CN1533430A - 能生产果聚糖的乳杆菌属菌株及其在人类或宠物食品中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能产生果聚糖的旧金山乳杆菌的分离的和纯化的菌株，涉及制备所述果聚糖的方法，并且涉及将所述果聚糖和/或能生产所述果聚糖的菌株用于各种人类或宠物食品或化妆品中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及生产的主要多糖为果聚糖的乳杆菌属菌株，及其在各种人类或宠物食品中的用途或用于制备人类或宠物食品的用途。本发明还涉及生产果聚糖的方法。
发明背景
由植物(纤维素、果胶或淀粉)、海藻(藻酸盐和角叉菜胶)和细菌(藻酸盐、吉兰胶和呫吨胶)生产的多种高分子量多糖，可以在食品和非食品工业中用作增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂或水结合剂。所有这些多糖都是添加剂，因此，在食品工业中它们被认为不是很必要的。
果聚糖(又被称为β-(2→6)-D-果糖或β-(2→6)-D-果聚糖或β-(2→6)-D-呋喃果聚糖或β-(2→6)-D-Fruf或植物中的phleins)是覆盖宽的分子量范围(大约2kDa至大约60MDa)的D-呋喃果糖的天然同多糖。低分子量果聚糖在植物中是作为碳水化合物储存物质生产的(Vandamme，B.J.，和Derycke，D.G.(1983)Adv.Appl.Microbiol.，29：139-176)。在这种情况下的分子结构是β-(2→6)-果糖的短的线性链。包括从与植物相关的细菌，到土壤杆菌、牙齿噬斑杆菌、酵母和真菌的若干种类型的微生物也能产生果聚糖(Han，Y.W.，(1990)Adv.Appl.Microbiol.，35，171-194)：醋杆菌属、放线菌属、气杆菌属、曲霉属、芽孢杆菌属、棒杆菌属、欧文氏菌属、明串珠菌属、假单胞菌属和链球菌属等。在微生物中，果聚糖具有较高的分子量，并且除了植物果聚糖中所存在的β-(2→6)键之外，还存在由β-(2→1)键形成的大量分支。
乳酸菌在美国是具有GRAS(一般被认为是安全的)资格的食品级生物，并且已知能产生多种外多糖(exopolysaccharide)分子(Cerning，J.(1990)FEMS Microbiol.Rev.87：113-130；Dunican，L.K.和Seeley，H.W.(1965)J Gen.Microbiol.40：297308)，这些分子决定了发酵乳制品的质地。来自所述细菌的外多糖可以开发出新一代的食品级多糖。
实际上，目前正在深入研究包括乳杆菌属在内的乳酸菌的杂多糖合成(Cerning，J.(1990)FEMS Microbiol.Rev.87：113-130；Grobben，G.J.，等，(1995)J.Appl.Bacteriol.79：103-107；Stingele，F.等，(1996)，R Bacteriol.178：1680-1690和van denBerg，D.J.C.等，(1995)Appl.Environ.Microbiol.61：2840-2844)。
另外，主要在肠膜明串珠菌(NO 6055)和链球菌属中研究了同多糖的合成(例如葡聚糖和果聚糖的合成)(Cerning，J.(1990)FEMSMicrobiol.Rev.87：113-130)。可以获得的有关乳杆菌属中同多糖生物合成的信息有限(Dunican，L.K.和Seeley，H.W.(1965)J：Gen.Microbiol.40：297-308；Pidoux，M.等，(1990)J；Appl.Bacteriol.69：311-320)。
最近，G.van Geel-Schutten等业已鉴定了路氏乳杆菌LB 121的一个菌株，这种菌株能合成具有葡萄糖和果糖的水溶性外多糖材料，并且进一步表征了上述葡聚糖和果聚糖外多糖(van Geel-Schutten，G.H.，等，(1999)，Appl.Environ.Microbiol.65：3008-3014)。
因此，感兴趣的提供能产生果聚糖(fructans)，特别是果聚糖(levan)的乳杆菌属的其他菌株，特别是除了路氏乳杆菌以外的菌株，并且这种菌株对于食品工业来说具有很高的价值。
发明概述
因此，在第一方面，本发明的目的是提供一种分离的和纯化的乳杆菌属菌株，特别是来自物种旧金山乳杆菌，它产生的主要多糖为果聚糖。
业已惊奇地发现，最初被用于传统面团发酵的旧金山乳杆菌能产生果聚糖和少量的葡萄糖聚合物。
所述旧金山乳杆菌菌株优选是保藏号为CNCM I-2588的旧金山乳杆菌NCC 2729或保藏号为CNCM I-2589的旧金山乳杆菌NCC 2731或保藏号为CNCM I-2613的旧金山乳杆菌NCC 2733。
本发明还涉及一种由旧金山乳杆菌生产果聚糖的方法，其中：
-用所述菌株的预培养物接种含有蔗糖的培养基，
-使其在25-35℃下发酵12-48小时，和
-使所得到的培养物的pH值降低到低于4.5，然后添加冷的乙醇，并且在0-10℃下保存6-48小时。
所述培养基优选含有至少0.2％的蔗糖。
本发明还涉及所述多糖和/或所述菌株在各种人类或宠物食品中的用途或用于制备各种人类或宠物食品或化妆组合物的用途。
在一种最优选的实施方案中，来自旧金山乳杆菌的果聚糖可以用作人类或宠物食品中的益生素果聚糖的原位来源。
还可将其用作免疫刺激多糖的来源(P.Z.Allen和W.H.Bowen，(1990)Arch.Oral.Biol.，35，55-62)。
在最后一个方面，本发明涉及至少包括上文所述的高度可溶的果聚糖和/或上文所述的旧金山乳杆菌菌株的人类或宠物食品或化妆组合物。
发明详述
在以下说明书中，使用了以下缩略语：GRAS，一般认为是安全的；HMBC，异核多键相关；PEP-HSQC，保留异核单量子相干中的等同途径；NMR，核磁共振；NOESY，核欧沃豪斯效应谱测量；RAPD-PCR，随机扩增的多态DNA聚合酶链式反应；TOCSY，全相关谱测量；TPPI，与时间成正比的相增量。
最后，“NCC”表示雀巢培养物保藏中心(雀巢研究中心，Vers-chez-les-Blanc，Lausanne，瑞士)。
根据第一方面，涉及能产生果聚糖的旧金山乳杆菌的分离的和纯化的菌株。
实际上，业已惊奇地发现，最初被用于传统面团发酵的旧金山乳杆菌能产生高度可溶的含有果糖的碳水化合物，特别是果聚糖，和少量的葡萄糖聚合物。
例如，所述旧金山乳杆菌菌株是保藏号为CNCMI-2588的旧金山乳杆菌NCC 2729或保藏号为CNCM I-2589的旧金山乳杆菌NCC 2731或保藏号为CNCM I-2613的旧金山乳杆菌NCC 2733。
尽管果聚糖比菊糖的溶解度更高，其溶解度在低温下是可变的，但是倾向于更低(Han，Y.W.，(1990)Adv.Appl.Microbiol.，35，171-194)。相反，由旧金山乳杆菌产生的果聚糖，即使是在低温下也是高度可溶的。
通过NMR分析由旧金山乳杆菌NCC 2729发酵所生产的果聚糖。主要产物(＞95％)是果聚糖，而次要产物(＜5％)可能是葡聚糖。用源于粘放线菌的特殊果聚糖酶进行的酶促消化证实，由所述菌株所生产的果聚糖具有β-(2→6)键。由来自黑曲霉的菊糖酶的酶促消化所增强的降解作用表明，可能还存在β-(2→1)键。
举例来说，在一种最优选的实施方案中，业已于2000年12月1日将旧金山乳杆菌菌株NCC 2729，NCC 2731和NCC 2733交由国立微生物保藏中心(Institut Pasteur，28 rue du Docteur Roux，F-75024Paris cedex 15，法国)，保藏号分别为CNCM I-2588，CNCM I-2589和CNCM I-2613。
下面提供了有关所述菌株的细节，特别是有关其形态学、糖类发酵和其他方面的细节。
确定成分培养基
为了生长旧金山乳杆菌的菌落，使用了以下培养基：
成分 用量 优选用量
蔗糖 0.2-50g/l 20g/l
胰化蛋白胨 0.2-20g/l 10g/l
酵母提取物 0.2-20g/l 7g/l
柠檬酸二铵 0.1-20g/l 5g/l
乙酸钠(×3，溶于水) 0.1-20g/l 5g/l
磷酸二氢钾×3H2O(×3，溶于水) 0.1-20g/l 2.5g/l
牛肉膏(Lab Lemco powder，粉末) 0.1-20g/l 2g/l
葡糖酸钾 0.1-20g/l 2g/l
半胱氨酸-HCl 0.01-10g/l 0.5g/l
硫酸镁(×7，溶于水) 0.01-10g/l 0.2g/l
硫酸锰(×4，溶于水) 0.01-10g/l 0.1g/l
硫酸铁(×7，溶于水) 0.001-2g/l 0.05g/l
Tween80 0.01-10ml 1ml
最后，通过添加3N KOH将pH值调整到5-6之间，优选5.4。
形态学
旧金山乳杆菌是形状如直棒的革兰氏阳性微生物。它们能在确定成分培养基琼脂平板上形成规则的白色菌落。
在添加＞2％的蔗糖时，所述菌落的大小增加，并出现粘液质的外观。
旧金山乳杆菌是过氧化氢酶阴性的，并且是兼性厌氧菌。
糖的发酵
为了进行糖发酵，旧金山乳杆菌是必须异型发酵。它们能由麦芽糖产生D/L-乳酸(D/L＝40/60)。旧金山乳杆菌对小麦蛋白具有蛋白水解活性，并且能够使若干种复合碳水化合物发酵，包括麦芽糖、葡萄糖和蔗糖。
其他方面
所述旧金山乳杆菌菌株能合成果聚糖多糖。可以通过RAPD PCR鉴定所述菌株，这是一种从各物种生产基因组指纹的方法，对所述物种的待扩增靶序列所知甚少，所述扩增是通过PCR扩增方法扩增DNA片段的菌株特异性阵列(指纹)，使用随机寡核苷酸启动从基因组位点开始的DNA合成，寡核苷酸在所述位点偶然匹配的或者几乎匹配。用这种方法扩增的DNA可用于通过匹配特征性模式，确定物种的相关性。
根据另一方面，本发明涉及用于生产果聚糖的方法，其中，用本发明的旧金山乳杆菌菌株的预培养物接种含有蔗糖的培养基，使其在25-35℃下发酵12-48小时，优选24小时，补充蔗糖。所述培养基优选含有至少0.2％的蔗糖。
在pH值降低到小于4.5之后，收获培养物。为了获得果聚糖，可以将2倍体积的冰冷乙醇添加到上清液中，并且在0-10℃，优选4℃下保存6-48小时，优选15小时，然后可以通过将沉淀物溶解在蒸馏水中，再通过乙醇沉淀来进一步纯化沉淀物中的果聚糖。
为了生长旧金山乳杆菌细菌，并且获得果聚糖，生长可以在上文所述的特定的确定成分培养基(20g/l蔗糖，胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物7g/l，柠檬酸二铵5g/l，乙酸钠(×3，溶于水)5g/l，KH2PO4×3H2O(×3，溶于水)2.5g/l，牛肉膏(Lab Lemco，粉末)2g/l，葡糖酸钾2g/l，半胱氨酸-HCl 0.5g/l，MgSO4(×7，溶于水)0.2g/l，MnSO4(×4，溶于水)0.1g/l，FeSO4(×7，溶于水)0.05g/l，tween 80 1ml，用3N KOH将pH调整到5.4)中进行。
例如，可以干燥含有果聚糖的旧金山乳杆菌培养物上清液，以便提供果聚糖粉末。例如，优选通过冻干、喷雾干燥、冷冻干燥、流化床干燥方法干燥所述培养物。
通过GRAS旧金山乳杆菌菌株所生产的高度可溶的果聚糖可应用于各种领域。
因此，根据另一方面，本发明涉及将所述多糖和/或所述旧金山乳杆菌用于各种人或宠物食品或化妆组合物的用途或用于制备各种人或宠物食品或化妆组合物的用途。
例如，可优选将本发明的多糖用于制备婴儿配方、基于乳的制品、基于谷物的制品、沙拉调料、调味汁、番茄酱、芥末，化妆品，如护肤霜。
在另一种实施方案中，来自旧金山乳杆菌的果聚糖可用作人类或宠物食品中益生素果聚糖的来源。果糖-寡-和多糖(FOS)的主要生物学特征是，当它们到达人类(或哺乳动物)的大肠时，具有选择性地养育双歧杆菌属生长的能力。到目前为止，仅仅披露了β-(2→1)-D-果糖寡-和多聚物，如菊糖是双歧杆菌属产生的，并因此被确定为益生素碳水化合物。为了使果聚糖发酵，来自普通微生物区系的双歧杆菌属必须使用特异的酶，即果糖苷酶。所述微生物酶还能水解β-(2→6)-果糖，使果聚糖作为益生多糖而具有营养价值。最近业已证实，双歧杆菌属能水解β-(2→6)-果糖(Marx等(2000)，FEMS Microbiol.Letters 182，163-169)。
还可将果聚糖用作免疫刺激多糖的来源(P.Z.Allen和W.H.Bowen，(1990)Arch.Oral.Biol.，35，55-62)。
因此，能够以大约0.01％-大约25％，更优选0.1％-20％的用量将本发明的果聚糖用于人类或宠物食品中。在用于化妆品领域时，本发明的果聚糖的用量为大约0.01％-大约5％，更优选0.1％-2％。
可以将本发明的菌株用于人类或宠物食品以及化妆品中，其用量至少为1.105cfu/g，更优选107cfu/g至≥108cfu/g。
最后，本发明涉及至少含有上述多糖和/或上述细菌菌株的人类或宠物食品或组合物。
为了制备所述食品或组合物，可以将按上述方法获得的果聚糖添加到食品或化妆品中，如添加到婴儿配方、骨粉、奶粉、酸奶、番茄酱、蛋黄酱中，例如，在生产期间添加。
宠物食品可以含有来自旧金山乳杆菌的果聚糖和/或旧金山果聚糖菌株作为益生素的来源。然后可以将它用作营养全面的宠物食品或添加剂或治疗剂或饼干。优选在营养全面的宠物食品中含有果聚糖和/或所述菌株。
所述营养全面的宠物食品可以是任何合适形式的；例如干燥形式、半湿润形式和湿润形式。所述宠物食品可以按常规方法生产。除了营养成分之外，所述宠物食品可以含有淀粉来源、蛋白来源或脂质来源的任意一种或多种。例如，合适的淀粉来源为谷类和豆类，如玉米、稻米、小麦、大麦、燕麦、大豆及其混合物。合适的蛋白来源可选自任何合适的动物或植物蛋白来源；例如肉类和骨粉、禽肉粉、鱼肉粉、大豆蛋白浓缩物、乳蛋白和谷蛋白等。合适的脂质来源包括肉类、动物脂肪和植物脂肪。淀粉、蛋白和脂质来源的选择主要是由动物的营养需要、可口性因素和所生产的产品类型决定的。另外，根据需要还可以将各种其他成分添加到干燥食品中，例如糖、盐、调料、佐料、维生素、矿物质、香味剂、和脂肪等。
对于干燥的宠物食品来说，合适的方法是挤出蒸煮。尽管可以使用烘烤和其他合适的方法。在进行挤出蒸煮时，干燥的宠物食品通常是以粗粒形式提供的。如果使用益生素的话，可以在加工之前将所述益生素与干燥的宠物食品的其他成分混合。
在欧洲专利申请号0850569中披露了一种合适的方法。如果使用细菌菌株的话，优选将所述生物包覆在所述干燥宠物食品上或填充在所述干燥宠物食品内。在欧洲专利申请号0862863中披露了一种合适的方法。
对于湿润的食品来说，可以使用披露于美国专利4,781,939和5,132,137中的方法生产模仿的肉制品。还可以使用用于生产厚面包类型产品的其他方法；例如，在蒸汽烤箱中烹制。另外，可以生产长面包形产品，包括乳化合适的肉类材料，以便生产肉乳液，添加合适的胶凝剂，并且在填充到罐或其他容器中之前，对所述肉类乳液进行加热。
作为益生素的果聚糖在所述宠物食品中的最高含量优选为占重量大约的20％；特别是占重量的大约10％。例如，所述益生素可以占宠物食品重量的大约0.1％-大约20％。
提供下面的实施例仅仅是为了说明目的，而不应当被理解成是对本申请主题的限定。所有百分比都是以重量百分比形式提供的，除非另有说明。在实施例前面是附图简述。
附图说明
图1：由旧金山乳杆菌CNCM I-2588生产的果聚糖的结构，具有通过其残基字母代码(A-C)表示的单糖单元。
图2：(上)在2H2O中，在600MHz和67℃下记录的由旧金山乳杆菌CNCM I-2588生产的果聚糖的1D1H NMR谱。所有的β-D-Fruf共振都是通过相应的残基字母代码和编号识别的；(下)旧金山乳杆菌CNCM I-2588生产的果聚糖的PEP-HSQC谱。
实施例
实施例1：测试能产生果聚糖的旧金山乳杆菌菌株
在上文所述的确定成分培养基-琼脂平板上生长菌株(20g/l蔗糖，胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物7g/l，柠檬酸二铵5g/l，乙酸钠(×3，溶于水)5g/l，KH2PO4×3H2O(×3，溶于水)2.5g/l，牛肉膏(Lab Lemco，粉末)2g/l，葡糖酸钾2g/l，半胱氨酸-HCl0.5g/l，MgSO4(×7，溶于水)0.2g/l，MnSO4(×4，溶于水)0.1g/l，FeSO4(×7，溶于水)0.05g/l，tween 80 1ml，用3N KOH将pH调整到5.4)。
然后在液体特殊培养基中生长达到粘稠外观的菌株，然后在25-35℃下发酵12-48小时，优选24小时。在pH值降低到小于4.5时，收获培养物。为了获得果聚糖，将2倍体积的冰冷乙醇添加到上清液中，并且在0-10℃，优选4℃下保存6-48小时，优选15小时，然后通过将沉淀物溶解在蒸馏水中并且用乙醇使果聚糖沉淀而进一步纯化沉淀物。
旧金山乳杆菌是直棒形状的，并且能在确定成分培养基琼脂平板上形成规则的白色菌落。
在添加＞2％的蔗糖时，所述菌落的大小增加，并且出现粘液质的外观，可以对它进行肉眼鉴定。
为了进行糖类发酵，旧金山乳杆菌必须进行异型发酵。它们能由麦芽糖产生D/L-乳酸(D/L＝40/60)。旧金山乳杆菌对小麦蛋白具有蛋白水解活性，并且能够发酵若干种复合碳水化合物，包括麦芽糖，葡萄糖和蔗糖。
所述旧金山乳杆菌菌株CNCM I-2588和CNCM I-2589能合成果聚糖多糖。可以通过RAPD PCR鉴定所述菌株，这是一种从各物种生产基因组指纹的方法，对所述物种的待扩增靶序列所知甚少，所述扩增是通过PCR扩增方法扩增DNA片段的菌株特异性阵列(指纹)，使用随机寡核苷酸启动从基因组位点开始的DNA合成，寡核苷酸在所述位点偶然匹配的或者几乎匹配。用这种方法扩增的DNA可用于通过匹配特征性模式，确定物种的相关性。
实施例2：由旧金山乳杆菌CNCM I-2588所生产的多糖的结构分析
所述鉴定是通过单糖分析、核磁共振谱测量(NMR)和酶促消化进行的。
单糖分析
由旧金山乳杆菌CNCM I-2588生产的多糖的定量单糖分析是在软酸水解(2N三氟乙酸，60℃，在30分钟和1小时采集的样品)之后通过高效阴离子交换(HPAE)层析借助于脉冲电流检测(PAD)进行的。为了避免降解果糖单糖单元(降解成甘露糖和葡萄糖)，低温水解条件是必需的。
以上分析发现了＞95％的果糖的存在和痕量葡萄糖的存在。
NMR谱测量
将5mg由旧金山乳杆菌CNCM I-2588生产的多糖溶解在99.96原子％2H2O(Euriso-Top)中。所有实验都是在装有主动屏蔽的脉冲场z-梯度倒三角共振探头的三通道Bruker DRX 600MHz波谱仪上记录的。化学位移是参考外部[13C-1]-葡萄糖的α-端基异构信号，以ppm形式提供的(对于H-1来说是δ6H-1 5.15，而对于C-1来说是δC- 192.90)。
相敏感性二维实验是用TPPI记录的(Marion，D.等，(1983)Biochem.Biophys.Res.Commun.113，967-974)：混合时间为15毫秒和90毫秒的TOCSY(Braunschweiler，L.等，(1983)J.Magn.Reson.53，521-528)，混合时间为50毫秒和200毫秒的NOESY(Jeener，J.等，(1979)J Chem。Phys.11，45464553；Anil Kumar，Ernst，R.R.等(1980)Biochem.Biophys.Res.Commun.95，1-6)，和梯度敏感性增强的1H-13C异核单量子相干(PEP-HSQC)(Kay，L.E.，等(1992)J.Am.Chem.Soc.114，10663-10665)。为了确定糖苷键，记录了幅度模式梯度过滤的50毫秒1H-13C HMBC(Bax，A.等(1986)J.Am.Chem.Soc.108，2093-2094)。
获得了以下复合点数目(F1，F2)：256×1024(TOCSY和NOESY)，512×1024(HSQC)和256×4096(HMBC)，平均超过14次扫描(TOCSY，HSQC)或64次扫描(NOESY，HMBC)。使用1800Hz×1800Hz(TOCSY和NOESY)或3020Hz×1800Hz(HSQC和HMBC)的谱宽度(ω1，ω2)。在所有场合下都使用90度位移的方形正弦波，具有1次零填充。所有数据都是用Bruker XWINNMR 2.6软件处理的。
由旧金山乳杆菌CNCM I-2588所产生的多糖的1D1H NMR谱(图2)表现出一组优势质子共振标记的A。大约5ppm的波幅小得多的其他组的共振(总体上比A小5％)是由于葡聚糖的端基异构共振产生的，并且不再作进一步的鉴定。
在对所述二维波谱进行分析之后，获得了1H和13C NMR的结果，并且将这些结果归纳在表1中。
表1在67℃下，在2H2O中测定的由旧金山乳杆菌CNCM I-2588生产的多糖的1H和13C NMR化学位移。表中的值是以相对外部[13C-1]葡萄糖的ppm形式提供的(δH-1(α)5.15和δC-1(α)92.90)。
| H-1a H-1b H-3 H-4 H-5 H-6a H-6bC-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 | |
| A →6)-β-D-Fruf-(2→ | 3.73 3.70 4.17 4.08 3.94 3.88 3.6261.7 105.2 78.0 76.6 81.2 64.4 |
| B →1，6)-β-D-Fruf-(2→ | 3.73 3.70 4.18 4.07 3.94 3.90 3.6361.7 105.2 78.3 76.4 81.2 64.3 |
| C β-D-Fruf-(2→ | 3.73 3.70 4.18 4.08 334 3.87 3.7761.7 105.2 78.3 76.4 81.2 62.2 |
由旧金山乳杆菌CNCM I-2588生产的多糖的1H结果是通过追踪所记录的TOCSY和NOESY谱中的所有迹线获得的。13C共振是从PEP-HSQC谱获得的，C-2共振除外，C-2是季碳原子，预计在PEP-HSQC中它不能产生信号，该结果是通过其与H-1和H-3的长范围的标量偶联从HMBC光谱获得的。
含量最丰富的残基A的身份相当于β-D-Fruf单糖单元的化学位移(van Geel-Schutten，G.H.等，(1999)，Appl.Environ.MicrobioL65：3008-3014)。含量较少的残基B和C相当于强度较小的NMR峰，还相当于具有不同取代的β-D-Fruf单糖单元(表1，J.W.Timmermans等，(1993)，Carbohydr.Res.243：379-384)。PEP-HSQC峰的综合提供了对不同种的比例的相当精确的描述。从(C-6，H-6)亚甲基交叉峰可以看出，A+B：C为5.5：2，而从(C-1，H-1)亚甲基交叉峰可以看出，A+B+C＝6.7。另一方面，(C-i，H-i)交叉峰的i＝3，4，5，表明A+B+C＝4.1。由以上结果可以得出这样的结论，所述重复单元具有两个无分支的Fruf，一个分支点Fruf和一个末端Fruf。其结构如图1所示。
不过，其取代形式是难以确定的，因为在对1或2号位置进行糖苷取代之后，质子或碳化学位移没有发生显著变化(J.W.Timmermans等，(1993)，Carbohydr.Res.243：379-384)。对于6号位置上的取代来说，碳化学位移大于64ppm，而对于未取代过的C-6来说，碳化学位移在大约63ppm左右。NOESY和HMBC数据的作用很小，因为在同多糖上常见的情况是残基内转移与可能的残基间转移重叠。在缺乏甲基化分析数据的情况下，可以推断所述取代位于1、2和6号位置上。
酶促消化
用来自粘放线菌的特异性果聚糖酶进行的酶促消化表明，由所述菌株生产的果聚糖具有β-(2→6)键。由来自黑曲霉的菊糖酶的酶促降解增强降解作用，表明可能还存在β-(2→1)键。
总之，根据化学单糖分析和NMR谱，可以将由旧金山乳杆菌CNCMI-2588分泌的多糖的重复单元的结构确定为→6)-β-D-Fruf-(2→6)-[β-D-Fruf(2→1)-]-β-D-Fruf-(2→6)-β-D-Fruf-(2→，并且如图1所示。
实施例3：本发明果聚糖的制备
在25-35℃下，在确定成分培养基(20g/l蔗糖，胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物7g/l，柠檬酸二铵5g/l，乙酸钠(×3，溶于水)5g/l，KH2PO4×3H2O(×3，溶于水)2.5g/l，牛肉膏(Lab Lemco，粉末)2g/l，葡糖酸钾2g/l，半胱氨酸-HCl 0.5g/l，MgSO4(×7，溶于水)0.2g/l，MnSO4(×4，溶于水)0.1g/l，FeSO4(×7，溶于水)0.05g/l，tween 80 1ml，用3N KOH将pH调整到5.4)上生长24小时之后，收获培养上清液(在消耗蔗糖之后)，并离心(10分钟，1000g，4℃)，以便除去细胞。
然后，添加1倍体积的冰冷乙醇。搅拌并且在4℃下冷却15小时，然后通过离心(30分钟，15000g，4℃)回收沉淀的细胞外多糖。
将沉淀物溶解在蒸馏水中，再次收获，并且向上清液中添加1倍体积的乙醇(在4℃下保存15小时)。在离心之后(27000xg，25分钟)，将沉淀物溶解在蒸馏水中，并且用脱矿质水透析2天(截断分子量12000-14000Da)并且冷冻干燥。
实施例4：本发明果聚糖的制备
制备本发明果聚糖的另一种方法如下。通过果聚糖-蔗糖酶合成果聚糖。业已证实这种酶是一种细胞表面蛋白。发现果聚糖-蔗糖酶活性与细胞表面相关。在含有1％葡萄糖和1％蔗糖的培养基中生长之后，通过离心回收细胞，用盐溶液洗涤，并且在25℃或37℃的温度下在pH5.2的50mM乙酸钠，200mM蔗糖和50mg/LCaCl2，2H2O，叠氮化物0.1％中培养。24小时之后，通过离心分离细胞。用所述方法在冰冷乙醇中沉淀上清液，并且将不溶性沉淀物溶解在蒸馏水中。用水充分透析，然后在50℃下用0.5N TFA水解含有所述多糖的溶液30分钟。仅发现果糖是单糖。该实验证实仅仅使用细胞沉淀可以在含有蔗糖的缓冲溶液中合成果聚糖。
研究了温度对细胞生长的影响以及温度对多糖在乙酸缓冲液中的合成的影响。下面的表格表明，在25℃下生长的细胞获得了最佳果聚糖产量。
表：温度对细胞生长的影响和温度对多糖在乙酸缓冲液中的合成的影响(在将样品稀释10倍之后通过苯酚/硫酸测定，测定在485nm波长下的吸收值)
| 合成温度 | 生长温度 | |
| 25 | 30 | |
| NCC 2729 | ||
| 25 | 0.529 | 0.465 |
| 30 | 0.48 | 0.41 |
| NCC 2731 | ||
| 25 | 0.547 | 0.275 |
| 30 | 0.655 | 0.29 |
实施例5：旧金山乳杆菌菌株在乳制品中的应用
将本发明的菌株旧金山乳杆菌CNCM I-2588、CNCM I-2589或CNCMI2613用于生产发酵的酸奶样乳制品。
为此，制备了1L含有2.8％的脂肪，并且添加了2％脱脂奶粉和6％蔗糖的乳制品，在96℃下对它进行巴氏灭菌30分钟，并且将其温度降低到42℃。在含有10％重构奶粉和0.1％商用酵母提取物的无菌MSK培养基中重新激活嗜热链球菌的非增稠菌株的预培养物和保加利亚乳杆菌非粘性菌株的预培养物。
同样在上文所述的确定成分培养基中重新激活旧金山乳杆菌菌株的预培养物，然后在含有10％重构奶粉和0.1％商用酵母提取物以及1％蔗糖的无菌MSK培养基中培养。然后用1％每一种上述重新激活的预培养物接种巴氏灭菌的乳制品，并且让该乳制品在32℃下发酵，直到pH值达到4.5。
用这种方法生产出了酸奶样乳制品，并且在4℃下保存。用旧金山乳杆菌菌株制备的发酵的酸奶样乳制品具有柔软的质地和美妙的口感，特别是在4℃下保存10天之后更是如此。另外，果聚糖具有益生素潜力。
实施例6：将来自旧金山乳杆菌菌株的果聚糖用作婴儿配方中的益生素
制备用于干燥婴儿配方中的干混合物，对于100克的配方来说，含有：5-20％，优选10％的肽，2-40％，优选20％的脂肪，10-60％，优选40％的非果聚糖碳水化合物(包括乳糖65％，麦芽糖糊精20％，淀粉15％)，和1-10％，优选3％的果聚糖(按实施例3方法制备)，满足每日所需的痕量维生素和少量元素，和0.1-5％，优选1.5％的矿物质。
实施例7：含有来自旧金山乳杆菌菌株的果聚糖的婴儿配方
为了获得一种婴儿配方，我们制备了100毫升配方所包含的以下混合物：0.5-5％，优选2％的肽，0.2-10％，优选4％的脂肪，1-25％，优选8％的非果聚糖碳水化合物(包括乳糖65％，麦芽糖糊精20％，淀粉15％)，和0.5-20％，优选5％的果聚糖(按实施例3方法制备)，满足每日所需的痕量维生素和少量元素，和0.01-2％，优选3％的矿物质，和50-90％，优选75％的水。
实施例8：基于发酵谷物的饮料
在适合热处理的容器中混合以下成分(份数以千克形式表示)：19.8米粉，15.0小麦粉，13.9燕麦片，24.3蔗糖，1.5酵母提取物和850水。
向上述混合物中喷射蒸汽，将温度提高到130℃，并且在该温度下保持1分钟，最后冷冻到大约32℃。然后将所得到的浆转移到发酵罐中，然后用旧金山乳杆菌菌株CNCM I-2588、CNCM I2589或CNCMI-2613中的一种菌株接种，使接种的细菌细胞在所述浆中的细胞浓度大约为1-5×106cfu/ml。
发酵在32℃下进行8小时，得到了一种酸化发酵谷物基料。在使用之前，可以在4℃下将所述发酵的谷物基料保存长达1周时间，或者进行巴氏灭菌/消毒以便保存更长时间。
实施例9：含有旧金山乳杆菌菌株的宠物食品
一种饲料混合物由玉米、玉米谷蛋白、鸡和鱼、盐、维生素和矿物质组成。将离开预调节器的潮湿的饲料输送到挤出机-蒸煮器中，并且凝胶化。强制离开所述挤出机的凝胶化基质通过一个模具，并且挤出。将离开所述模具头的挤出物切割成适合喂养狗的片，在大约110℃下干燥大约20分钟，并且冷冻以便成团，所得到的所述团块的水活性大约为0.6。
用含有牛脂的物质对所述饲料团进行喷雾包衣。除了所述标准包衣之外，以0.1-20％，优选0.5-5％的比例，用含有由旧金山乳杆菌菌株CNCM I-2588、CNCM I-2613或CNCM I-2589生产的果聚糖(按实施例3方法制备)的干燥的和浓缩的粉末对所述饲料团进行包衣。
因此，由此获得的干燥的狗饲料，特别适合为宠物提供果聚糖的益生素来源，例如，这种饲料能改善肠道微生物区系的组成或皮肤和皮毛状况。
实施例10：含有来自旧金山乳杆菌的果聚糖的湿润的宠物食品
用73％的禽成分、猪肺和牛肝(研磨物)，16％的小麦粉，7％的水，2％的染料、香味剂、维生素和无机盐制备混合物。在12℃下对该混合物进行乳化，并且以布丁形式挤出，然后在90℃的温度下蒸煮。将其冷却到30℃，并且切成厚块。将45％的厚块与55％的调味汁混合，该调味汁是用98％的水、1％的染料和1％的由旧金山乳杆菌菌株CNCM I-2588、CNCM I-2589或CNCM I-2613生产的多糖果聚糖制备的，该果聚糖是按照实施例3的方法作为具有益生素特性的增稠剂而制备的。将所述宠物食物填充在镀锡铁皮罐中，并且在125℃下消毒40分钟。
实施例11：基于发酵谷物的婴儿配方
用旧金山乳杆菌菌株CNCM I-2588、CNCM I-2589或CNCM I-2613中的一种菌株接种小麦、稻米或玉米粉或其混合物和水，其干物质含量为20-60％，优选30-50％，更优选35-45％，以便使浆中的细胞浓度为大约1-5×10E+06cfu/ml。发酵在32℃下进行10小时。在菌株生长期间，果聚糖是原位生产的。然后通过蒸汽喷射(120-140℃)对发酵的和酸化的面粉进行消毒，并且通过滚动于燥(120-140℃)或通过挤出蒸煮(140-180℃)进行干燥，得到了富含益生素外多糖果聚糖的婴儿配方。
Claims (15)
1.旧金山乳杆菌的一种分离的和纯化的菌株，它能产生果聚糖。
2.如权利要求1的菌株，其保藏号为CNCM I-2588，CNCM I-2589或CNCM 1-2613。
3.一种由权利要求1或2之一的菌株获得的可溶性果聚糖。
4.一种生产果聚糖的方法，其中：
-用权利要求1或2的菌株的预培养物接种含有蔗糖的培养基，
-使其在25-35℃下发酵48小时，和
-然后使所得到的培养物的pH降低到低于4.5，再添加冷乙醇，并且在0-10℃下保存6-48小时。
5.如权利要求4的方法，其中，所述培养基至少含有0.2％的蔗糖。
6.如权利要求4的方法，其中，在保存之后纯化沉淀物中的果聚糖。
7.如权利要求4的方法，其中，干燥含有果聚糖的培养物，以便生产果聚糖粉。
8.将权利要求3的果聚糖和/或权利要求1或2的旧金山乳杆菌菌株用于制备人类或宠物食品或化妆组合物的用途。
9.如权利要求8的用途，其中，果聚糖的用量为大约0.01-25％。
10.如权利要求8或9的用途，其中，果聚糖被用作益生素果聚糖的原位来源。
11.如权利要求8或9的用途，其中，果聚糖是免疫刺激多糖。
12.如权利要求7的用途，其中，所述旧金山乳杆菌菌株的用量为至少1.105cfu/g。
13.人或宠物食品，至少含有权利要求3的果聚糖和/或权利要求1或2的旧金山乳杆菌菌株。
14.如权利要求13的人类或宠物食品，其中，果聚糖的用量为大约0.01-25％。
15.如权利要求13的人类或宠物食品，其中，旧金山乳杆菌菌株的用量为至少1.105cfu/g。
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