JPH0191778A - マルトースホスホリラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、臨床検査用酵素として用いられる。新規なマ
ルトースホスホリラーゼに関するものである。

（従来の技術） マルトースホスホリラーゼ（以下ＭＰと略す）は、マル
トースを加リン酸分解しグルコースとグルコースｌリン
酸（ベータ型）を生成する酵素である。ＭＰは、ネイセ
リア　メニンギチヂス（Ｎｅ１ｓｅｒｒｉａ　　ｍｅｎ
ｉｎ　１ｔｉｄｉｓ）　［ジャーナル　オブバイオロジ
カル　ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１９９巻、１５
３頁、１９５２年］や、ラクトバシルス　プレビス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）　Ｉ　Ｆ　
Ｏ３３４５［アグリ力ルチャラル　アンド　バイオロジ
カル　ケミスト　リ　−　（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
　　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔ−「ｙ）、第３７巻、２１８６頁、１９７３′年
］により生産されることが知られている。また特公昭６
０−５４０３６号公報によれば、ラクトバシルスプレビ
ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｉｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）　Ｄ
　Ｓ　Ｍ　２００５４、　ＮＣＩＢ８８３６　　、８５
（３１，８５６２、ラクトバシルス　ブランタルム（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ吐ｕｙ」）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　２
０１　？　４および微工研菌寄第４６２８号、ラクトバ
シルス　レウテリ（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒ
ｅｕｔｅｒｉ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　２００１　Ｂ、ラクトバ
シルス　フェルメンチウム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｆｅｒ−ｍｅｎｔｕｍ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　２００５２
、ストレプトコックス５ｐｅｃ、　（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ　５ｐｅｃ、）微工研菌寄第４６２４号、微
工研菌寄第４６２５号、微工研菌寄第４６２６号、微工
研菌寄第４６２７号によっても生産されることが示され
ている。

一方、ＭＰの詳綱な理化学的性質についてはほとんど知
られておらず、ラクトバシルス　プレビスｒＦ０３３４
５株由来のＭＰについての記載があるのみである［アグ
リ力ルチャラル　アンドバイオロジカルケミストリー（
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｍｉｓｔｒｙ）第３７巻、２１８６頁、１９７
３年）］。

（発明が解決しようとする問題点） 臨床検査項目のうちアミラーゼ活性の測定は、８準機能
、甲状腺異常の判定として重要な測定項目となっている
。このアミラーゼ活性の測定方法として数多くの測定手
法が報告されているが、中でも最近マルトペンタオース
を基質とし、ＭＰを共役酵素に用いたＵＶ法（日本臨床
化学会第４同頁期セミナー資料集、１９８４年）が、測
定の正確さ、試薬の安定性、取り扱いの容易さなどで高
い評価を受けている。ところが、松井らが報告している
ように、ＭＰを用いたアミラーゼ活性測定では、反応開
始から測定時の吸光度変化が一定になるまでに少なくと
も５分の反応遅延時間（ラグタイム）が生じる問題があ
った（日本臨床化学会第７同頁期セミナー資料集、１９
８７年）。本ラグタイムは、試薬組成を種々変更するこ
とにより短縮させる試みがなされているが、十分解決さ
れていない、さらに実際に血清あるいは尿中のアミラー
ゼ活性を測定しようとする場合には、内因性のグルコー
スやマルトースを消去する反応（約３分必要）を予め行
うことが必要であり、目的とするアミラーゼ活性測定を
実施する前に要する時間は、少なくとも両者を加えた８
分以上となる。ところが近年広く普及している臨床検査
用自動分析機においては、機械的制約から一検体当たり
測定に用いれる時間は、最大でも１０分である。そのた
め、上記のようにラグタイムが６分も生ずるのであれば
、目的のアミラーゼ活性を測定するに許容される時間は
僅か２分であり、測定が正確に行われるには充分な時間
ではなく、信頼性に欠ける測定しか行えなかった。また
、測定に合計１０分も要するという事は、自動分析機の
処理能力を大幅に低下させることになり好ましくなかっ
た。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、上記の実状を鑑み、試薬關成を鋭意検討し
たところ、ラグタイムの生じる原因が従来のＭＰにある
ことを予見し、各種微生物菌株よりＭＰ生産菌の探索を
行ったところ、ラクトバシルス　サンフランシスコに属
する菌株がＭＰを生産することを見いだし、さらにこの
菌体よりＭＰを精製することに成功し、得られたＭＰを
アミラーゼ活性測定に用いたところ、従来のものとは異
なリラグタイムが顕著に短かくなる知見を得、本発明を
完成するに至った。

すなわち、本発明はラクトバシルス　サンフランシスコ
より産生され、次の理化学的性質を有するＭＰを要旨と
するものである。

８０作用 マルトースを加リン酸分解し、グルコースとグルコース
ｌリン酸くベータ型）を生ずる。

ｂ、基質特異性 マルトースに作用するが、シュークロース、うＣ０分子
量 ＳＤＳ電気泳動法により測定した値は、７６０００±４
０００である。

次に本発明のＭＰの理化学的性質を示す。なお、ＭＰ活
性の測定は、以下の２通りの方法の内いずれかの方法に
より実施した。

８０作用 前記したとおり。

ｂ、基質特異性 前記したとおり、各種糖類に対する基質特異性を第１表
に示す、ただし、各基質は市販の試薬グレードのものを
用いた。

第１表、各種糖類に対する基質特異性、Ｃ９至適ｐｌ（
及び安定ｐＨ範囲 ｐＨ５，５付近に至適ｐｉ（を有する（第１図参照）、
　　ｐＨ６ないし７で安定である（第２図参照）、ただ
し至適ＰＨの測定は、下記の力価の測定法に示す不連続
法において、ヒ酸クエン酸緩衝液のｐｉ（を約４から８
の範囲で変化させて実施、した、また安定ｐＨ範囲の測
定は、ｐＨを変化させた酢酸緩衝液、リン酸緩衝液及び
トリス塩酸＆１街液中に３７℃で１時間保温した後の残
存する活性を測定して求めた。

ｄ、力価の測定方法 ア）連続法 マルトース　４０μｍｏｌｅ、　　ＮＡＤ　　２．５ｐ
ｍｏ　ｌ　ｅ、ＭｇＣ１２３，３μｍｏ　ｌ　ｅ、ａ−
グルコース１・６ニリン酸　０．０５μｍｏｌｅ。

β−ホスホグルコムターゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｂｒｅｖ−ロ　ＩＦＯ３３４５由来）１．３単位、
グルコース６リン酸脱水素酵素　１０単位、リン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）７２．６μｍｏ　ｌ　ｅを含む反応液
１ｍｌを３０℃に予備加温した後酵素液を加え、３４０
ｎｍの吸光度の増加を連続的に追跡してＭＰ活性を測定
した。ＭＰ活性の１単位は、１分間に１μｍ　ｏ　ｌ　
ｅのグルコース１リン酸（ベータ型）を生成する酵素量
である。

イ）不連続法 マルトース４０μｍｏｌｅ、ヒ酸クエン酸緩衝ｎ　（ｐ
Ｈ６，０）４０μｍｏ　ｌ　ｅ、を含む反応液１ｍｌを
３０℃に予備加温した後酵素液を加え、３０℃に正確に
１０分保った後沸騰水中で酵素を失活させた０反応液中
に生成したグルコースを、市販のグルコース測定キット
（ヤトロン社製、ＧＫ−Ｇ（３ＰＤＨ法）で測定した。

ＭＰ活性のｌ単位は、１分間に２μｍｏｌｅのグルコー
スを生成する酵ｇｔである。

ｅ０作用適温の範囲 ４０℃ないし４５℃に作用適温がある（第３図参照）。

ｆ、温度による失活の条件 ０．１Ｍのリン酸緩衝液中で保温した時、４０℃で１５
分の熱処理では失活しないが、６０℃で１５分の熱処理
で完全に失活する（第４図参照）。

ｇ、阻害及び活性化 塩化カリウムにより活性化される。塩化カルシウム、塩
化ナトリウム、塩化第一鉄により活性は影響を受けない
、塩化マグネシウム、硫酸銅により若干の阻害を受ける
。塩化第二水銀により完全に失活する（第２表参Ｎ）。

第２表、各種塩類によるＭＰ活性への影響り、精製方法 菌体を超音波処理により破砕したのち、プロタミン硫酸
による除核酸処理、ＤＥＡＥセルロース、フェニルセフ
ァロースＣＬ−４８．ＤＥＡＥセファロース等の樹脂を
用いた各種クロマトグラフィ−により＄１１される。

１０分子量 前記のとおり、またＴＳＫＧ３０００ＳＷ　（東洋曹達
社）を用いたゲルろ過により測定された値は、１５００
００±２００００である。

本発明のＭＰを製造するには、ラクトバシルスサンフラ
ンシスコ、望ましくはラクトバシルスサンフランシスコ
　ＡＴＣＣ２６７５３株を通常の培地を用いてて培養す
ればよいが、炭素源としてマルトースを用い、ペプトン
、酵母エキス、ツイーン８０を加えた培地で、初期ｐＨ
５，６で３０℃で２４時間培養することが好ましい０次
に培養物より本発明のＭＰを精製するには、菌体を遠心
集菌の後酵素処理や、超音波破砕機、フレンチプレス、
ホモジナイザー等の機械的処理などにより破砕し、引き
続き硫安等による塩、折、有機溶媒による分別沈澱、イ
オン交換クロマトグラフィーや、疎水性クロマトグラフ
ィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなど各種のクロマト
グラフィー等の手法により精製することができる０例え
ば、ＤＥＡＥセルロース（ワットマン社製、Ｄ　Ｅ　−
５２型）を用いたイオン交換クロマトグラフィーや、フ
、エニルセフ７０−スＣＬ−４Ｂ　（ファルマシア社）
による疎水クロマトグラフィーを挙げることができる。

本発明のＭＰを用いたアミラーゼ活性測定試薬の組成、
及び測定方法の一例として次のものを挙げることができ
る。すなわち２２ｍＭのＨＥＰＥＳ　ＩＩ　？ｌｊ液（
ｐＨ８，０）　、５５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）　、Ｍｇ５Ｏａ　　１１ｍＭ、　ＫＣ１２７，５ｍＭ
％ＡＴＰ　　２．２ｍＭ、グルコキナーゼ　３．８５単
位／ｍｌ、グルコース６リン酸脱水素酵素　１．６５単
位／ｍｌの組成で示される第一試薬２．３４ｍ１に３２
０単位／ｍｌのＭＰを０．０６ｍ１．測定しようとする
試料０．０４ｍ１を加えて３０℃で予備保温し、次に２
６０ｍ　Ｍ　（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｓ緩衝液（ｐＨ６，０）　
、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａｌ　０ｍＭ、ＣａＣ１２７，５ｍＭ
、マルトペンタオース　２５ｍＭ、ＮＡＤＰ　　１０ｍ
Ｍの組成で示される第二試薬０．６ｍｌを加えて反応を
開始し、反応により生成するＮＡＤＰＨに基づ＜３４０
ｎｍの吸光度の増加を測定する。

（実施例） 以下本発明を実施例により具体的に説明する。

なお、実施例中の％は、重量％を示す。

実施例　ｌ、比較例　ｌ ラクトバシルス　サンフランシスコ　ＡＴＣＣ２６７５
３株を　マルトース　２．０％、酵母エキス１．０％、
ペプトン　１．０％、ツイーン８ｏ　　ｏ、ｏａ％、ｐ
）１５．６の組成の培地２０＋中で３０℃で２４時間培
養した０通気条件は０゜５ｖｖｍ、２０Ｏｒｐｍとした
。培養後、遠心分離により集菌したところ、湿菌体２０
ｇが得られた。これを５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７
，５，２ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸む。以下Ａ緩
衝液と略す）１００ｍｌに懸濁した後、超音波処理によ
り菌体を破砕し、遠心分離により上澄を回収し、プロタ
ミン硫酸を０．０４％となるように加え、除核酸処理を
行った。得られた粗酵素液をＤＥＡＥセルロース（ワッ
トマン社製、Ｄ　Ｅ　−５２型）のカラムに添加し、Ａ
緩衝液で洗浄した後、ＩＭのＫＣＩを含むＡＩ街液でＭ
Ｐの溶出を行った。引き続き得られたＭＰ画分に１５％
飽和となるよう硫安を加え、フェニルセファ０−スＣＬ
−４Ｂ（ファルマシア社製）のカラムに吸着させた。

１５％飽和の硫安を含むＡ緩衝液と水による濃度勾配を
かけることによりＭＰを溶出させた。Ｍ　Ｐ画分を回収
し、透析の後ＤＥＡＥセファａ−ス（ファルマシア社製
、ファーストフロータイブ）のカラムに添加し、ＫＣＩ
の直線的な濃度勾配（０ないし４００　ｍＭ）をかけた
ところ、ＭＰはＫＣ１濃度が２００ないし２５０ｍＭの
両分に溶出した。再度ＭＰＩＩｉ分を透析し、ＤＥＡＥ
セファロースのカラムに添加し前回よりも緩やかなＫＣ
Ｉの濃度勾配（１００ないし４００　ｍＭ）によりＭＰ
を溶出させたところ、はぼ電気泳動的に均一なＭＰ画分
が得られた。得られたＭＰの活性は２７４単位、収率は
２６．６％、比活性は１４．２単位／ｍｇ蛋白であった
。

また、得られたＭＰの理化学的性質を調べたところ、第
６〜１１頁に記載の理化学的性質と同じであった。

次に、実施例１で得られたＭＰのイオン交換クロマトグ
ラフィーを行った。具体的には、６０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７，７，２ｍＭメルカプトエタノール、２ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸を含む）で平衡化したＭｏｎｏ
Ｑ（ファルマシア社製）のカラムにＭＰを添加し、０．
４ＭのＫＣＩによる直線的な塩濃度の勾配をかけて溶出
を行った。その結果、本発明のＭＰは１０．４分後に溶
出した。

一方、比較のためにラクトバシラス　プレビスＩＦＯ３
３４５株を上記と同様に培養してＭＰを精製したところ
、比活性が１４．５単位／　ｍ　ｇ蛋白のＭＰが得られ
た。このＭＰを用い、上記と同じ条件でイオン交換クロ
マトグラフィーを行ったところ、ラクトバシルス　プレ
ビス由来のＭＰは８．９分後に溶出した。さらに両者の
ＭＰｔｔ混合して同時にイオン交換クロマトグラフィー
を行ったところ、８．９分後と１０．４分後の２箇所に
ＭＰが溶出し、両者が異なったＭＰであることが明らか
となった（第５図参照）。

さらに、上記で得られたＭＰをアミラーゼ活性測定に応
用した。具体的には、２２ｗＭの）ＩＥＰＥＳ緩衝液（
ｐＨ８，０）、５５ｍＭのリン酸Ｉｌｌ衝液（ｐＨ８，
０）　、Ｍｇ　ＳＯａ　　１１ｍＭ、　ＫＣ１２７，５
ｍＭ、ＡＴＰ　　２．２ｍＭ、グルコキナーゼ　３．８
５単位／　ｍ　ｌ　、グルコース６リン酸脱水素酵素　
１．６５単位／ｍｌの組成で示される第一試薬２．３４
ｍ１に、３２０単位／ｍｌのＭＰｌｉ：０．０６ｍ１、
アミラーゼ（へ唾液由来、約ｔｏｏｏ単位／ｌ）０．０
４ｍ１を加えて３０℃で予備保温した０次に２６０ｍＭ
のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６，ｏ＞　、Ｍｇ５Ｏａ　　１０
ｍＭ、ＣａＣＩ２７．５ｍＭ、マルトペンタオース　２
５ｍＭ、ＮＡＤＰ　　１０ｍＭの組成で示される第二試
薬０．６ｍｌを加えて反応を開始した０反応により生成
するＮＡＤＰＨに基づ＜３４０ｎｍの吸光度の増加を連
続的に測定したところ、単位時間当たりの吸光度の変化
は２分５５秒で一定となった。

一方、比較のため、前記で得られた　ラクトバシルス　
プレビスＩ　Ｆ０３３４５株由来のＭＰを用い、他は上
記と同様にしてアミラーゼ活性の測定を行ったところ、
単位時間当たりの吸光度変化が一定になるまでに６分３
０秒の時間が必要であった。

実施例２ ラクトバシルス　サンフランシスコ　ＡＴＣＣ２７６５
２株を用い、他は実施例１と同様にして培養及びＭＰの
精製を行った。その結果、回収された１３ｇの菌体から
、１４５単位のＭＰが得られた。この時のＭＰの比活性
は１３．８単位／ｍｇ蛋白であった。得られたＭＰの理
化学的性質を調べたところ、実施例１で得られたＭＰと
全く同様な性質を示した。

次に実施例１と同様にして、アミラーゼ活性測定試薬へ
応用した。その結果、単位時間当たりの吸光度変化が一
定となるまでの時間は、実施例１と同様に、２分５５秒
であった。

（発明の効果） 本発明のＭＰは、従来知られているものと比、較して非
常に優れた反応性を持ち、アミラーゼ測定に用いた場合
、反応のラグタイムが３分以下に短縮され、自動分析機
での分析精度、処理能力の向上が著しい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＭＰ（実施例１から得られたＭＰ、以
下同様）の至適ｐＨを示す図であり、第２図は本発明の
ＭＰの安定ｐｉ（範囲を示す図であり、第３図は本発明
のＭＰの作用適温の範囲を示す図であり、第４図は本発
明のＭＰの熱安定性を示す図であり、第５図は本発明の
ＭＰ及びラクトバシルス　プレビス　Ｉ　Ｆ０３３４５
株由来のＭＰを同時にイオン交換クロマトグラフィーに
かけた時の溶出パターンを示す図である。ただし、第５
図における実線はＭＰ活性を示し、点線はＫＣ１濃度を
示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ラクトバシルスサンフランシスコ（￥Ｌａｃｔｏ
   ｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｏ￥）よ
   り産生され、次の理化学的性質を有するマルトースホス
   ホリラーゼ。 ａ、作用 マルトースを加リン酸分解し、グルコースとグルコース
   １リン酸（ベータ型）を生ずる。ｂ、基質特異性 マルトースに作用するが、シュークローズ、ラクトース
   、トレハロース、マルチトール、及びマルトペンタオー
   スには作用しない。 ｃ、分子量 ＳＤＳ電気泳動法により測定した値は、７５０００±４
   ０００である。