CN102337242A

CN102337242A - 一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用

Info

Publication number: CN102337242A
Application number: CN2011102833942A
Authority: CN
Inventors: 丁轲; 赵振升; 钟社普; 王国永; 余祖华; 白东英; 周变华; 孔涛
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明介绍了一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用，其基因组中整合了带有乳酸杆菌信号肽的AY220075枯草芽孢杆菌的中性植酸酶基因，所扩增的序列是1-1152bp碱基；信号肽基因是Z14250的260-349位碱基；将中性植酸酶基因和信号肽基因连接后插入到多克隆位点，并整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中。本发明的重组乳酸杆菌作为饲料添加剂用于养猪业，可弥补猪肠道不能分泌植酸酶的不足，可促进饲料原料中的植酸磷的代谢，减少无机磷的排放，有利于保护环境。宿主菌乳酸杆菌对动物机体也有益生功能，在猪、禽等单胃动物生产中具有重要的应用价值。

Description

一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用

技术领域

本发明涉及一种基因重组技术，特别是一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用。

背景技术

植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（Myo-inositol hexaphosphate phosphor -hydrotase），是催化植酸（即肌醇六磷酸）及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。植酸的化学名称是环己六醇六磷酸酯。分子式为C6H18O24P6，构式为C6H6 [OPO(OH)₂]₆，它是一种淡黄色或黄褐色的黏稠液体。易溶于水、乙醇、丙酮，几乎不溶于苯、氯仿、醚和己烷。而植酸本身虽然毒性很小，但却有很强的螯合能力，因此具有抗营养作用。它在动物胃肠道中会与多种金属离子如Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺等离子螯合并能与蛋白质等形成相应的不溶性复合物(姚斌，范云六. 植酸酶的分子生物学与基因工程. 生物工程学报，2000，16:1～5.)。植酸广泛存在于各种植物中，在植物性饲料中的磷主要以植酸及其盐形式存在，由于畜禽饲粮中植物性饲料所占比例较大，含植酸磷较高，尤其是油粕、糠麸等含有较高比例的植酸磷，所以研究如何降解饲料中的植酸磷具重要的实践意义。

一般来讲，自然界的植酸酶来源有三种：植物的籽实、微生物和动物的胃肠道。动物胃肠道中的植酸酶来自于肠道微生物区系和肠粘膜分泌的内源性植酸酶。有研究表明，单胃动物肠道黏膜中的内源性植酸酶及肠道微生物产生的植酸酶活性很差，反刍动物瘤胃微生物产生的植酸酶能有效水解植酸盐。因此，反刍动物不用考虑植酸磷的利用问题。植物来源的植酸酶主要来源于植物籽实和植物组织。这些酶的活性较高，但相互之间由于植物来源的不同其活性也有差异。许多研究证明，植物来源的植酸酶不适宜在动物饲料中应用，因为植物来源植酸酶的最佳pH值为5.5，不适合单胃动物胃内的酸性环境。微生物来源的植酸酶是目前植酸酶研究的重点，因为微生物植酸酶的pH值范围较大，比较接近单胃动物的胃肠生理条件。目前用于工业生产植酸酶的微生物主要是曲霉，如无花果曲霉和黑曲霉。真菌的酸性植酸酶主要适用于pH值呈酸性的单胃动物及少数鱼类如虹鳟等，但不适用于消化道呈中性的鲤科鱼类，以及不能在单胃动物pH值呈中性的肠道中表现酶活力，限制了酸性植酸酶的应用范围。因此，研究pH范围大的中性植酸酶成为当代植酸酶研究的热点。

磷是动物必需的一种常量矿物元素，在参与体内正常的新陈代谢中起着重要作用，而且是骨骼的必要成分。畜禽必须从饲料中摄取足够的磷才能维持正常的生命和生产活动，特别是对营养十分敏感的高产动物。磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有重要影响。在谷物、豆类和油料作物等的籽实中，磷的基本贮存形式是植酸磷，占植物中总磷的60%-80%[3]，但其难以被单胃动物利用，从而造成很大问题：首先是磷资源的浪费(Ehrlich KC, Montalbano B G, Mullaney E J, et al. Identification and cloning of a second phytase gene (phyB) from Aspergillus niger (ficuum) . Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, 195:53～57.)。一方面饲料中的磷不能得到有效利用；另一方面为了满足动物的营养需求，又必须在饲料中添加无机磷，提高饲料成本；其次是形成高磷粪便污染环境。饲料中85%左右的植酸磷会被动物直接排出体外，造成水和土壤的严重污染。

植酸酶作为一种新型饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证(Pandey A, Szakacs G, Soccol C, Rodriguez-Leon J, Soccol V. Production, purification and properties of microbial phytases. Bioresource Technol, 2001, 77:203～214.)。植酸酶能够分解饲料中的植酸，形成畜禽可利用的磷酸和肌醇单磷酸至肌醇五磷酸，它能使饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%(马俊孝. 饲用植酸酶的研究进展. 饲料工业，2010，31（16）：26～30.)，从而减少植物性饲料中无机磷的添加量，减轻磷污染，缓解磷资源缺乏。同时解除植酸的抗营养作用、提高饲料的营养价值，还可以增加动物对矿物质的利用率，提高碳水化合物的吸收率，促进动物的生长发育。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要的意义，有着广泛的应用前景。

目前克隆到的植酸酶基因主要有：真菌来源的phyA和phyB基因，芽孢杆菌来源的phyC（L）基因，大肠杆菌来源的appA基因，其它微生物来源及动物来源的植酸酶基因(Pandey A, Szakacs G, Soccol C, Rodriguez-Leon J, Soccol V. Production, purification and properties of microbial phytases. Bioresource Technol, 2001, 77:203～214.)。1907年，Suzuki在米糠中首次发现植酸酶。对植酸酶基因研究较多的是来源于真菌的phyA（B）基因，其表达产物几乎为酸性植酸酶，是组氨酸酸性磷酸酶家族。最先分离出的植酸酶基因是Aspergillus ficuum NRRL3135的phyA基因(Van Hartingsveldt W, van Zeijl C M J, Harteveld M G, et al. Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger . Gene, 1993(127):87～94.)（Van Hartingsveldt,1993），该基因全长1506bp，其中+46～+147的长为102bp的核苷酸序列是典型的真菌内含子序列。它的基因编码467个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则推断，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+19位的Gly之后。同年，Ehrlich等分离克隆了来自A.ficuum的第二个植酸酶基因phyB，phyB和phyA的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性低，phyB基因全长1605bp，共编码479个氨基酸，其上至少有8个糖基化位点，phyB编码的植酸酶最适pH值为2.5，而phyA植酸酶的最适pH值为5.0。

1998年，Kerovuo等(Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen Petal. Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(6):2079～2085.)首次从B.subtilis VTTE-68013中分离出植酸酶基因phyC，该基因全长为1152bp，编码383个氨基酸，其中N末端的26个氨基酸是信号肽序列。各种芽孢杆菌植酸酶的酶学性质基本一致，具有相近的分子量和等电点，都具有较好的热稳定性和相近的最适pH值范围，来源于细菌（主要是芽孢杆菌）的植酸酶多为中性植酸酶，基因较短，不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。

大肠杆菌的appA植酸酶是一种双功能酶，在酸性条件下既表现出磷酸酶活性又表现出植酸酶活性。appA植酸酶是迄今所知分解植酸能力最强的植酸酶，也是迄今所报道的比活性最高的植酸酶(Golovan S, Wang G, Zhang J, et al. Characterization and overproduction of the Escherichia coli appA encoded bifunctional enzyme that exhibits both phytase and acid phosphatase activities. Canadian Journal of Microbiology, 2000, 46(1):59～71.)。1993年，Greiner等(Greiner R, Konitzny U, Jany KD. Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli. Archives Biochemistry and Biophysics, 1993, 303 (1): 107～113.)从E.coli中克隆得到植酸酶基因appA，appA是一个编码双功能蛋白的基因，全长1299bp，编码432个氨基酸，N末端22个氨基酸为信号肽。按成熟蛋白的氨基酸推断，其理论分子量为45.7kDa，有2个潜在的糖基化位点，氨基酸序列存在活性位点保守序列。

2006年，Huang等(Huang H, Luo H, Yang P. A novel phytase with preferable characteristics from Yersinia intermedia. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 350(4):884～889.)从中间型耶氏菌（Yersinia intermedia）中克隆得到一个新的植酸酶基因，该基因全长1326bp，编码441个氨基酸，氨基酸序列上存在活性位点保守序列，N末端23个氨基酸为信号肽，与肠杆菌、丝状真菌来源的植酸酶在空间结构上基本一致。反刍动物能有效利用植酸磷，与瘤胃中的微生物产植酸酶有关，目前已经分离到多种产植酸酶的瘤胃微生物(Lan G Q, Ho Y W, Abdullah N. Mitsuokella jalaludinii sp.nov from the rumens of cattle in Malaysia. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002, 52:713～718.)。

最早分离出来的植物植酸酶基因是来自玉米的phyS11，是Maugenset(Maugenest S, Martinez I, Lescure A M. Cloning and characterization of a cDNA encoding a maize seedling phytase. Biochemical Journal, 1997, 322(2):511～517.)等于1997年从萌发的玉米种子中分离得到的，该基因全长1167bp，编码388个氨基酸，它所编码的氨基酸序列与丝状真菌只有33个氨基酸是同源序列，其中有活性位点保守序列存在。

目前酸性植酸酶已经商品化，但也存在一些问题：一是饲料产品单位酶活仍然相对较低；二是中性植酸酶的研究较少，尚无相应产品投放市场；三是植酸酶产品热稳定性的问题。作为用于饲料工业的酶制剂，由于饲料制粒工艺和动物生理生化的要求，真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好的热稳定性，同时又必须在动物正常体温下具有较高的酶活性。如何解决使其耐短暂制粒高温、又能在动物正常体温下具有高酶活性这一对矛盾是目前包括植酸酶在内所有饲用酶制剂均需解决的问题。此外，由于植酸酶来源不同，其pH作用范围也较狭窄。植酸酶催化反应的pH也必须与动物消化道相适应，不同动物消化道的pH值不同，而且同一种动物不同消化道部位的pH值也不相同，胃的pH为1.5-3.5，小肠pH为5-7，大肠pH为7左右。因此要求饲用酶对pH值有较大的适应范围。真菌来源的酸性植酸酶pH作用范围在2.5-5.5之间，芽孢杆菌来源的中性植酸酶主要作用pH范围在6-9之间，如果酶催化反应的有效pH范围更广，酶则能随食糜在各个消化部位持续发挥作用，从而提高其对底物的利用率。目前，采用基因工程、蛋白质工程技术等对酸性植酸酶的热稳定性和催化pH进行改造己有许多成功的报道，但对于中性植酸酶尚无类似报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用。通过设计将乳酸杆菌的信号肽基因与中性植酸酶基因重组到乳酸杆菌的表达载体上，再电转化整合到乳酸杆菌，研制成能特异表达中性植酸酶的重组乳酸杆菌，作为益生菌活菌饲料添加剂用于动物的生产。

为了实现解决上述技术问题的目的，本发明采用了如下技术方案：

一种转中性植酸酶(phytase)基因重组乳酸杆菌，其特征是：该重组乳酸杆菌基因组中整合了带有乳酸杆菌信号肽(signal peptide, sp)的枯草芽孢杆菌的中性植酸酶基因(phy)；所述的中性植酸酶基因来源于GenBank上的登陆号为AY220075的枯草芽孢杆菌，所用于扩增的序列是1-1152bp位碱基；信号肽基因来源于GenBank上的登陆号为Z14250的短小乳酸杆菌L.brevis1.2028 ，所用于扩增的序列是260-349位的碱基；将中性植酸酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体pIlac的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中从而获得中性植酸酶基因重组乳酸杆菌。

具体的，所述的重组乳酸杆菌在重组表达质粒中，设计并合成的一对特异性引物用于扩增枯草芽孢杆菌的植酸酶基因，分别为：

上游引物P1：5’- AATCTAGAATGAATCATTCAAAAACA -3’，XbaI酶切位点为TCTAGA；

下游引物P2：5’- CCCGGGTTATTTTCCGCTTCT -3’， SmaI酶切位点为CCCGGG。

所述的植酸酶的DNA序列，其包含如下序列或经修饰的序列，所述修饰不改变所编码的氨基酸序列如下：

ATGAATCATT CAAAAACACT TTTGTTAACC GCGGCAGCCG GATTGATGCT CACATGCGGT 60

GCGGTTTCTT CCCAGGCCAA GCATAAGCTG TCTGATCCTT ATCACTTTAC CGTGAATGCG 120

GCGGCGGAAA CGGAGCCGGT TGATACAGCC GGTGATGCAG CTGATGATCC TGCGATTTGG 180

CTGGACCCCA AGAATCCTCA GAACAGCAAA TTGATCACAA CCAATAAAAA ATCAGGCTTA 240

GTCGTGTACA GCCTAGAGGG AAAGACGCTT CATTCCTATC ATACCGGGAA GCTGAACAAT 300

GTTGATATCC GCTATGATTT TCCGTTGAAC GGAAAAAAAG TCGATATTGC GGCGGCATCC 360

AATCGGTCTG AAGGAAAGAA TACCATTGAG ATTTACGCCA TTGACGGGAA AAACGGCACA 420

TTACAAAGCA TTACAGATCC AGACCGCCCG ATTGCATCAG CAATTGATGA AGTATACGGT 480

TTCAGCTTGT ACCACAGTCA AAAAACAGGA AAATATTACG CGATGGTGAC AGGGAAAGAA 540

GGCGAATTTG AACAATACGA ATTAAATGCG GATAAAAATG GATACATATC CGGCAAAAAG 600

GTAAGGGCGT TTAAAATGAA TTCTCAGACA GAAGGGATGG CAGCAGACGA TGAATACGGC 660

AGTCTTTATA TCGCAGAAGA AGATGAGGCC ATCTGGAAGT TCAGCGCTGA GCCGGACGGC 720

GGCAGTAACG GAACGGTTAT CGATCGTGCC GACGGCAGGC ATTTAACCCC TGATATTGAA 780

GGACTGACGA TTTACTACGC TGCTGACGGG AAAGGTTATC TGCTTGCATC AAGCCAGGGT 840

AACAGCAGCT ACGCGATTTA TGAAAGACAG GGACAGAACA AATATGTTGC GGACTTTCAG 900

ATAACAGACG GGCCTGAAAC AGACGGCACA AGCGATACAG ACGGAATTGA CGTTCTGGGT 960

TTCGGGCTGG GGCCTGAATA TCCGTTCGGC CTTTTTGTCG CACAGGATGG AGAAAATATA 1020

GATCACGGCC AAAAAGTGAA TCAAAATTTT AAAATGGTGC CTTGGGAAAG AATCGCCGAT 1080

AAAATCGGCT TTCACCCGCA GGTCAATAAA CAGGTTGACC CGAGAAAACT GACTGACAGA 1140

AGCGGAAAAT AA 1152

所述的重组乳酸杆菌在重组表达质粒中，设计并合成的一对特异性引物用于扩增短小乳杆菌的信号肽基因，其引物分别为：

上游引物P3：5’- AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG -3’，PstI位点为CTGCAG；

下游引物P4：5’- CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3’，XbaI位点为TCTAGA。

所述的用于扩增短小乳杆菌(Lactobacillus brevis 1.2028)的信号肽基因，序列为：

ATGCAATCAA GTTTAAAGAA ATCTCTTTAC TTGGGCCTTG CCGCATTGAG CTTTGCTGGT 60

GTTGCTGCCG TTTCAACGAC TGCTTCAGCT 90

更具体的，重组乳酸杆菌含有表达质粒pIlac-sp-phy，重组表达质粒pIlac-amy含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、乳酸杆菌信号肽基因sp、植酸酶基因phy、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery基因，其表达式为：-ori-RBS-lac-sp-phy-RBS-Ery-。

由转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌菌种可以制备成液态、固态产品。

该转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌可以在制备仔猪饲料中应用。

所构建的转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌可以作为一种口服饲料添加剂应用于养猪业。从而可以弥补猪肠道不能分泌植酸酶的不足，而不必添加昂贵的植酸酶制剂，不仅有利于促进饲料原料中的植酸磷的代谢，而且可以减少向饲料中添加无机磷，大大降低了粪尿中磷的残留量，从而有利于保护环境，并能增加养殖的经济效益。此外，宿主菌乳酸杆菌是一种干酪乳杆菌，其本身对动物机体也有益生功能，通过本发明可提供一种人工产中性植酸酶益生基因工程乳酸杆菌，在猪、禽等单胃动物生产中具有重要的应用价值。

本发明的一种转中性植酸酶基因重组乳酸杆菌，其构建方法包括引物设计、枯草芽孢杆菌基因组的提取、植酸酶phy基因的PCR扩增、phy基因与pMD18-T载体的连接与转化、短小乳杆菌L.brevis 1.2028基因组的提取、信号肽SP基因的PCR扩增、sp基因与pMD18-T的连接、sp基因和phy基因的连接、sp-phy基因与表达载体pIlac的连接、重组表达载体pIlac-sp-phy的转化，具体步骤为：

1、引物设计

1.1 植酸酶基因引物设计

利用生物学软件Primer Premier6.0，参照GenBank中GU591658所提供的信息设计一对引物，由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，引物序列如下：

1.2 下游引物P2：5’- CCCGGGTTATTTTCCGCTTCT -3’， SmaI酶切位点为CCCGGG；

1.3 信号肽基因引物设计

利用生物学软件Primer Premier6.0，参考短小乳杆菌L.brevis1.2028的S-层蛋白基因信号肽序列设计一对引物，由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，引物序列如下：

下游引物P4：5’- CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3’，XbaI位点为TCTAGA；

2、枯草芽孢杆菌基因组的提取

将活化的枯草芽孢杆菌培养18h后，取3ml菌液，然后参照北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA 快速提取试剂盒（离心柱型）提取其基因组DNA，方法按使用说明书步骤进行；

3、植酸酶phy基因的PCR扩增

以上述提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增枯草芽孢杆菌的植酸酶基因，反应体系如下：

表1 植酸酶phy基因PCR扩增体系

上游引物(20pM)	1.5μl
		下游引物(20pM)	1.5μl
10×PCR Buffer	5.0μl
		Pyrobest DNA Polymerase (5U/μl)	1.0μl
dNTPs (10pM)	0.25μl
		模板DNA	0.5μl
加灭菌超纯水至	50μl

轻轻混匀，2000×g瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性40s，56℃退火50s，72℃延伸70s，循环35次，最后72℃延伸10min，得到PCR产物，于4℃保存备用；PCR产物可以进行鉴定，例如可以取5μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，以Marker105为对照，观察扩增片段的长度是否约为1152bp，如是，则初步判定为正确；

4、phy基因与pMD18-T载体的连接与转化

将上述鉴定正确的PCR产物按照北京艾德莱生物科技有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行回收，然后再按照大连宝生物有限公司的pMD18-T试剂盒说明进行连接，连接产物的转化按照常规方法将其转化入大肠杆菌JM109中，例如，可以使用J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 最尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版第96页上介绍的方法；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pMD-phy；

5、短小乳杆菌L.brevis 1.2028基因组的提取

方法同步骤2；

6、信号肽SP基因的PCR扩增

以上述提取的基因组为模板，扩增短小乳杆菌的信号肽基因，反应体系如下：

表2 信号肽SP基因PCR扩增体系

轻轻混匀，2000×g瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃预变性5min，95℃变性40s，58℃退火1min，72℃延伸20s，循环35次，最后72℃延伸10min，得到PCR的扩增信号肽SP基因，于4℃保存备用；PCR产物可以进行鉴定，例如可以取5μl PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，以Marker105为对照，观察扩增片段的长度是否约为1152bp，如是，则初步判定为正确；

7、 sp基因与pMD18-T的连接

将上述鉴定正确的PCR扩增信号肽SP基因按照北京艾德莱生物科技有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行回收，然后再按照大连宝生物有限公司的pMD18-T试剂盒说明进行连接，连接产物的转化按照常规方法将其转化入大肠杆菌JM109中，例如，可以使用J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 最尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版第96页上介绍的方法；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pMD-sp。

8、sp基因和phy基因的连接

分别将pMD-phy和pMD-sp用XbaI/SmaI双酶切，回收相应的目的片段，然后按照常规方法将pMD-phy和pMD-sp用核酸内切酶XbaI/SmaI双酶切的回收片段进行连接，具体步骤可以使用J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 最尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版第76页上介绍的方法；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pMD-sp-amy。

9、sp-phy基因与表达载体pIlac的连接

将质粒pMD-sp-phy和质粒pIlac(M J Gosalbes et al. Integrative food-grade expression system based on the lactose regulon of Lactobacillus casei. Applied and Environmetal Microbiology， 2000，66(11)：4822-4828)同时用PstI/SmaI双酶切，按照常规方法进行连接，例如具体步骤可以使用J.萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 最尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版第76页上介绍的方法；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pIlac-sp-phy，获得了重组表达载体。

10、重组表达载体pIlac-sp-phy的转化

10.1 乳酸杆菌感受态细胞的制备

(1) 挑取新鲜平板上的单个菌落，在3ml MRS中培养过夜(16h)；

(2) 以1:50的比例接种于含1.2％甘氨酸的MRS培养液中，37℃孵育4～5h (OD=0.6)；

(3) 冰浴使细菌停止生长，4℃ 6000×g 离心10min；

(4) 无菌条件下弃上清，用冰冷的等体积灭菌10％甘油洗2次，以除去培养基中的离子成分；

(5) 离心去上清，用冰预冷的1／10体积的10％甘油重新悬浮后离心收集菌体；

(6) 用冰预冷的1／100原体积的10％甘油重新悬浮，分装小管，每管50μl，得到乳酸杆菌感受态细胞，-80℃保存备用。

10.2电转化

(1) 将100μl乳酸杆菌感受态细胞与5μl(300～500ng)在冰浴条件下混匀；

(2) 将其加入到冰预冷的0.1cm电转化杯中，冰上放置10min；

(3) 电转化条件：600～2400V(间隔100V)，25μF，100Ω；

(4) 电击后立即加入0.9ml预冷的含10％蔗糖的MRS，转入1.5ml离心管中，37℃孵育2h；

(5) 取200μl涂于含5μg/ml的Ery抗性的MRS平板，并以不含Ery的平板做对照，37℃厌氧培养40h后观察结果，如果抗性平板上能够长出菌落而对照平板不长，则可判为疑似阳性菌落，再做进一步的验证；

10.3 阳性菌株的筛选及鉴定

10.3.1 阳性菌株的筛选

在含有5μg/ml红霉素 (Ery)的MRS培养基上能够生长的即可能为阳性菌落。对疑似阳性的菌落滴种在以植酸钙为底物的培养基平板上，同时以非重组乳酸杆菌为对照，37℃厌氧培养24h后观察降解植酸钙情况，通过菌落周围产生的溶解圈大小初步判断其产酶能力。

10.3.2 阳性菌株基因组的提取

(1) 挑取Ery抗性平板上的单个菌落，接种于5ml MRS培养液中厌氧培养24h；

(2) 取1.5ml菌液于离心管中，8000×g离心3min，弃上清；

(3) 加入400μl Tris.Hcl(0.02mol/L, pH8.0)，充分混匀，离心弃上清；

(4) 加500μl溶菌液(0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris.HCl)，12％PEG20000（聚乙二醇20000），pH8.0)和150μl溶菌酶(100mg/ml)重新悬浮，37℃孵育2h；

(5) 然后6000×g离心5min，收集菌体，加600μl TES液(0.5％十二烷基硫酸钠(SDS), 5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 10mmol/L Tris-HCl, pH8.0)重新悬浮；

(6) 12000×g离心，将上清转移到另一离心管，加入等体积的酚／氯仿抽提，12000×g离心3min;

(7) 将上清转移至另一离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，置-20℃冰箱中过夜；

(8) 12000×g离心10min，弃上清；

(9) 加入1ml 70％乙醇沉淀DNA，室温静置10min；

(10) 12000×g离心10min，弃上清，干燥后，加入含有10μg/mL RNA酶(RNase)的Tris缓冲液(TE) 20μl，-20℃保存备用。

10.3.3 阳性菌株的PCR鉴定

以抽提的重组阳性乳酸杆菌的基因组DNA为模板，分别以P1和P2、P3和P4、P1和P4为引物进行PCR，条件同步骤3和6；

10.4 融合蛋白在乳酸杆菌中的表达

10.4.1 样品的准备

(1) 接种L.casei转化子单菌落于4ml MRS(含5μg/mL Ery)培养基中，37℃厌氧培养过夜；

(2) 按1：100的比例，将新鲜菌液接种于MRS(含5μg/mL Ery)液体培养基中，37℃厌氧培养8h至OD600=0.5；

(3) 加入乳糖至终浓度为0.5mg/mL；

(4) 继续培养24h取样，于4℃ 12000×g离心5min，弃沉淀；

(5) 加入100μl脱氧胆酸盐三氯乙酸(DOC-TCA)，混匀；

(6) 将蛋白质在冰浴中沉淀30min；

(7) 10000×g离心5min，弃上清并用吸管吸净残留液；

(8) 加入200μl乙醇-乙醚(1：1)洗涤TCA沉淀的蛋白质；

(9) 将沉淀再悬浮于50～100μl 20mM Tris-HCl(pH6.0)重新悬浮；

(10) 往样品中加入1/5体积的5×上样缓冲液混合，100℃煮沸5min，置冰上冷却。

10.4.2 表达产物的SDS-PAGE检测

参照《分子克隆实验指南》(第三版第1453页）介绍的实验方法进行操作。

(1) 按照Bio-Rad公司Mini-Protean3电泳仪使用说明书装配好灌胶用的模具；倒分离胶，加入10％的分离胶至约距前玻璃板顶端1.5cm，沿玻板边缘轻轻加入约1cm高的水饱中异丁醇，室温下聚合约30min；

(2) 倒浓缩胶，吸干水层，加入5％的浓缩胶，并插入样品梳，室温下聚合约20min，取出样品梳，用蒸馏水冲洗加样孔槽后，加入电泳缓冲液；

(3) 加样，将沉淀的蛋白加入5倍样品缓冲液，混匀后，100℃沸水浴8min，以10000×g离心2s，每孔加入25μl样品；

(5) 电泳，接通电源，70V恒压电泳至溴酚兰进入分离胶后，电压改为150V，直至指示剂移至接近胶底约1cm时停止电泳；

(6) 蛋白染色，取出凝胶后，置于大平皿中用蒸馏水漂洗2～3次，加入考马斯亮蓝R-250染色液，在摇床上缓慢震荡5min，弃去染液，用蒸馏水漂洗数次；

(7) 脱色，往平皿中加入考马斯亮蓝脱色液，作用1h后，更换脱色液，直到蛋白条带清晰为止；

(8) 采用Bio-Rad公司凝胶成像系统成像，并利用分析软件Gel Doc2000(Quantity One)进行分析处理；

(9) 将成像后的凝胶小心放在两张玻璃纸夹层中，置于干胶仪中干胶2h后保存。

10.4.3 表达产物的纯化与验证

10.4.3.1重组蛋白的浓缩

(1) 将重组菌按1％接种于100ml MRS培养液中，诱导培养20h；

(2) 于4℃ 6000×g离心8min，收集上清；

(3) 在缓慢搅拌下加入150ml 50％的PEG6000(w/v溶于蒸馏水)；

(4) 继续搅拌30～60min，至完全沉淀为止；

(5) 10000×g离心10min，弃上清；

(6) 用1～2倍沉淀体积的0.01mol/L(pH7.4)的PBS悬浮沉淀；

(7) 于4℃透析48h，中间换透析液5～6次；

(8) 于4℃ 15000×g离心20min，弃沉淀，上清液部分透析48h，期间换透析液5～6次。

10.4.3.2浓缩产物的柱层析

(1) 倾去Sepharose 4B介质中的乙醇，用2倍体积的的0.05M Tris-HCl(pH8.0)洗三次，用玻棒将介质缓慢导入层析柱中，接通管道，用2倍体积的0.05M Tris-HCl(pH8.0)洗脱；

(2) 吸出介质表面的缓冲液，沿管壁缓慢加入浓缩的重组蛋白，待液体完全进行介质后，补缓冲液至离介质表面有2cm左右，盖上进水口的盖子，调整流速至0.7ml/min；

(3) 将收集各峰的洗脱液装入透析袋中，用PEG6000浓缩至适当的体积，收集浓缩液，于-20℃保存。

10.4.3.3 纯化产物的验证及酶活测定

(1)植酸酶的准备精确吸取重组乳酸杆菌上培养上清样品两份，置于100mL容量瓶中，加入约70mL乙酸缓冲液（Ⅰ），一个磁力棒，在磁力搅拌器上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液（Ⅰ）定容至刻度（减去磁力棒的体积）。摇匀，在离心机上以4000转／min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液（Ⅰ）稀释，使样液浓度保持在0.4U/mL左右，待反应。

(2)标准曲线绘制准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(Ⅰ) 溶解，并定容至100m L，浓度为50.0mmol /L。按表3的比例稀释成不同浓度，与试样一起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y=Kx+b)

表3 配置不同浓度的磷溶液

标准序号	稀释量/mL	浓度/(mmol/L)
			1	0.5→1	25
2	0.5→2	12.5
			3	0.5→4	6.25
4	0.5→8	3.125
			5	0.5→16	1.5625

按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃保温30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表4。

表4 标准曲线制作程序

反应顺序	样品，标准	样品空白	标准空白
				1乙酸缓冲液（Ⅰ或Ⅱ）（ml）	1.8	1.8	2.0
2加入待反应液	0.2	0.2	0.2
				3 混合	√	√	√
4 37℃预热5min	√	—	—
				5依次加入底物（ml）	4	4（第二步）	4（第二步）
6 混合	√	√	√
				7 37℃水解30min	√	—	—
8依次加入终止液	4	4（第一步）	4（第一步）
				9混合	√	√	√
总体积（ml）	10	10	10

(3) 样品测定反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4000转／min离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A－A0为实测吸光值。用直线回归方程计算样品植酸酶的活性。

(4) 结果计算和表示

植酸酶活性U按下式计算：

U=K×(A-A₀) ×F/(S×m×30)

其中：U—样品植酸酶活性，U/g；

K—标准曲线斜率；F—样品溶液反应前的总稀释倍数；S—样品测试量；表2中S＝0.2ml；m—试样质量(g)；30—反应时间(min)。两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。允许差：同一样品两个平行测定值的相对偏差不大于8%。

通过采用上述技术方案，本发明制备的乳酸杆菌可以：

(1) 提高饲料中磷的利用率，减少环境污染饲料原料中的磷以植酸磷的形式存在，而猪、禽等单胃动物本身不产植酸酶，且消化道内也缺乏能分解消化植酸磷的微生物，所以饲料中的磷绝大部分都被排泄出来了，一是造成了极大的浪费；二是大量的磷直接排放又造成了对土壤和水的污染。植酸酶是专一分解植酸盐的一种酶，饲料中添加产植酸酶的重组乳酸杆菌能大大提高饲料中磷的利用率。

(2) 缓解磷资源缺乏磷又是动物生长必须的物质之一，如果饲料中缺乏磷，会导致畜禽生长发育迟缓、骨骼和牙齿发育不良、动物生产性能降低等不良后果，所以又必须向饲料中添加无机磷，但是世界上尤其是我国的磷矿资源又很缺乏，所以在饲料中使用植酸酶能减少向饲料中添加无机磷，从而缓解矿产资源不足的现状。

(3) 增加钙、锌、铜和铁等的生物利用率，促进碳水化合物的吸收植酸盐能通过螯合作用还可降低动物对锌、锰、铁、钙、钾等主要微量元素的利用率，通过与蛋白质结合成植酸复合体而降低动物对蛋白质的消化吸收率，从而使整个饲料的利用率降低，产植酸酶重组乳酸杆菌的使用可以解决这一问题。

(4) 降低饲料成本，增加效益为了保证动物的健康，无论是向饲料中添加无机磷或植酸酶都将增加饲料或养殖的成本，而本研究是向饲料中添加高产植酸酶的重组乳酸杆菌，从经济效益的角度计算可降低生产的成本，提高生产性能，增加经济效益。

附图说明

图1是中性植酸酶phy基因的PCR扩增图。

图中，泳道1是阴性对照；泳道2-4是PCR产物；泳道5是DGL2000 Marker。

图2是质粒pMD-phy PCR和酶切鉴定图。

泳道1是Mark105；泳道2是质粒PCR产物；泳道3是XbaI/SmaI双酶切；泳道4是SmaI

图3是短小乳杆菌L.brevis 1.2028信号肽基因PCR图。

图中，泳道1是PCR产物；泳道2是Land100 Marker。

图4是质粒pMD-sp酶切鉴定图。

泳道1是XbaI单酶切；泳道2是XbaI/PstI双酶切；泳道3是DL2000 Marker。

图5 是质粒pMD-sp-phy酶切鉴定图。

泳道1是λDNA/HindIII Marker；泳道2是PstI单酶切；泳道3是PstI/SmaI双酶切；泳道4是DL2000 Marker。

图6是重组表达质粒pIlac-sp-phy酶切鉴定图

图中，泳道1是Marker；泳道2是PstI单酶切；泳道3是PstI/SmaI双酶切。

图7 是重组乳酸杆菌PCR验证图。

图中，泳道1是DL2000 Marker；泳道2是P1+P4 PCR产物；泳道3是P1+P2 PCR产物；泳道4是P3+P4 PCR产物

图8 是重组乳酸杆菌表达蛋白SDS-PAGE图。

泳道1是pIlac-sp-amy重组乳酸杆菌菌体裂解产物；泳道2是pIlac重组乳酸杆菌表达上清产物；泳道3是pIlac-sp-phy重组乳酸杆菌表达上清产物；泳道4是标准蛋白质Marker。

图9 是重组乳酸杆菌平板验证图。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明的保护范围。

实施例1：分泌表达中性植酸酶的重组乳酸杆菌的构建

1．中性植酸酶基因的克隆

以枯草芽孢杆菌基因组为模板，以P1和P2为引物扩增phy基因(见附图3)，在约1150bp处有一条特异条带。纯化的产物与pMD18-T连接，获得质粒pMD-phy，其酶切鉴定和PCR鉴定结果见附图4(XbaI/SmaI双酶切可产生一条约2700bp和一条约1150bp的条带、SmaI单酶切可产生一条约3850bp的条带)。

2．短小乳酸杆菌信号肽sp基因的克隆

以短小乳酸杆菌L.brevis1.2028基因组为模板，以P3和P4为引物扩增sp基因(见附图5)，在约90bp处有一条特异条带。纯化的产物与pMD18-T连接，获得质粒pMD-sp，其酶切鉴定和PCR鉴定结果见附图6(PstI/XbaI双酶切可产生一条约2700bp和一条约90bp的条带、XbaI单酶切可产生一条约2790bp的条带)。

3. 重组乳酸杆菌表达载体的构建

分别将质粒pMD-phy和质粒pMD-sp用XbaI/SmaI进行酶切连接，获得pMD-sp-phy质粒(见附图7)，再将质粒pMD-sp-phy和质粒pIlac用PstI/SmaI进行酶切连接，获得pIlac-sp-phy质粒(见附图8)。

4. 重组质粒pIlac-sp-phy电转化乳酸杆菌

将重组质粒pIlac-sp-phy在600～2400V(间隔100V)，25μF，100Ω条件下进行电转化，在Ery抗性平板上筛选到阳性菌落，按照阳性菌基因组试剂盒抽提方法抽提重组乳酸杆菌的基因组，采用PCR法验证phy基因是否整合到了乳酸杆菌基因组上，其结果见附图9，用引物P1和P2可以扩增到一条大约1150bp的条带，用引物P3和P4能够扩增到一条约90bp的条带，用引物P1和P4能够扩增到一条约1240bp的条带。表达的特异性蛋白结果见图10，通过表达上清进行SDS-PAGE电泳发现，重组乳酸杆菌表达上清液在约41.8kDa处有一特异性条带，而对照组没有。为了证明表达蛋白的活性，分别采用了以植酸钙为底物的平板培养，然后以稀碘液染色，由图11可以明显的看出，重组乳酸杆菌比空载体重组乳酸杆菌具有较强的分解植酸钙的能力。同时通过标准的植酸酶活力测定法(GB/T 18634-2002)测定了重组乳酸杆菌培养上清的酶活力，上清中的植酸酶平均酶活力可达2253 U/ml。

实施例2：本发明的重组乳酸杆菌对猪生产性能的影响实验

1. 试验动物的选择、分组及饲养管理

试验在同一栋双列封闭式猪舍内进行，均采用自由采食和饮水方式。

选用90头20kg左右杜×长×大三元杂交生长猪，公母各半，按常规去势、防疫。记录初重，随机分成3组,每组3个重复，每个重复10头猪。各组处理分别如下：I组(对照组)，基础日粮＋0.10％次粉；II组(非重组乳酸杆菌组)：基础日粮(去除30％的磷酸氢钙)＋0.10％的非重组乳酸杆菌制剂(其中30％的磷酸氢钙用15％的碳酸钙+15％的麸皮代替，下同)；III组(重组乳酸杆菌组)：基础日粮(去除30％的磷酸氢钙)＋0.10％的重组乳酸杆菌制剂。试验期：70天。

2.饲粮组成及营养水平

表5 基础饲粮组成及营养水平

原料组成	含量	营养水平	含量
				玉米	64.80	消化能DE(MJ/kg)	13.29
豆粕	25.50	粗蛋白CP/％	18.35
				麦麸	4.50	粗纤维CF/％	3.08
鱼粉	2.00	钙Ca/％	0.72
				石粉	0.50	总磷TP/％	0.69
磷酸氢钙	1.40	有效磷AP/％	0.32
				食盐	0.30	赖氨酸Lys/％	0.90
预混料	1.00	蛋氨酸Met/％	0.30
				合计	100.00		1.00

注：预混料为每千克饲粮提供：VA 4400IU，VD3 2200IU，VE 20IU，VK 3.0mg，VB1 2.0mg，核黄素6.0mg，VB12 0.03mg，叶酸0.3mg，生物素4.5mg，烟酸25mg，D-泛酸15mg，胆碱500mg，Zn 130mg，Fe 120mg，Cu 10mg，I 0.3mg，Se 0.3mg

3．测定指标

3.1 生产性能

分别于试验的第1、50、70天早晨8：00空腹个体称重(前一天晚上6：00停料)，每次试验结束后，以栏为单位记录料量，计算各生长期的日增重、日采食量及料重比。结果见表6和表7。

3.2 饲料中钙磷消化率和粪尿中的钙、磷残留量

饲料和粪尿中的钙用高锰酸钾法测定，饲料和粪尿中的磷用钼黄比色法测定。结果见表8和表9。

用内源指示剂干燥、磨碎的样本。法测定相应钙和磷的消化率：

(1) 在500ml三角瓶中称取1g加入10ml 4N HCl，在电热板上慢慢加热30min；

(2) 用快速定量滤纸过滤，然后用热蒸馏水(85～100℃)洗涤至无酸性。再将残渣连同滤纸一起加入到已知重量的坩埚内，在650℃高温炉内灼烧6h；

(3) 灰化后，坩埚移入干燥器内冷却，称重；

(4) 计算：4NHCl不溶灰分=(坩埚+灰分-坩埚)／样本重×100％。饲料营养物质消化率=100％-(饲料中指示剂含量／粪中指示剂含量)×(粪中养分含量／饲料中养分含量)×100。

4. 重组乳酸杆菌在仔猪促生长中的检验

4.1 重组乳酸杆菌制剂的制备

将重组乳酸杆菌接种到MRS培养基(蛋白胨 10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾 2g，乙酸钠 5g，柠檬酸二铵 2g，葡萄糖 20g，吐温-80 1ml，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.4H2O 0.25g，琼脂粉15g，水1000ml，调pH6.2～6.4，15磅 121℃灭菌15min)，厌氧培养36h，加入次粉按照1：1的比例混匀，40℃烘干，然后包装。并对样品进行乳酸杆菌计数，产品中的有效活菌数为1.76×10⁹个。

4.2 动物试验

选用90头20kg左右杜×长×大三元杂交生长猪，公母各半，按常规去势、防疫。记录初重，随机分成3组,每组3个重复，每个重复10头猪。各组处理分别如下：I组(对照组)，基础日粮＋0.10％次粉；II组(非重组乳酸杆菌组)：基础日粮(去除30％的磷酸氢钙)＋0.10％的非重组乳酸杆菌制剂(其中30％的磷酸氢钙用15％的碳酸钙+15％的麸皮代替，下同)；III组(重组乳酸杆菌组)：基础日粮(去除30％的磷酸氢钙)＋0.10％的重组乳酸杆菌制剂 (详见实施例2)。

表6 0-49天不同处理对猪生产性能的影响

	始重(kg/头)	日增重(g)	日采食量(g)	料肉比
					I	18.42±0.92	392.12±88.36^a	1062.32	2.71^a
II	17.88±1.37	411.91±147.48^a	1006.95	2.45^a
					III	18.05±1.33	428.26±120.30^a	1018.64	2.38^a

注：同行肩标大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05），下同。

表7 50-70天不同处理对猪生产性能的影响

	日增重(g)	日采食量(g)	料肉比
				I	613.35±183.24	1722.53^a	2.81^a
II	658.94±258.72	1592.36^a	2.42^a
				III	689.44±192.17	1770.73^a	2.57^a

表8 饲料磷钙消化率

	磷的消化率	钙的消化率
			I	65.13±6.59^aA	70.90±8.01^aA
II	59.55±10.4^bB	47.11±20.60^bB
			III	86.78±5.18^C	92.01±2.50^C

表9 粪中磷、钙残留量

Claims

1.一种转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其特征是：该转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌是将a-淀粉酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体pIlac的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌L.CECT5276的核糖体结合位点中获得的产品；所述的α－淀粉酶基因来源于GenBank上的登陆号为GU591658的淀粉液化芽孢杆菌，所用于扩增的序列是1-1545bp位碱基；信号肽基因来源于在GenBank上的登陆号为Z14250的短小乳酸杆菌L.brevis1.2028 ，所用于扩增的序列是260-349bp位的碱基。

2.根据权利要求1所述转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌，其特征是：所述的重组乳酸杆菌含有表达质粒pIlac-sp-amy，重组表达质粒pIlac-sp -amy含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、乳酸杆菌信号肽基因(signal peptide,sp)、淀粉酶基因(amylase, amy)、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery(erythromycin, Ery)基因，其表达式为：-ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-。

3.权利要求1所述转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌菌种发酵形成的液态、固态产品。

4.权利要求1所述转芽孢杆菌源a-淀粉酶基因重组乳酸杆菌在制备仔猪饲料中的应用。