层清液，用冰冷的等体积灭菌10％甘油洗2次，以除去培养基中的离子成分；

(5) 离心去上层清液，用冰预冷的1／10体积的10％甘油重新悬浮后离心收集菌体；

(6) 用冰预冷的1／100原体积的10％甘油重新悬浮，分装小管，每管50μl，-80℃保存备用，即为感受态细胞；

11.2电转化

(1) 将100μl感受态细胞与5μl(300～500ng)在冰浴条件下混匀；

(2) 将其加入到冰预冷的0.1cm电转化杯中，冰上放置10min；

(3) 电转化条件：600～2400V(间隔100V)，25μF，100Ω；

(4) 电击后立即加入0.9ml预冷的含10％蔗糖的MRS，转入1.5ml离心管中，37℃孵育2h；

(5) 取200μl涂于含5μg/ml的Ery抗性的MRS平板，并以不含Ery的平板做对照，37℃厌氧培养40h后观察结果，如果抗性平板上能够长出菌落而对照平板不长，则可判为阳性菌落。

制备的转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其阳性菌株的筛选及鉴定方法包括：

A、阳性菌株的筛选

在含有红霉素(Ery)的MRS培养基上能够生长的即可能为阳性菌落；对疑似阳性的菌落滴种在以植酸钙为底物的培养基平板上，同时以非重组乳酸杆菌为对照，37℃厌氧培养24h后观察降解植酸钙情况，通过菌落周围产生的溶解圈大小初步判断其产酶能力。

B、阳性菌株基因组的提取

(1) 挑取抗性平板上的单个菌落，接种于5ml MRS培养液中厌氧培养24h；

(2) 取1.5ml菌液于离心管中，8000×g离心3min，弃上层清液；

(3) 加入400μl 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris.Hcl(0.02mol/L, pH8.0)，充分混匀，离心弃上层清液；

(4) 加500μl溶菌液(0.01mol/L Tris.HCl，12％PEG20000（聚乙二醇20000）, pH8.0)和150μl溶菌酶(100mg/ml)重新悬浮，37℃孵育2h；

(5) 然后6000×g离心5min，收集菌体，加600μl TES液(0.5％十二烷基硫酸钠(SDS), 5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),10mmol/L Tris-HCl, pH8.0)重新悬浮；

(6) 12000×g离心，将上层清液转移到另一离心管，加入等体积的酚／氯仿抽提，12000×g离心3min;

(7) 将上层清液转移至另一离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置-20℃冰箱中过夜；

(8) 12000×g离心10min，弃上层清液；

(9) 加入1ml 70％乙醇沉淀DNA，室温静置10min；

(10) 12000×g离心10min，弃上层清液，干燥后，加入含有10μg/mL RNA酶(RNase)的Tris缓冲液(TE) 20μl，-20℃保存备用；

C、阳性菌株的PCR鉴定

以抽提的重组阳性乳酸杆菌的基因组DNA为模板，分别以P1和P2、P3和P4、P1和P4为引物进行PCR，条件同重组乳酸杆菌构建方法的步骤3和7；如果能分别扩增出大小为1545bp、90bp、1635bp的片段则确定为阳性菌株。

融合蛋白在制备的转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌中的表达方法可以包括：

A、样品的准备

(1) 接种L.casei转化子单菌落于4ml MRS(含5μg/mL Ery)培养基中，37℃厌氧培养过夜；

(2) 按1:100的体积比例，将新鲜菌液接种于MRS(含5μg/mL Ery)液体培养基中，37℃厌氧培养8h至OD600=0.5；

(3) 加入乳糖至乳糖终浓度为0.5mg/mL；

(4) 继续37℃厌氧培养24h取样，于4℃ 12000×g离心5min，弃沉淀；

(5) 加入100μl脱氧胆酸盐三氯乙酸(DOC-TCA)，混匀；

(6) 将蛋白质在冰浴中沉淀30min；

(7) 10000×g离心5min，弃上层清液并用吸管吸净残留液；

(8) 加入200μl乙醇-乙醚(1:1体积比)洗涤TCA沉淀的蛋白质；

(9) 将沉淀再悬浮于50～100μl 20mM Tris-HCl(pH6.0)重新悬浮；

(10) 往样品中加入1/5体积的5×上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，置冰上冷却；

B、表达产物的SDS-PAGE检测

可以《分子克隆实验指南》(第三版第1453页)介绍的实验方法进行操作，例如，可以是：

(1) 按照Bio-Rad公司Mini-Protean3电泳仪使用说明书装配好灌胶用的模具；倒分离胶，加入10％的分离胶至约距前玻璃板顶端1.5cm，沿玻板边缘轻轻加入约1cm高的水饱中异丁醇，室温下聚合30min；

(2) 倒浓缩胶，吸干水层，加入5％的浓缩胶，并插入样品梳，室温下聚合约20min，取出样品梳，用蒸馏水冲洗加样孔槽后，加入电泳缓冲液；

(3) 加样，将沉淀的蛋白加入5倍样品缓冲液，混匀后，100℃沸水浴8min，以10000×g离心2s，每孔加入25μl样品；

(5) 电泳，接通电源，70V恒压电泳至溴酚兰进入分离胶后，电压改为150V，直至指示剂移至接近胶底约1cm时停止电泳；

(6) 蛋白染色，取出凝胶后，置于大平皿中用蒸馏水漂洗2～3次，加入考马斯亮蓝R-250染色液，在摇床上缓慢震荡5min，弃去染液，用蒸馏水漂洗数次；

(7) 脱色，往平皿中加入考马斯亮蓝脱色液，作用1h后，更换脱色液，直到蛋白条带清晰为止；

(8) 采用Bio-Rad公司凝胶成像系统成像，并利用分析软件Gel Doc2000(Quantity One)进行分析处理；

(9) 将成像后的凝胶小心放在两张玻璃纸夹层中，置于干胶仪中干胶2h后保存；

C、表达产物的纯化与验证，包括：

重组蛋白的浓缩

(1) 将重组菌按1％接种于100ml MRS培养液中，诱导培养20h；

(2) 于4℃ 6000×g离心8min，收集上层清液；

(3) 在缓慢搅拌下加入150ml 50％的PEG6000(w/v溶于蒸馏水)；

(4) 继续搅拌30～60min，至完全沉淀为止；

(5) 10000×g离心10min，弃上层清液；

(6) 用1～2倍沉淀体积的0.01mol/L(pH7.4)的PBS悬浮沉淀；

(7) 于4℃透析48h，中间换透析液5～6次；

(8) 于4℃ 15000×g离心20min，弃沉淀，上层清液部分透析48h，期间换透析液5～6次；

浓缩产物的柱层析：

(1) 倾去Sepharose 4B介质中的乙醇，用2倍体积的的0.05M Tris-HCl(pH8.0)洗三次，用玻棒将介质缓慢导入层析柱中，接通管道，用2倍体积的0.05M Tris-HCl(pH8.0)洗脱；

(2) 吸出介质表面的缓冲液，沿管壁缓慢加入浓缩的重组蛋白，待液体完全进行介质后，补缓冲液至离介质表面有2cm左右，盖上进水口的盖子，调整流速至0.7ml/min；

(3) 将收集各峰的洗脱液装入透析袋中，用PEG6000浓缩至适当的体积，收集浓缩液，于-20℃保存；

纯化产物的验证及酶活测定包括：

取3支干净的试管，每支试管中加入可溶性淀粉2ml于试管中，加入磷酸缓冲液（磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，定容到1000ml, pH6.0）0.5ml摇匀后于60℃水浴中预热5min，加入4.3.2步骤获得的粗酶液0.1ml并立即计时，摇匀，准确反应5min，立即吸取反应液100ul于稀碘液（原碘液：碘11g，碘化钾22g，定容至500ml；稀碘液：取原碘液2ml，加碘化钾20g，用水定容至500ml）5.00ml中，摇匀，以稀碘液作为对照，于660nm波长用10mm比色皿，迅速测定其吸光度，求得测试酶液的浓度(c)

公式: X = c×n ；

式中：X：样品的酶活力 (U/mL)；c：测试酶液的浓度(U/ml)；n：样品的稀释倍数；

酶活力单位定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，于60℃, pH=6.0条件，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/ml)表示。

这些技术方案，包括改进的技术方案也可以互相组合或者结合，从而达到更好的技术效果。

通过采用上述技术方案，本发明利用PCR技术从淀粉液化芽孢杆菌基因组中扩增出淀粉酶amy基因和从短小乳杆菌基因组中扩增出信号肽sp基因，构建了含有sp基因和amy基因的重组表达质粒pIlac-sp-amy，通过电转化整合到了乳酸杆菌的基因组上，并实现了稳定表达，从而获得了能够分泌表达淀粉酶的重组乳酸杆菌。该重组乳酸杆菌可以应用于饲料中富含淀粉的动物生产中，尤其是对初生仔猪和雏鸡，对于提高生长速度、降低料肉比、增加经济效益等具有重要的意义。

附图说明

1、图1是淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶amy基因的PCR扩增图。

图中，泳道1和2是PCR产物；泳道3是DL2000Marker。

2、图2是质粒pMD-amy酶切鉴定图。

图中，泳道1是DL2000Marker；泳道2是质粒PCR产物；泳道3是XbaI/SmaI双酶切；泳道4是SmaI单酶切；泳道5是λDNA/HindIII Marker。

3、图3是短小乳杆菌L.brevis 1.2028信号肽基因PCR图。

图中，泳道1是PCR产物；泳道2是Land100 Marker。

4、图4是质粒pMD-sp酶切鉴定图。

图中，泳道1是XbaI单酶切；泳道2是XbaI/PstI双酶切；泳道3是DL2000 Marker。

5、图5 是质粒pMD-sp-amy酶切鉴定图。

泳道1是DL2000 Marker；泳道2是PstI/XbaI双酶切；泳道3是PstI/SmaI双酶切；泳道4是λDNA/HindIII Marker。

6、图6是重组表达质粒pIlac-sp-amy酶切鉴定图

泳道1是λDNA/HindIII Marker；泳道2是XbaI/SmaI双酶切；泳道3是PstI/SmaI双酶切。

7、图7 是重组乳酸杆菌PCR验证图。

泳道1是DL2000 Marker；泳道2是P1+P2 PCR产物；泳道3是P3+P4 PCR产物；泳道4是P1+P4 PCR产物。

8、图8 是重组乳酸杆菌平板验证图。

9、图9 是重组乳酸杆菌表达蛋白SDS-PAGE图。

泳道1是标准蛋白质Marker；泳道2是pIlac-sp-amy重组乳酸杆菌表达上清产物；泳道3是pIlac重组乳酸杆菌表达上清产物；泳道4是pIlac-sp-amy重组乳酸杆菌菌体裂解产物。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明的保护范围。

实施例1：分泌表达a-淀粉酶的重组乳酸杆菌的构建

1．淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶基因的克隆

以淀粉液化芽孢杆菌基因组为模板，以P1和P2为引物扩增am y基因(见附图1)，在约1450bp处有一条特异条带。纯化的产物与pMD18-T连接，获得质粒pMD-amy，其酶切鉴定和PCR鉴定结果见附图2(XbaI/SmaI双酶切可产生一条约2700bp和一条约1450bp的条带、SmaI单酶切可产生一条约4150bp的条带)。

2．短小乳酸杆菌信号肽sp基因的克隆

以短小乳酸杆菌L.brevis1.2028基因组为模板，以P3和P4为引物扩增sp基因(见附图3)，在约90bp处有一条特异条带。纯化的产物与pMD18-T连接，获得质粒pMD-sp，其酶切鉴定和PCR鉴定结果见附图4(PstI/XbaI双酶切可产生一条约2700bp和一条约90bp的条带、XbaI单酶切可产生一条约2790bp的条带)。

3. 重组乳酸杆菌表达载体的构建

分别将质粒pMD-amy和质粒pMD-sp用XbaI/SmaI进行酶切连接，获得pMD-sp-amy质粒(见附图5)，再将质粒pMD-sp-amy和质粒pIlac用PstI/SmaI进行酶切连接，获得pIlac-sp-amy质粒(见附图6)。

4. 重组质粒pIlac-sp-amy电转化乳酸杆菌

将重组质粒pIlac-sp-amy在600～2400V(间隔100V)，25μF，100Ω条件下进行电转化，在Ery抗性平板上筛选到阳性菌落，按照阳性菌基因组试剂盒抽提方法抽提重组乳酸杆菌的基因组，采用PCR法验证amy基因是否整合到了乳酸杆菌基因组上，其结果见附图7，用引物P1和P2可以扩增到一条大约1450bp的条带，用引物P3和P4能够扩增到一条约90bp的条带，用引物P1和P4能够扩增到一条约1540bp的条带。表达的特异性蛋白结果见图9，通过表达上清进行SDS-PAGE电泳发现，重组乳酸杆菌表达上清液在约58kDa处有一特异性条带，而对照组没有。为了证明表达蛋白的活性，分别采用了以可溶性淀粉为底物的平板培养，然后以稀碘液染色，由图8可以明显的看出，重组乳酸杆菌比非重组乳酸杆菌具有较强的分解淀粉的能力。同时通过标准的淀粉酶活力测定法测定了重组乳酸杆菌培养上清的酶活力，由表4可知上清中的淀粉酶平均酶活力可达1107.63U/ml。

实施例2：本发明的重组乳酸杆菌对仔猪生产性能的影响实验

1. 试验动物的选择、分组及饲养管理

试验在同一栋双列封闭式猪舍内进行，均采用自由采食和饮水方式。

试验选取产期和窝仔数相近、胎次相同的初生仔猪(长×大)15窝，随机分为3组，每组5窝。仔猪从7日龄开始用教槽料诱食，28日龄断奶后继续用教槽料饲喂断奶仔猪1周，然后选用保育料，各组仔猪处理分别如下：I组(对照组)，基础日粮＋0.10％次粉；II组(非重组乳酸杆菌组)：基础日粮＋0.10％的非重组乳酸杆菌制剂；III组(重组乳酸杆菌组)：基础日粮＋0.10％的重组乳酸杆菌制剂。

2.饲粮组成及营养水平

表3 基础饲粮组成及营养水平

项目	教槽料	保育料
			原料
膨化玉米	53.66
			玉米		62.00
膨化大豆	14.00	5.68
			膨化豆粕	6.00
豆粕		19.00
			乳清粉	10.00	3.00
鱼粉	2.00	2.00
			血浆蛋白粉	3.00	1.00
乳清蛋白	3.00
			蔗糖	5.00	4.00
石粉	0.55	0.55
			磷酸氢钙	1.40	1.10
食盐	0.30	0.30
			赖氨酸	0.14	0.32
蛋氨酸	0.05	0.05
			预混料	1.00	1.00
合计		100
			营养水平
消化能	15.36	13.88
			粗蛋白质	18.24	18.2
钙	0.82	0.70
			总磷	0.67	0.61
赖氨酸	1.20	1.20
			蛋氨酸	0.37	0.37

注：预混料为每千克饲粮提供：VA 4400IU，VD3 2200IU，VE 20IU，VK 3.0mg，VB1 2.0mg，核黄素6.0mg，VB12 0.03mg，叶酸0.3mg，生物素4.5mg，烟酸25mg，D-泛酸15mg，胆碱500mg，Zn 130mg，Fe 120mg，Cu 10mg，I 0.3mg，Se 0.3mg

3. 仔猪生产性能的测定

分别在7、28、35、60日龄各称重1次，并每天记录仔猪的采食、发病和死亡情况，结果见附表5和附表6。结果表明结果表明在28日龄和35日龄无论是重组乳酸杆菌组还是非重组乳酸杆菌组的体重均较对照组差异显著（P＜0.05），而且重组乳酸杆菌组也较非重组乳酸杆菌组的体重差异显著（P＜0.05），尤其对照断奶前后(28日龄前后) 重组乳酸杆菌组均较对照组差异显著（P＜0.05），而只有28日龄前平均日增重较非重组乳酸杆菌组差异显著（P＜0.05），而35日龄内的平均日增重却差异不显著（P>0.05）。在35-60日龄，可以看出重组乳酸杆菌组的平均日增重和料重比均较对照组差异显著（P＜0.05）。

表4 重组乳酸杆菌表达上清液中a-淀粉酶酶活测定结果

组别	酶活（U/ml）	OD值（660nm）
			1	1136.30	0.502
2	1083.66	0.532
			3	1102.93	0.519
平均酶活	1107.63

表5 不同处理对7-35日龄仔猪生产性能的影响

项目	I组	II组	III组
				7日龄体重	2.48±0.65	2.44±0.32	2.50±0.42
28日龄体重	6.63±1.52^a	6.89±1.44^c	7.31±0.67^b
				35日龄体重	6.81±1.58^a	7.14±0.89^c	7.57±0.69^b
7-28日龄仔猪平均日增重	197.62±35.51^a	211.90±18.73^c	229.05±15.33^b
				7-35日龄仔猪平均日增重	154.64±48.17^a	167.86±20.50	181.07±20.48^b
7-35日龄平均日采食量	51.67±18.88	53.54±13.49	53.87±12.49

注：同行肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05），下同。

表6 不同处理对35-60日龄仔猪生产性能的影响

项目	I组	II组	III组
				平均日增重	257.14±53.75^a	277.22±28.48	302.04±21.05^b
平均日采食量	565.40±93.12	584.47±67.46	592.52±53.44
				日龄料重比	2.20±0.33^a	2.11±0.25	1.96±0.20^b

氨基酸或者核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技大学

<120> 一种转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌及其制品及应用

<130>

<140> 201110283387.2

<141> 2011-09-22

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> 淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctctta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gctgtaaatg gcacgctgat gcagtatttt 120

gaatggtata cgccgaacgg cggccagcat tggaaacgat tgcagaatga tgcggaacat 180

ttatcggata tcggagtcac tgccgtctgg attcctcccg cataccaagg attgagccaa 240

tccgatcacg gatacggacc ttatgatttg tatgatttag gagaattcca gcaaaaaggg 300

acggtcagaa cgaaatacgg cacaaaatca gaccttcaag atgcgatcgg ctcactgcat 360

tcccggaacg tccaagtata cggagatgtg gttttgaatc ataaggctgg tgctgatgca 420

gcagaagatg taactgccgt cgaagtcaat ccggccaata gaaatcagga aacttcggag 480

gaatatcaaa tcaaagcgtg gacggatttt cgttttccgc gccgtggaaa cacgtacagt 540

gattttaaat ggcattggta tcatttcgac ggagcggact gggatgaatc ccggaagatc 600

agccgcatct ttaagtttcg tggggaagga aaagcgtggg attgggaagt atcaagtgaa 660

aacggcaact atgactattt aatgtatgct gatgttgact acgaccaccc tgatgtcgtg 720

gtagagacaa aaaaatgggg tatctggtat gcgaatgaac tgtcattaga cggcttccgt 780

attgatgccg ccaaacatat taaattttca tttctgcgtg attgggttca ggcggtcaga 840

caggcgacgg gaaaagaaat gtttacggtt gcggagtatt ggcagaataa tgccgggaaa 900

ctcgaaaact acttgaataa aacaagcttt aatcaatccg tgtttggtgt tccgcttcat 960

ttcaatttac aggcggcttc ctcacaagga ggcggatatg atatgaggcg tttgctggac 1020

ggtaccgttg tgtccaggca tccggaaaag gcggttacat ttgttgaaaa tcatgacaca 1080

cagccgggac agtcattgga atcgacagtc caaacttggt ttaaaccgct tgcatacgcc 1140

tttattttga caagagaatc cggttatcct caggtgttct atggggatat gtacgggaca 1200

aaggggacat cgccaaagga aattccctca ctgaaagata atatagagcc gattttaaaa 1260

gcgcgtaagg agtacgcata cgggccccag cacgattata ttgagcaccc ggatgtgatc 1320

ggatggacga gggaaggtga cagctccgcc gccaaatcag gtttggccgc tttaatcacg 1380

gacggacccg gcggatcaaa gcggatgtat gcaggcctga aaaatgccgg cgagacatgg 1440

tatgacataa cgggcaaccg ttcagatact gtaaaaatcg gatctgacgg ctggggagac 1500

tttcatgtaa acgatgggtc cgtctccatt tatgttcaga aataa 1545

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)

<400> 2

atgcaatcaa gtttaaagaa atctctttac ttgggccttg ccgcattgag ctttgctggt 60

gttgctgccg tttcaacgac tgcttcagct 90

Claims

1.一种转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌在制备仔猪饲料中的应用，该转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌是将α-淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体pIlac的多克隆位点，得到表达质粒pILac-sp-amy；重组表达质粒pIlac-sp -amy含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、乳酸杆菌信号肽基因、淀粉酶基因、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery基因，其表达式为：-ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-；然后再将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中获得的产品；所述的α－淀粉酶基因来源于淀粉液化芽孢杆菌，所扩增的序列是GenBank上登陆号为GU591658的序列中的1-1545bp位碱基；信号肽基因来源于短小乳杆菌L. brevis 1.2028，所扩增的序列是GenBank上登陆号为Z14250的序列中的260-349bp位的碱基，其特征是：所述的转芽孢杆菌源α-淀粉酶基因重组乳酸杆菌作为一种补充仔猪肠道淀粉酶不足、促进饲料的消化、降低料重比的口服饲料添加剂。