KR20230164788A - 장류 유래 바실러스 균주, 이를 이용한 곡물 발효물의 제조 방법 및 응용 - Google Patents
장류 유래 바실러스 균주, 이를 이용한 곡물 발효물의 제조 방법 및 응용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장류 유래의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP) 및 이의 식품공학적 응용에 관한 것이다. 발효 균주는 아밀라아제 분비 능력 및 프로테아제 분비 능력이 우수하다. 본 발명의 발효 균주에 의하여 분비되는 아밀라아제 및 프로테아제를 활용하여, 곡물에 다량 포함된 다당류와 단백질 성분을 저분자량의 물질로 변환할 수 있다. 본 발명의 발효 균주, 발효 균주를 포함하는 배양액 등을 곡물에 접종하여 우수한 영양 성분을 갖는 곡물 발효물 및/또는 발효 식품을 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 발효 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생화학적 및 생물학적 활성이 우수한 장류 유래의 바실러스 균주 및 바실러스 균주의 식품공학적 응용에 관한 것이다.
최근 국내에서 제작한 영화나 드라마를 비롯한 대한민국의 대중 문화가 중국, 일본 및 동남아시아와 같은 아시아권을 넘어서 서구에서도 큰 인기를 얻고 있다. 아시아권에서는 1990년대 중반부터 한류를 통해 대한민국의 음식 문화가 보급되었으며, 해외 언론 등을 통해 김치 및 장류 등으로 대표되는 대한민국 특유의 발효 식품이 인체의 면역력을 강화시킨다는 내용이 보도되었다. 이에 따라, 대한민국의 전통 발효 식품에 대한 해외 소비자들의 관심이 더욱 증가할 것으로 예상된다.
한편, 효소는 생채 내에서 다양한 생화학적 과정을 매개하는 천연 촉매 역할을 수행한다. 다양한 생리적 기능을 가지는 효소를 곡물이나 식품 등에 첨가하여 다양한 생리활성 물질과 영양 물질을 생성하여 곡물이나 식품의 소화 및 흡수를 향상시킬 수 있다. 곡물은 껍질에 생리적 활성 성분 및 영양 성분을 다량 포함하고 있다. 하지만, 곡물의 껍질은 단단하고 식감이 좋지 않기 때문에, 통상적으로 곡물의 껍질을 제거한 상태에서 섭취된다. 따라서, 곡물의 껍질에 다량 존재하는 생리활성 물질을 섭취할 수 있다면, 인체의 건강에도 도움이 될 뿐만 아니라, 영양 성분이 풍부한 대체 식품으로 활용될 수 있다.
본 발명은 목적은 장류에서 유래한 바실러스 균주, 바실러스 균주를 포함하는 식품첨가제, 발효 식품용 미생물 제재, 바실러스 균주를 이용하여 곡물 발효물을 제조하는 방법 및 곡물 발효물을 제공하고자 하는 것이다.
일 측면에 따르면, 장류로부터 분리한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP)가 개시된다.
상기 TK01 균주는 아밀라아제(amylase) 분비 활성 및 프로테아제(protease) 분비 활성을 갖는다.
다른 측면에서, 상기 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 유효 성분으로 함유하는 발효 식품 제조용 미생물 제재가 개시된다.
또 다른 측면에서, 상기 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 유효 성분으로 포함하는 식품 첨가제가 개시된다.
또 다른 측면에서, 상기 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 접종하는 단계; 및 상기 TK01 균주가 접종된 곡물 분말을 발효시켜 곡물 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 곡물 발효물을 제조하는 방법이 개시된다.
일례로, 상기 곡물 분말은 녹두, 검정깨, 팥, 렌즈콩, 완두콩, 미강, 보리, 밀, 율무, 옥수수, 귀리, 현미, 흑미, 백태, 서목태 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 곡물 분말일 수 있다.
상기 접종하는 단계 이전에 상기 곡물 분말이 40 중량% 내지 60 중량%의 수분 함량을 가지도록 수분 처리하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
상기 수분 처리된 곡물 분말을 110℃ 내지 130℃의 온도에서 10분 내지 60분 동안 증자하는 단계와, 상기 증자된 곡물 분말을 20℃ 내지 40℃의 온도로 냉각하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
필요에 따라, 상기 냉각된 곡물을 분쇄하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
상기 곡물 발효물을 수득하는 단계 이후에, 상기 곡물 발효물을 30℃ 내지 50℃의 조건에서 12시간 내지 48시간 건조하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 포함하는 곡물 발효물이 개시된다.
본 발명에 따라 확인된 장류 유래의 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) TK01 균주는 소화 효소, 특히 아밀라아제 및 프로테아제 분비 활성이 우수하다.
본 발명의 TK01 균주 또는 이의 배양액은 발효 식품을 제조하기 위한 미생물 제재 또는 식품 첨가제로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 TK01 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 접종하여 발효 식품을 제조할 수 있다. 일례로, 본 발명의 TK01 균주 또는 이의 배양액을 곡물에 접종하여, 소화 효소의 활성이 크게 향상된 곡물 발효물을 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 선별된 균주를 포함하는 종균 배양액을 제조하는 공정을 개략적으로 보여주는 플로 차트이다.
도 2는 본 발명의 다른 예시적인 실시형태에 따라 선별된 균주를 포함하는 종균 배양액을 이용하여 곡물 발효물을 제조하는 공정을 개략적으로 보여주는 플로 차트이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 분리된 발효 균주의 16S rRNA 서열에 근거하여 해당 발효 균주를 동정할 때의 계통도를 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 분리된 발효 균주의 배양 시간에 따라 배양액 중의 생균수 및 소화 효소의 역가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 다른 예시적인 실시형태에 따라 선별된 균주를 포함하는 종균 배양액을 이용하여 곡물 발효물을 제조하는 공정을 개략적으로 보여주는 플로 차트이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 분리된 발효 균주의 16S rRNA 서열에 근거하여 해당 발효 균주를 동정할 때의 계통도를 보여주는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 분리된 발효 균주의 배양 시간에 따라 배양액 중의 생균수 및 소화 효소의 역가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서, 본 발명을 상세하게 설명한다.
된장 및 간장으로 대표되는 우리나라 발효 식품에서 생화학적 및 생리학적 활성이 우수한 종균을 개발할 필요성이 있다. 일 측면에 따르면, 본 발명은 장류에서 분리된 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP)는 아밀라아제 및 프로테아제 분비 활성이 우수하다(도 4 참조).
따라서, 본 발명에 따라 선별된 TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 건조물은 곡물 발효물 및/또는 발효 식품을 제조하기 위한 미생물 제제, 식품 첨가제로 활용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP)를 배양하는 과정에 대하여 설명한다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 선별된 균주를 포함하는 종균 배양액을 제조하는 공정을 개략적으로 보여주는 플로 차트이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 선별된 TK01 균주를 포함하는 종균 배양액을 얻기 위하여, TK01 균주를 활성화할 수 있도록 전배양하는 단계(ST110 단계), 전배양된 TK01 균주를 본배양하는 단계(ST120 단계)를 통하여 최종적으로 곡물 발효물 및/또는 발효 식품에 접종하기 위한 종균 배양액을 최종적으로 얻을 수 있다(ST130 단계).
TK01 균주의 전배양액 및 본배양액은 각각 TK01 균주의 성장을 위한 적절한 영양 성분을 포함한다면, 그 조성은 특별히 한정되지 않는다. 예시적인 실시형태에서, 전배양액 및 본배양액은 효모 추출물, 펩톤(예를 들어, 포테이토 펩톤), 염화나트륨, 제2 인산칼륨, 포도당 및 정제수를 각각 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일례로, 전배양액은 효모 추출물 1 ~ 4 중량%(예를 들어 1 ~ 3 중량%), 포테이토 펩톤 0.1 ~ 1.0 중량%(예를 들어, 0.1 ~ 0.5 중량%), 염화나트륨 0.2 ~ 1.5 중량%(예를 들어, 0.2 ~ 1.0 중량%), 제2 인산칼륨 0.1 ~ 1.0 중량%(예를 들어, 0.1 ~ 0.5 중량%), 포도당 0.1 ~ 1.0 중량%(예를 들어 0.1 ~ 0.5 중량%) 및 정제수 95 ~ 98.5 중량% (예를 들어 96 ~ 98 중량%)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 제조된 전배양액은 110 내지 130℃에서 10분 내지 60분 멸균하고, 본 발명에 따른 TK01 균주를 배양액 중량 대비 0.1 내지 5 중량%, 예를 들어 0.5 내지 3 중량%의 비율로 접종한다. 예시적인 측면에서, 전배양 단계에서 TK01 균주는 1.0 x 106 CFU/g 이상, 예를 들어 1.0 x 106 CFU/g 내지 5.0 x 107 CFU/g의 비율로 전배양액에 접종될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. TK01 균주를 접종한 뒤에, 전배양액은 30℃ 내지 40℃의 온도에서 100 내지 300 rpm의 조건에서 12시간 내지 48시간 배양될 수 있다.
TK01 균주의 전배양이 완료되면 대형 발효조(1L 이상, 예를 들어, 3 L 내지 10 L)를 이용하여 TK01 균주의 본배양이 수행된다. 일례로, 전배양액과 비교해서 필수적인 영양 성분인 효모 추출물, 펩톤 및 포도당의 함량과 제2 인산칼륨의 함량을 증가시키는 대신, 염화나트륨과 정제수의 함량이 감소된 본배양액을 사용할 수 있다.
일례로, 본배양액은 효모 추출물 1 ~ 4 중량%(예를 들어 1 ~ 3 중량%), 포테이토 펩톤 0.5 ~ 2.0 중량%(예를 들어, 0.5 ~ 1.5 중량%), 염화나트륨 0.1 ~ 0.5 중량%(예를 들어, 0.1 ~ 0.4 중량%), 제2 인산칼륨 0.5 ~ 1.5 중량%(예를 들어, 0.6 ~ 1.2 중량%), 포도당 0.5 ~ 1.5 중량%(예를 들어 0.6 ~ 1.2 중량%) 및 정제수 93 ~ 97 중량% (예를 들어 94 ~ 96 중량%)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 제조된 본배양액은 110 내지 130℃에서 15분 내지 90분 멸균하고, 전배양액을 본배양액 중량 대비 0.1 내지 5 중량%, 예를 들어 0.5 내지 3 중량%의 비율로 접종한다. 예시적인 측면에서, 본배양 단계에서 접종되는 전배양액 중에 TK01 균주는 1.0 x 107 CFU/g 이상, 예를 들어 1.0 x 107 CFU/g 내지 1.0 x 108 CFU/g의 비율로 본배양액에 접종될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. TK01 균주를 접종한 뒤에, 본배양액은 30℃ 내지 40℃의 온도에서 100 내지 500 rpm의 조건에서 12시간 내지 48시간 배양될 수 있다.
따라서, TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 건조물을 일종의 스타터 균주로 접종함으로써, 본 발명의 발효 균주는 발효 식품에서 성장하거나 우점종으로 성장할 수 있는 미생물로 사용될 수 있다. 본 발명의 TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 건조물을 이용하여 발효 식품을 제조하는데 활용될 수 있다.
본 발명의 TK01 균주를 포함하는 미생물 제재의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제의 형태를 포함한다. TK01 균주가 식품 첨가제로 사용되는 경우, 본 발명에 따른 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
선택적으로, TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 건조물을 곡물에 접종하여 아밀라아제 및/또는 프로테아제 활성이 크게 향상된 곡물 발효물을 제조할 수 있다. 도 2는 본 발명의 다른 예시적인 실시형태에 따라 선별된 균주를 포함하는 종균 배양액을 이용하여 곡물 발효물을 제조하는 공정을 개략적으로 보여주는 플로 차트이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 선별된 TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP), 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 건조물을 이용하여 곡물 발효물을 제조하는 공정은 곡물 원료 또는 곡물 분말을 준비하는 단계(ST210 단계), 준비된 곡물 원료 또는 곡물 분말에 전술한 공정을 통해서 얻어진 종균 배양액을 접종하는 단계(ST230 단계), 종균 배양액이 접종된 곡물 원료 또는 곡물 분말을 발효시키는 단계(ST240 단계)를 포함한다. 선택적인 측면에서, 종균 배양액을 접종하기 전에 준비된 곡물 원료 또는 곡물 분말을 전처리하는 단계(ST220 단계), 발효된 곡물 발효물을 건조하는 단계(ST250 단계) 및/또는 건조된 곡물 발효물을 분쇄(분말화)하는 단계(ST260 단계)를 더욱 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 장류로부터 선별된 TK01 균주는 식물에 존재하는 다당류인 아밀로오스, 녹말과 같은 다당류에 존재하는 1-4 글리코사이드 결합을 절단하는 α-아밀라아제 및/또는 단백질의 펩타이드 결합을 절단하는 프로테아제 분비 활성이 우수하다. 따라서, 다양한 곡물에 존재하는 다당류 및/또는 단백질로부터 인체에서 바로 사용될 수 있는 짧은 사슬의 당류 또는 펩타이드 또는 아미노산을 생성하는데 활용될 수 있다.
본 발명에 따라 장류로부터 분리된 TK01 균주가 접종될 수 있는 곡물은 분말 상태일 수 있다. 곡물은 특별히 한정되지는 않지만, 녹두, 검정깨, 팥, 렌즈콩, 완두콩, 미강, 보리, 밀, 율무, 옥수수, 귀리, 현미, 흑미, 백태, 서목태 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
곡물 분말에 TK01 균주가 배양된 종균 배양액을 바로 접종시켜 곡물 발효물을 얻을 수 있으나, 예시적인 측면에서 곡물 분말에 전처리 공정(ST220 단계)를 수행하는 경우, TK01 균주의 접종에 따른 곡물 발효 효율이 향상될 수 있다. 예시적인 측면에서, 곡물 분말의 전처리 공정(ST220 단계)는 곡물 분말에 대한 수분 처리 단계(ST222 단계), 증자(열처리 단계)(ST224 단계), 냉각 단계(ST226 단계) 및/또는 분쇄 단계(ST228 단계)를 포함할 수 있다.
수분 처리 단계(ST222 단계)에서 곡물 분말 중에 수분의 함량을 40 중량% 내지 60 중량%이 되도록 조절한다. 곡물 분말 중에 수분 함량이 40 중량% 미만인 경우, TK01 균주의 발효 속도가 지연될 수 있고, 곡물 분말 중에 수분 함량이 60 중량%를 초과하는 경우, 후술하는 건조 공정이 지연될 수 있다.
수분 처리 단계(ST222 단계) 이후에, 곡물 분말은 110℃ 내지 130℃의 온도에서 10분 내지 60분 동안 열처리될 수 있다(ST224 단계). 열처리 단계를 수행하여, 곡물 분말 중에 잔류하는 유해 미생물을 제거하고, 곡물의 세포벽을 파괴함으로써, TK01 균주가 활발히 번식, 성장할 수 있는 환경이 조성될 수 있다. 열처리 온도가 낮거나 처리 시간이 짧은 경우, 유해 미생물의 제거 효과가 미비할 수 있고, 열처리 온도가 높거나 처리 시간이 길어지면, 곡물 내 단백질이 변성되면서 발효 효율이 저하될 수 있다.
열처리 단계(ST224 단계) 이후에, 곡물 분말을 40℃ 이하, 예를 들어 20℃ 내지 40℃의 온도로 냉각한다(ST226 단계). 냉각 온도가 20℃ 미만인 경우에는 곡물 분말이 지나치게 단단해지면서, 접종된 TK01 균주에 의한 곡물 분말의 발효가 비효율적으로 진행될 수 있다.
냉각 단계(ST226)를 거친 곡물 분말은 뭉쳐 있기 때문에, TK01 균주가 곡물 분말에 균일하게 접종될 수 있도록 곡물 분말에 대한 분쇄 단계(ST228 단계)가 수행될 수 있다.
일례로, 전처리 공정(ST220 단계)가 완료된 곡물 분말에 TK01 균주를 배양시켜 얻은 종균 배양액을 접종한다(ST230 단계). 예시적인 측면에서, TK01 균주를 포함하는 종균 배양액은 곡물 분말 100 중량부에 대하여 5 내지 20 중량부일 수 있다. 다른 예시적인 측면에서 접종 직후 TK01 균수는 1.0 X 106 CFU/g 이상, 예를 들어, 1.0 X 106 CFU/g 내지 1.0 X 1010 CFU/g 또는 1.0 X 106 CFU/g 내지 1.0 X 109 CFU/g일 수 있다. TK01 균주의 접종량이 1.0 X 106 CFU/g 미만인 경우에는 곡물을 발효시키는데 지나치게 많은 시간이 소요될 수 있고, 발효 과정에서 유해 미생물에 의해 곡물 분말이 오염될 수 있다. TK01 균주의 접종량이 1.0 X 1010 CFU/g을 초과하면, 증가한 접종량에 비례하여 발효 효율이 크게 증가하지 않을 수 있다. 따라서, 발효 효율과 경제성을 고려할 때, TK01 균주의 접종량이 1.0 X 1010 CFU/g 이하인 것이 바람직하다.
접종이 완료되면, 발효 단계(ST240 단계)가 수행된다. 접종된 TK01 균주가 분비하는 소화 효소에 의하여 곡물 중에 포함되는 다당류 및 단백질 성분이 저분자량을 가지는 짧은 사슬의 올리고당, 펩타이드 등으로 변환된다. 이에 따라 최종적으로 제조된 곡물 발효물은 발효 이전의 곡물과 비교해서 소화 흡수가 용이해지고, 그 밖의 유용한 성분을 포함할 수 있다.
예시적인 측면에서, 발효 단계(ST240 단계)는 액체 배양 또는 고체 배양일 수 있다. 발효 온도는 30
내지 40℃의 온도일 수 있고, 발효 시간은 6 시간 내지 72시간, 예를 들어 12 시간 내지 48시간일 수 있다.
발효 단계(ST240 단계) 이후에 곡물 발효물은 건조(ST250 단계) 및/또는 분쇄(분말화)(ST260 단계)될 수 있다. 건조 단계(ST250 단계)는 30℃ 내지 50℃, 예를 들어 35℃ 내지 45℃의 온도에서 12시간 내지 48시간 진행될 수 있다. 건조 단계(ST250 단계) 이후에 곡물 분말 중의 수분 함량은 10% 이하, 예를 들어 5% 이하 또는 3% 내지 10% 이하가 되도록 건조 단계가 수행될 수 있다. 50℃를 초과하는 온도에서 건조 공정이 수행되는 경우, TK01 균주가 분비하는 효소 활성이 감소할 수 있다.
분쇄 단계(ST260)에서 곡물 발효물의 용도에 따라 다양한 크기로 분쇄될 수 있다. 일례로, 곡물 발효물은 햄머 밀을 이용하여 적절한 크기로 분쇄될 수 있다.
한편, TK01 균주가 식품 첨가제로 포함되거나, 또는 TK01 균주를 접종시켜 제조되는 곡물 발효물을 식품으로 제형화하는 경우, 이들 식품은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 수프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 측면에서, TK01 균주를 식품 첨가제로 포함하거나, TK01 균주의 접종 및 발효에 따라 제조되는 곡물 발효물이 포함될 수 있는 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있다. 기능성 식품에는 TK01 균주 또는 곡물 발효물 이외에도 다양한 식품 보조 성분을 더욱 포함할 수 있다. 일례로, 기능성 식품에 포함될 수 있는 식품 보조 성분은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류; 및/또는 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
기능성 식품 중에서 건강 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 보조 성분으로 더욱 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되지 않는다.
실시예 1: 전통 장류 유래 바실러스 종균 선별
(1) 1차 screening (정성 평가)
시판되고 있는 발효 식품(된장, 청국장, 고추장, 간장)을 선정하고, 이들 발효 식품 중에서 발굴된 총 171 종의 균주 중에서 아밀라아제 및 프로테아제 분비 능력을 정성 평가하였다.
상업용 액체 배지인 TSB(Tryptic Soy Broth)를 제조하고 121℃에서 20분 멸균하였다. Stock된 각각의 균주를 상온에서 녹인 후, 멸균된 액체 배지에 1% 접종하였다. 접종 후 37℃, 180 rpm 조건에서 24시간 배양하였다. 이어서 정성 평가를 위한 균주 screening용 조 효소액을 다음과 같이 제조하였다. 배양이 완료된 배양액을 채취하여 4℃, 7,830 rpm 조건에서 5분 동안 원심분리하고, 멸균 실린지 필터(0.45 ㎛)를 사용하여 상층액을 제균하고 정성 평가에 사용하였다.
효소 생산능이 우수한 균주를 선발하기 위한 정성 평가용 배지를 다음과 같이 제조하였다. α-아밀라아제 활성을 평가하기 위하여 1% 가용성 녹말 기질이 첨가된 YM(Yeast Malt) 한전 배지를 제조하고, 프로테아제 활성을 평가하기 위하여 탈지 분유 2%를 첨가한 YM 한천 배지를 제조하였다(탈지 분유와 한천 배지를 각각 멸균하여 혼합).
효소 활성이 우수한 균주를 1차 선별하기 위한 평가 실험을 다음과 같이 진행하였다. 멸균 페이퍼 디스크에 샘플 (30 ㎕)을 loading한 뒤, 10분간 건조시켰다. 멸균 핀셋으로 loading된 디스크를 집어서 배지 위에 올려서 페이퍼 디스크를 심었다. 배양기에서 Clear zone이 나타낼 때까지 37℃에서 24시간 배양하고, 효소 생산능이 우수한(clear zone이 큰) 균주를 선별하였다. 1차 screening을 통해 10종의 균주를 선별하였다.
(2) 2차 screening (정량 평가)
1차 screening에서 선별된 총 10종의 균주에 대한 효소 생산능을 아래와 같은 방법으로 정량 평가하였다. 1차 평가와 동일한 방법을 사용하여, 1차 선별된 10종의 균주 배양액의 조효소 액을 식품별 규격 확인 시험법(식품공전) 내 효소 식품의 α-아밀라아제 및 프로테아제 시험법에 따라 효소 활성(생산능)을 측정하였다. 2차 screening에 따른 정량 평가 결과를 하기 표 1에 나타낸다.
| 균주 | α -아밀라아제 (Unit/g) |
프로테아제 (Unit/g) |
| 2 | - | 226.63 |
| 12 | - | 243.22 |
| 53 | 1,886.28 | 167.34 |
| 74 | - | 100.25 |
| 120 | 2,956.52 | - |
| 122 | - | - |
| 139 | - | - |
| 148 | - | - |
| 165 | - | - |
| 166 | - | - |
(3) 균주 특성 확인 및 최종 균주 선정
2차 screening에서 효소 생산능이 우수한 균주 53과 균주 120의 특성(세균수 및 효소 활성)을 확인하였다.
태경농산㈜에서 자체 개발한 발효 식품용 종균 배양액을 사용하였다. 효모 추출물 1 ~ 4 중량%, 포테이토 펩톤 0.1 ~ 1.0 중량%, 염화나트륨 0.2 ~ 1.5 중량%, 제2 인산칼륨 0.1 ~ 1.0 중량%, 포도당 0.1 ~ 1.0 중량% 및 정제수 95 ~ 98.5 중량%를 포함하는 전배양용 배지를 제조하고, 제조된 배지를 121℃에서 20분 멸균하였다. 멸균된 배지에 선별 균주를 1% 접종하고, 접종 후 37℃, 180 rpm 조건에서 24시간 배양하였다. 전배양액과 동일한 조성을 가지는 본배양액 배지를 제조하고, 121℃에서 30분간 멸균하였다. 멸균된 배지에 균주 53과 균주 121를 각각 24시간 배양시킨 전배양액 1%를 접종하고, 37℃, 180 rpm에서 36시간 배양하였다.
배양이 완료된 배양액에 멸균 희석액을 이용하여 희석 배수 별로 시험 용액을 제조하였다. TSA(Tryptic Soy Aga) 배지에 희석 배수 별 시험 용액을 각각 100 ㎕씩 분주하고, 스프레더를 사용하여 도말(스프레딩)하였다. 37℃에서 24시간 배양한 뒤, 세균수를 확인하였다. 2차 정량 평가와 동일한 방법으로 효소 활성 조효소액을 제조하고, 식품공전 내 효소 식품의 효소 시험법에 따라 효소 활성을 측정하였다. 최종적으로 120 균주를 선별하고, 이하에서 최종 선별된 균주를 TK01 균주라 지칭한다.
| 균주 | 세균수(CFU/㎖) | α -아밀라아제(Unit/g) | 프로테아제 (Unit/g) |
| 53 | 3.1E+08 | 2503.24 | - |
| 120 | 1.0E+09 | 11,975.27 | 224.96 |
실시예 2: 선별된 균주 동정
실시예 1에서 최종적으로 선별된 TK01 균주를 분리하고, 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4의 프라이머를 사용하여 각각 얻어진 해당 균주의 16S rRNA 서열의 상보적 핵산 뉴클레오타이드 서열(서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2)을 공지된 미생물의 16S rRNA 서열과 비교하였다. 본 실시예에 따른 분석 결과를 도 3에 나타낸다. 분석 결과 TK01 균주는 바실러스 벨레젠시스로 분류, 동정되었으며, 2021년 11월 11일 TK01 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하고, 기탁번호 KCTC14772BP를 부여 받았다.
실시예 2: 균주의 효소 활성 비교
실시예 1에서 선별된 TK01 균주와, 양성 control로 농촌 진흥청 국립농업과학원에서 분양 받은 KACC 11248 균주(Bacillus coagulans, 연유 기원), KACC 15817 균주 (Bacillus amyloliquefaciens, 간장 기원), KACC 15849 균주(Bacillus subtilis, 고추장 기원), KACC 10112 균주(Bacillus subtilis, 생 렌틸콩 기원)를 대상으로 실시예 1에서 설명한 정성 평가 방법과 동일한 방법으로 각 균주의 효소 활성을 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 3에 나타낸다. 일반 분양 균주와 비교해서, 실시예 1에서 최종적으로 선별된 TK01 균주의 효소 분비 활성이 상대적으로 우수하였다.
| 균주 | α -아밀라아제 (직경 mm) |
프로테아제 (직경, mm) |
| KACC 11248 | - | 0 |
| KACC 15817 | - | 16 |
| KACC 15849 | 22 | 13 |
| KACC 10112 | - | 11 |
| TK01 | 21 | 16 |
실시예 3: 발효 식품용 종균 배양액 제조
실시예 1에서 최종 선발된 TK01 균주를 이용하여 발효 식품용 종균 배양액을 다음과 같이 제조하였다.
삼각 플라스크에 효모 추출물10.30 ~ 41.2 g (1 ~ 4 중량), 포테이토 펩톤 1.03 ~ 10.30 g(0.1 ~ 1.0 중량%), 염화나트륨 2.06 ~ 15.45 g (0.2 ~ 1.5 중량%), 제2 인산칼륨 1.03 ~ 10.30 g (0.1 ~ 1.0 중량%), 포도당 1.03 ~ 10.3 g (0.1 ~ 1.0 중량%), 978.50 ~ 1014.55 g (95 ~ 98.5 중량%)를 넣어 전배양용 배지를 제조하고, 제조된 전배양용 배지를 121℃에서 20분 멸균하였다. 멸균된 배지에 TK01 균주를 1% 접종하고, 37℃, 180 rpm 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 전배양액에서 생균 수는 6.9 x 107이었고, α-아밀라아제의 활성은 3,912.12 unit/g, 프로테아제의 활성은 92.17 unit/g이었다.
이어서, 5L 발효조에서 본배양을 진행하였다. 효모 추출물 10.52 ~ 42.1 g (1 ~ 4 중량%), 포테이토 펩톤 5.26 ~ 21.05 g (0.5 ~ 1.5 중량%), 염화나트륨 1.05 ~ 5.26 g (0.1 ~ 0.5 중량%), 제2 인산칼륨 5.26 ~ 15.79 g (0.05 ~ 1.5 중량%), 포도당 5.26 ~ 15.79 g (0.5 ~ 1.5 중량%), 정제수 978.82 ~ 1020.9 g (93 ~ 97 중량%)를 넣어 본배양용 배지를 제조하고, 제조된 본배양용 배지를 121℃에서 30분 멸균하였다. 멸균된 배지에 전배양액 1%를 접종하오, 37℃, 300 rpm, 1.0 vvm (aeration volume/medium volume/minute), pH 7 조건에서 24시간 배양하였다. 배양액의 pH는 1N HCl 및 1N NaOH를 사용하여 조정하였고, 거품 발생 시에 소포제를 사용하였다. 본배양액에서 배양 시간에 따른 생균수 및 소화 효소 측정 결과를 하기 표 4와 도 4에 각각 나타낸다. 종균 배양액에 함유된 TK01 생균수가 증가하면서, 소화 효소의 역가(unit/g)가 크게 향상되었다.
| 배양시간 | 생균수 | α-아밀라아제 | 프로테아제 |
| 0 | 1.1x106 | 0 | 0 |
| 3 | 3.2x106 | 0 | 0 |
| 6 | 2.9x107 | 0 | 0 |
| 9 | 1.4x108 | 1,881 | 96 |
| 12 | 3.5x108 | 2,808 | 103 |
| 15 | 4.7x108 | 7,601 | 198 |
| 18 | 6.9x108 | 14,809 | 295 |
| 21 | 6.5x108 | 18,507 | 375 |
| 24 | 1.1x109 | 27,951 | 408 |
실시예 4: 곡물 발효물 제조
하기 표 5에 기재된 각각의 곡물 분말에 수분을 처리하여 곡물 분말 중에 수분 함량이 40 중량% 내지 60 중량%가 되도록 조정하였다. 수분 처리된 곡물 분말을 121℃에서 30분 열처리(증자)한 뒤, 40℃ 이하로 냉각하고, 균주가 균일하게 접종될 수 있도록 분쇄하여 전처리 공정을 완료하였다.
전처리 완료된 곡물 분말에 실시예 3에서 제조된 종균 배양액을 곡물 분말 100 중량부에 대하여 10 중량부의 비율로 접종하였다. 접종 후에 37℃, 상대습도 60% - 80%에서 24시간 동안 발효시킨 뒤에, 소화 효소의 역가를 측정하였다. 이어서, 곡물 발효물을 40℃에서 24시간 건조하여 수분 함량이 10% 이하가 되도록 하였다. 건조된 곡물 발효물을 30 mesh를 통과시켜 분말화하였다. 발효 이후에 각각의 곡물 분말에서 소화 효소의 역가를 측정한 결과를 하기 표 5에 나타낸다. 소화 효소의 분비 활성이 우수한 곡물 발효물을 확인하였다.
| 곡물 | α-아밀라아제 | 프로테아제 |
| 녹두 | 133,800 | 360 |
| 검정깨 | 126,400 | 260 |
| 팥 | 79,500 | 70 |
| 렌즈콩 | 69,600 | 140 |
| 완두콩 | 68,500 | 270 |
| 미강 | 8,700 | - |
| 보리 | 10,100 | - |
| 밀 | 16,300 | 10 |
| 율무 | 13,200 | - |
| 옥수수 | 2,700 | - |
| 귀리 | 12,383 | 295 |
| 현미 | 10,183 | - |
| 흑미 | 8,050 | 75 |
| 백태 | 7,886 | 42 |
| 서목태 | 3,820 | - |
상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.
<110> TAE KYUNG NONG SAN CO., LTD
<120> BACILLUS STRAIN FROM FERMENTED SOYBEAN PRODUCT, PROCESS OF
MANUFACTURING GRAIN FERMENTATION PRODUCTS AND APPLICATION USING
THEREOF
<130> 3021
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2484
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 1
ctgaagagat gagtgctagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 60
taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 120
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 180
ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg 240
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 300
acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 360
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 420
tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc 480
tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat 540
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 600
cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaag 660
gtgggacaga tgattggggt gaagtctaaa agggggaacc aaaaaaaaat ttccccaagc 720
cgttttattc cccccaaaaa agcttttaaa ttggggggaa aaaggtttca aggggggggg 780
gttttgggtt taaaatatta accccccttg ttttaagcct ccaaataaaa agttcttccc 840
cccccagtcc taggaatttt gggggggacc tttcaaatca acggttttgg aggaatttgg 900
aaaaaagggg ggggtaaagg ggaaactggg cgcccccccg ccccctttct tacccccccg 960
acggcccgcc cccgaaccct ttttccccca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacgggg 1020
ccaccacccc aaaaaaaaaa aaagggccga aggcgcgggg ggtgcgccgt ttttttcttt 1080
cacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatt aaaaaaaggg ccccccgccc ccgggggccc 1140
ccactccccg ttttttttat ttcccccccg gaaaaaaaaa aagttttttt tattgaaaaa 1200
aaaaaaaaaa taaaaaaaaa aaaaaaacaa atacaagatt gaaaaaaaat aatattattt 1260
tggtgcccgg gggggggcgc ggggtgggtg ttcgttttgt ttttcttgcg gggccttgcg 1320
ggggcgcctt ttttttgcga gggggaaaat aaaaaatata acccccccct tgcaaggtgg 1380
gggggggggg gggctcctaa acagagataa aagatgtaag gggggggggg ggattttttt 1440
gtgttttttt tttttttcac acaaccaaca aaaaaaaaaa gaaaaaaata cttaggtttt 1500
atgaaaaaat aaaaagaaaa aagaataaaa ttaaaaaaat ctccttattc aaaccacaac 1560
aaaaaacaaa aggggggggg gacggaccac cttttgatgg gtgggccaat tttagaaaaa 1620
tttttttttt gtttttacca atggtaagtt taaaagagag gtgagaaaaa aaaaaaaaaa 1680
tttttccctc cccgatgggg gagggggggg ttcccctgcg cctcatttca cgtttaaaat 1740
caataaaaat tattttgggg gggaagggga agggatcggg tgtgttttat tttgtgaata 1800
aaacaagcga tctgataaag ttgcagaggt agtaaactcc taaaccccca tcaccccccc 1860
cccctcttac gttaattgga agggaggagg gggggggggg gactgtcccc ccaacaaaaa 1920
aaacccccgc tgggttgccg gggggccggg gggggtgggg gggggggagg ggtggaataa 1980
aacaaaataa aactgaacgc cggacatgaa ttgggagaga aaaaaaaaaa taaaagtaaa 2040
aggggggtgg ggtcaggggg gggaggcggg gggcctgttg tggtggtttg ttccccaacc 2100
cgatttggac cttattataa aaaagaatga gggttgatgt tggcccccga cctcgtccat 2160
caccagtttt aaatttctaa ttatttttaa ttttttttaa ctattatcct gagcgggggg 2220
ccgcaagaac gaaccggaaa ggtgtggggg gggggagggg gaataaattg gctcctaaag 2280
ggataaaagt gagggaaacc ggtacatctc gcctttagtt ttacataatt tacacccccc 2340
ccactgggga gcgtttggac cgacccgggt ggggaagggg tttttcgagc ggcggggggt 2400
aagtcgatac tgtatttgtg accaataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460
aaaaaaaaaa aaaaaaatct aaaa 2484
<210> 2
<211> 1290
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 2
agacgtaagt ctccaggcgg agtgcttatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc 60
ccctaacact tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg 120
ctccccacgc tttcgctcct cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg 180
tgttcctcca catctctacg catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg 240
cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag 300
acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg cccaataatt ccggacaacg cttgccacct 360
acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa 420
ggtgccgccc tatttgaacg gcacttgttc ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa 480
aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg gaagattccc 540
tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct 600
ctcaggtcgg ctacgcatcg tcgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg 660
ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa gccacctttt atgtctgaac catgcggttc 720
aaacaaccat ccggtattag ccccggtttc ccggagttat cccagtctta caggcaggtt 780
acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta acatcaggga gcaagctccc atctgtccgc 840
tcgacttgca tgtattaggc acgccgccag cgttcgtcct gagcaggagc aaaaccccaa 900
aaaaagggaa tttatgtttc tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260
tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1290
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 785F Forward Primer
<400> 3
ggattagata ccctggta 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 907R Reverse Primer
<400> 4
ccgtcaattc mtttragttt 20
Claims (11)
- 장류로부터 분리한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) TK01 균주(기탁번호: KCTC14772BP).
- 제 1항에 있어서, 상기 TK01 균주는 아밀라아제(amylase) 분비 활성 및 프로테아제(protease) 분비 활성을 가지는 균주.
- 제 1항 또는 제 2항에 기재된 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 유효 성분으로 함유하는 발효 식품 제조용 미생물 제재.
- 제 1항 또는 제 2항에 기재된 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 유효 성분으로 포함하는 식품 첨가제.
- 곡물 분말에 제 1항 또는 제 2항에 기재된 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 접종하는 단계; 및
상기 TK01 균주가 접종된 곡물 분말을 발효시켜 곡물 발효물을 수득하는 단계를 포함하는 곡물 발효물을 제조하는 방법.
- 제 5항에 있어서,
상기 곡물 분말은 녹두, 검정깨, 팥, 렌즈콩, 완두콩, 미강, 보리, 밀, 율무, 옥수수, 귀리, 현미, 흑미, 백태, 서목태 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 곡물 분말인 곡물 발효물을 제조하는 방법.
- 제 5항에 있어서,
상기 접종하는 단계 이전에 상기 곡물 분말이 40 중량% 내지 60 중량%의 수분 함량을 가지도록 수분 처리하는 단계를 더욱 포함하는 곡물 발효물을 제조하는 방법.
- 제 7항에 있어서,
상기 수분 처리된 곡물 분말을 110℃ 내지 130℃의 온도에서 10분 내지 60분 동안 증자하는 단계와, 상기 증자된 곡물 분말을 20℃ 내지 40℃의 온도로 냉각하는 단계를 더욱 포함하는 곡물 발효물을 제조하는 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 냉각된 곡물을 분쇄하는 단계를 더욱 포함하는 곡물 발효물을 제조하는 방법.
- 제 5항에 있어서,
상기 곡물 발효물을 수득하는 단계 이후에, 상기 곡물 발효물을 30℃ 내지 50℃의 조건에서 12시간 내지 48시간 건조하는 단계를 더욱 포함하는 곡물 발효물을 제조하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 기재된 TK01 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 이의 건조물을 포함하는 곡물 발효물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220064002A KR20230164788A (ko) | 2022-05-25 | 2022-05-25 | 장류 유래 바실러스 균주, 이를 이용한 곡물 발효물의 제조 방법 및 응용 |
Publications (1)
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| KR1020220064002A KR20230164788A (ko) | 2022-05-25 | 2022-05-25 | 장류 유래 바실러스 균주, 이를 이용한 곡물 발효물의 제조 방법 및 응용 |
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2022
- 2022-05-25 KR KR1020220064002A patent/KR20230164788A/ko unknown
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