JP2579082B2 - 安定な６−ホスホグルコノラクトナーゼ、その製造方法および該酵素の使用 - Google Patents
安定な６−ホスホグルコノラクトナーゼ、その製造方法および該酵素の使用Info
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- JP2579082B2 JP2579082B2 JP3223936A JP22393691A JP2579082B2 JP 2579082 B2 JP2579082 B2 JP 2579082B2 JP 3223936 A JP3223936 A JP 3223936A JP 22393691 A JP22393691 A JP 22393691A JP 2579082 B2 JP2579082 B2 JP 2579082B2
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- leuconostoc
- phosphogluconolactonase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、安定な６−ホスホグル
コノラクトナーゼ、ＥＣ ３.１.１.３１、該酵素の製造
方法および６−ホスホグルコノラクトンに変換すること
ができるかまたはその形成において直接的にまたは間接
的に含まれる臨床学的に関連しているパラメータの測定
のための使用に関する。
コノラクトナーゼ、ＥＣ ３.１.１.３１、該酵素の製造
方法および６−ホスホグルコノラクトンに変換すること
ができるかまたはその形成において直接的にまたは間接
的に含まれる臨床学的に関連しているパラメータの測定
のための使用に関する。
【０００２】本発明は、さらに詳細には、良好な安定性
を有し、かつロイコノストック(Ｌeuconostoc)細菌のよ
うな微生物から単離され得る６−ホスホグルコノラクト
ナーゼ(ＰＧＬ)に関する。
を有し、かつロイコノストック(Ｌeuconostoc)細菌のよ
うな微生物から単離され得る６−ホスホグルコノラクト
ナーゼ(ＰＧＬ)に関する。
【０００３】
【従来の技術】系統名が６−ホスホ−Ｄ−グルコノ−
１,５−ラクトン ラクトノヒドロラーゼであるＰＧＬ
は、６−ホスホグルコノラクトンから６−ホスホグルコ
ナートへの加水分解を触媒する。したがって、６−ホス
ホグルコノラクトナーゼは、６−ホスホグルコノラクト
ンおよび直接的にまたは幾つかの反応工程を介して６−
ホスホグルコノラクトンへ変換され得る反応相手の測定
のために、あるいは対応する反応を触媒する酵素の測定
のために使用され得る。ＰＧＬパス(path)は、グルコー
ス、ＡＴＰおよびＡＴＰ形成反応相手の測定に特に適し
ている。６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの添加
によってＡＴＰ １モルから２還元当量が得られる。し
たがって、対応する測定は２倍の感受性によって行われ
る。この原理は文献に開示されている(フォルムブロッ
ク(Ｖormbrock)およびヘルガー(Ｈelger)、エンザイム
(Ｅnzyme)３８、Ｓuppl.１、２０−２１、１９８７)。
１,５−ラクトン ラクトノヒドロラーゼであるＰＧＬ
は、６−ホスホグルコノラクトンから６−ホスホグルコ
ナートへの加水分解を触媒する。したがって、６−ホス
ホグルコノラクトナーゼは、６−ホスホグルコノラクト
ンおよび直接的にまたは幾つかの反応工程を介して６−
ホスホグルコノラクトンへ変換され得る反応相手の測定
のために、あるいは対応する反応を触媒する酵素の測定
のために使用され得る。ＰＧＬパス(path)は、グルコー
ス、ＡＴＰおよびＡＴＰ形成反応相手の測定に特に適し
ている。６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの添加
によってＡＴＰ １モルから２還元当量が得られる。し
たがって、対応する測定は２倍の感受性によって行われ
る。この原理は文献に開示されている(フォルムブロッ
ク(Ｖormbrock)およびヘルガー(Ｈelger)、エンザイム
(Ｅnzyme)３８、Ｓuppl.１、２０−２１、１９８７)。
【０００４】ＰＧＬが酵母中、ならびに肝臓、腎臓、赤
血球、組織のような種々の真核生物の器官中および幾つ
かの微生物中で生じることは公知である。
血球、組織のような種々の真核生物の器官中および幾つ
かの微生物中で生じることは公知である。
【０００５】ＰＧＬは、最初に、酵母エキス中で発見さ
れた(ブロディエ(Ｂrodie)およびリプマン(Ｌipman)、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.
Ｂiol.Ｃhem.)２１２、６７７−６８５、１９５５)。カ
ワダ(Ｋawada)らは、酵母からＰＧＬを精製し、それに
よって、１３０倍以上の精製を達成することができた
(ビオシミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Ｂiochem.
Ｂiophys.Ａcta)５７、４０４−４０７、１９６２)。し
かしながら、この酵素調製物は、定量的な測定に関して
必要な基質特異性を有していなかった。これに関して改
良された性質を有する均質な酵素調製物をウシ赤血球か
ら単離することができた(バウアー(Ｂauer)ら、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Ｅur.
Ｊ.Ｂiochem.)１３３、１６３−１６８、１９８３)。最
もよく研究された微生物由来のホスホグルコノラクトナ
ーゼは、細菌ツィモモナス・モビリス(Ｚymomonas mobi
lis)由来の酵素である(スコウプス(Ｓcopes)、ＦＥＢＳ
Ｌett.１９３、(２)１８５−１８８、１９８５)。これ
によると、ＰＧＬはツィモモナス・モビリス(Ｚymomona
s mobilis)中に多量に存在し、約５００倍の精製で単離
され得る。さらに、ツィモモナス(Ｚymomonas)酵素は良
好な基質特異性を有する(Ｋm０.０２−０.０３ミリモル
／リットル)。
れた(ブロディエ(Ｂrodie)およびリプマン(Ｌipman)、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.
Ｂiol.Ｃhem.)２１２、６７７−６８５、１９５５)。カ
ワダ(Ｋawada)らは、酵母からＰＧＬを精製し、それに
よって、１３０倍以上の精製を達成することができた
(ビオシミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ(Ｂiochem.
Ｂiophys.Ａcta)５７、４０４−４０７、１９６２)。し
かしながら、この酵素調製物は、定量的な測定に関して
必要な基質特異性を有していなかった。これに関して改
良された性質を有する均質な酵素調製物をウシ赤血球か
ら単離することができた(バウアー(Ｂauer)ら、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Ｅur.
Ｊ.Ｂiochem.)１３３、１６３−１６８、１９８３)。最
もよく研究された微生物由来のホスホグルコノラクトナ
ーゼは、細菌ツィモモナス・モビリス(Ｚymomonas mobi
lis)由来の酵素である(スコウプス(Ｓcopes)、ＦＥＢＳ
Ｌett.１９３、(２)１８５−１８８、１９８５)。これ
によると、ＰＧＬはツィモモナス・モビリス(Ｚymomona
s mobilis)中に多量に存在し、約５００倍の精製で単離
され得る。さらに、ツィモモナス(Ｚymomonas)酵素は良
好な基質特異性を有する(Ｋm０.０２−０.０３ミリモル
／リットル)。
【０００６】しかしながら、公知の全てのＰＧＬ酵素の
欠点は、単離された酵素の安定性が不充分であることお
よび動物の器官からまたは既述の微生物からの酵素の単
離が非常に困難であり、かつ多くの時間を要することで
ある。さらに、充分量の必要な原料がほとんど入手可能
ではないかまたは２、３の特定部位で生じるだけであ
る。さらに、既述の酵母由来のＰＧＬ酵素は必要な基質
特異性を有していない。
欠点は、単離された酵素の安定性が不充分であることお
よび動物の器官からまたは既述の微生物からの酵素の単
離が非常に困難であり、かつ多くの時間を要することで
ある。さらに、充分量の必要な原料がほとんど入手可能
ではないかまたは２、３の特定部位で生じるだけであ
る。さらに、既述の酵母由来のＰＧＬ酵素は必要な基質
特異性を有していない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、偏在的に生じかつ培養が容易である不必要な微
生物中に付加的に存在する安定な６−ホスホグルコノラ
クトナーゼを提供することである。
目的は、偏在的に生じかつ培養が容易である不必要な微
生物中に付加的に存在する安定な６−ホスホグルコノラ
クトナーゼを提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この目的は、pＨ７.０お
よび２０℃で約２０時間後に少なくとも９０％ＰＧＬ残
存活性を有し、かつロイコノストック(Ｌeuconostoc)菌
株から得ることのできる６−ホスホグルコノラクトナー
ゼを提供することによって達成される。一般に、該酵素
は、上記条件下で約２０時間の後でも、充分なＰＧＬ初
期活性を有している。要するに、ロイコノストック(Ｌe
uconostoc)から得られるホスホグルコノラクトナーゼは
２０〜３０℃およびpＨ５.８〜９.０で良好な活性を有
する。至適pＨは６.５〜７.０であり；至適温度は２０
〜３０℃の間で一定である。０.１ミリモル／リットル
以下のミハエーリス定数Ｋmを有する６−ホスホグルコ
ノラクトンに関するＰＧＬの触媒効率は、定量測定に関
して必要な質に従う。
よび２０℃で約２０時間後に少なくとも９０％ＰＧＬ残
存活性を有し、かつロイコノストック(Ｌeuconostoc)菌
株から得ることのできる６−ホスホグルコノラクトナー
ゼを提供することによって達成される。一般に、該酵素
は、上記条件下で約２０時間の後でも、充分なＰＧＬ初
期活性を有している。要するに、ロイコノストック(Ｌe
uconostoc)から得られるホスホグルコノラクトナーゼは
２０〜３０℃およびpＨ５.８〜９.０で良好な活性を有
する。至適pＨは６.５〜７.０であり；至適温度は２０
〜３０℃の間で一定である。０.１ミリモル／リットル
以下のミハエーリス定数Ｋmを有する６−ホスホグルコ
ノラクトンに関するＰＧＬの触媒効率は、定量測定に関
して必要な質に従う。
【０００９】本発明は、ロイコノストック(Ｌeuconosto
c)菌株を培養することを特徴とする微生物を培養し、バ
イオマスからまたは培養ブロスから酵素を単離すること
によって微生物由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の製造方法を提供するものでもある。好ましくは、ロイ
コノストック・メセンテロイデス(Ｌeuconostoc mesent
eroides)が使用され、特に好ましくは、公然と入手可能
であるロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌeuconos
toc mesenteroides)亜種デキストラニカム(dextranicu
m)(ＤＳＭ ２０１８７、ＮＣＩＢ ３３５５)が使用され
る。
c)菌株を培養することを特徴とする微生物を培養し、バ
イオマスからまたは培養ブロスから酵素を単離すること
によって微生物由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の製造方法を提供するものでもある。好ましくは、ロイ
コノストック・メセンテロイデス(Ｌeuconostoc mesent
eroides)が使用され、特に好ましくは、公然と入手可能
であるロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌeuconos
toc mesenteroides)亜種デキストラニカム(dextranicu
m)(ＤＳＭ ２０１８７、ＮＣＩＢ ３３５５)が使用され
る。
【００１０】本発明のロイコノストック(Ｌeuconostoc)
菌株は、炭素供給源としてのグルコース(またはラクト
ースも)および窒素供給源としての酵母エキスならびに
塩および微量元素を含有している培地上で非常に簡単に
培養され得る。
菌株は、炭素供給源としてのグルコース(またはラクト
ースも)および窒素供給源としての酵母エキスならびに
塩および微量元素を含有している培地上で非常に簡単に
培養され得る。
【００１１】とりわけＭgＳＯ4およびＫ2ＨＰＯ4は、適
切な塩として使用され得る。適切な微量元素は、とりわ
けＭnおよびＦeである。
切な塩として使用され得る。適切な微量元素は、とりわ
けＭnおよびＦeである。
【００１２】基質が１０〜３７℃で連続して供給され、
pＨが約５.２〜７.２で調節される場合に、ＰＧＬの特
に高い収率が達成され得る。
pＨが約５.２〜７.２で調節される場合に、ＰＧＬの特
に高い収率が達成され得る。
【００１３】該酵素は、例えば、ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー(Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.)
１３３、１６３ ff(１９８３)およびＦＥＢＳ Ｌett.１
９３、１８５ ff.(１９８５)に開示されているような酵
素精製のための一般的な方法に従って単離することがで
きる。しかしながら、精製方法は、例えばリゾチームの
添加による溶解の後、ポリミン(Ｐolimin)処置およびそ
の後の分別硫酸アンモニウム沈殿を行い、(ＮＨ4)2ＳＯ
4画分(約１.４〜３.２Ｍ)をフェニルセファロース上で
クロマトグラフィー処理するのが好ましい。次いで、例
えばセファクリル(Ｓephacryl) Ｓ２００またはスーパ
ーデクス(Ｓuperdex) ２００上でゲル濾過を行う。この
方法を用いて、少なくとも５００ Ｕ／mg蛋白の比活性
を有するＰＧＬ調製物が５０％以上の収率で得られる。
個々の酵素調製物は、約１５００Ｕ／mg蛋白の比活性を
有する。
ナル・オブ・バイオケミストリー(Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.)
１３３、１６３ ff(１９８３)およびＦＥＢＳ Ｌett.１
９３、１８５ ff.(１９８５)に開示されているような酵
素精製のための一般的な方法に従って単離することがで
きる。しかしながら、精製方法は、例えばリゾチームの
添加による溶解の後、ポリミン(Ｐolimin)処置およびそ
の後の分別硫酸アンモニウム沈殿を行い、(ＮＨ4)2ＳＯ
4画分(約１.４〜３.２Ｍ)をフェニルセファロース上で
クロマトグラフィー処理するのが好ましい。次いで、例
えばセファクリル(Ｓephacryl) Ｓ２００またはスーパ
ーデクス(Ｓuperdex) ２００上でゲル濾過を行う。この
方法を用いて、少なくとも５００ Ｕ／mg蛋白の比活性
を有するＰＧＬ調製物が５０％以上の収率で得られる。
個々の酵素調製物は、約１５００Ｕ／mg蛋白の比活性を
有する。
【００１４】この方法で精製された酵素は、分析的目的
のためにそのまま使用され得る。ＰＧＬは、例えばクレ
アチンキナーゼまたはクレアチニンもしくはクレアチン
の酵素的測定のようなグルコース−６−リン酸、グルコ
ース、ＡＴＰおよびＡＴＰ形成酵素反応の測定に関する
特定技術のものである。６−ホスホグルコノラクトンが
形成される全ての測定方法は、６−ホスホグルコノラク
トンが化学的に非常にゆっくりと酸に転位されるのでＰ
ＧＬ触媒によって促進され得る。ＰＧＬを添加し、次い
で、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(６−ＰＧ
ＤＨ)を添加すると、倍増に関して理想的な場合、非常
に短時間で感受性が増大される。したがって、このよう
な結合試験は、小さい測定シグナルを有するパラメータ
に関して特に重要なものである。これは、例えば心臓梗
塞患者の血清または血液におけるＣＫ−ＭＢ同位酵素測
定に適用する(フォルムブロック(Ｖormbrock)およびヘ
ルガー(Ｈelger)、上記)。例えばヘキソキナーゼ(Ｈ
Ｋ)、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(Ｇ６Ｐ
ＤＨ)、ＰＧＬおよび６−ＰＧＤＨのような必要な補助
酵素の他に、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+が助酵素としてさ
らに添加される。２つの助酵素のうちのいずれを使用す
るかは、使用される補助酵素Ｇ６ＰＤＨおよび６−ＰＧ
ＤＨの供給源にのみ依存するが、ロイコノストック(Ｌe
uconostoc)由来の使用されるＰＧＬに関して重要性はな
い。ＡＴＰ １モルから酵素カスケードの最終精製物と
してＮＡＤＨ ２モルまたはＮＡＤＰＨ ２モル、ＣＯ2
およびリブロース−５−リン酸が形成される。形成され
たＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、反射光度計において３
４０または３６５nmの波長で検出された。ロイコノスト
ック(Ｌeuconostoc)由来の本発明のＰＧＬは、試験溶液
１ミリリットル当たり０.２〜０.５Ｕ、好ましくは試験
溶液１ミリリットル当たり０.３Ｕの量を添加する。
のためにそのまま使用され得る。ＰＧＬは、例えばクレ
アチンキナーゼまたはクレアチニンもしくはクレアチン
の酵素的測定のようなグルコース−６−リン酸、グルコ
ース、ＡＴＰおよびＡＴＰ形成酵素反応の測定に関する
特定技術のものである。６−ホスホグルコノラクトンが
形成される全ての測定方法は、６−ホスホグルコノラク
トンが化学的に非常にゆっくりと酸に転位されるのでＰ
ＧＬ触媒によって促進され得る。ＰＧＬを添加し、次い
で、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(６−ＰＧ
ＤＨ)を添加すると、倍増に関して理想的な場合、非常
に短時間で感受性が増大される。したがって、このよう
な結合試験は、小さい測定シグナルを有するパラメータ
に関して特に重要なものである。これは、例えば心臓梗
塞患者の血清または血液におけるＣＫ−ＭＢ同位酵素測
定に適用する(フォルムブロック(Ｖormbrock)およびヘ
ルガー(Ｈelger)、上記)。例えばヘキソキナーゼ(Ｈ
Ｋ)、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(Ｇ６Ｐ
ＤＨ)、ＰＧＬおよび６−ＰＧＤＨのような必要な補助
酵素の他に、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+が助酵素としてさ
らに添加される。２つの助酵素のうちのいずれを使用す
るかは、使用される補助酵素Ｇ６ＰＤＨおよび６−ＰＧ
ＤＨの供給源にのみ依存するが、ロイコノストック(Ｌe
uconostoc)由来の使用されるＰＧＬに関して重要性はな
い。ＡＴＰ １モルから酵素カスケードの最終精製物と
してＮＡＤＨ ２モルまたはＮＡＤＰＨ ２モル、ＣＯ2
およびリブロース−５−リン酸が形成される。形成され
たＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、反射光度計において３
４０または３６５nmの波長で検出された。ロイコノスト
ック(Ｌeuconostoc)由来の本発明のＰＧＬは、試験溶液
１ミリリットル当たり０.２〜０.５Ｕ、好ましくは試験
溶液１ミリリットル当たり０.３Ｕの量を添加する。
【００１５】適切な試験を促進するためのＰＧＬの添加
は、例えば組換え法によって生産されるＧ６ＰＤＨに関
する場合であるＰＧＬ反応に影響を及ぼす如何なる成分
も含有しないＧ６ＰＤＨを使用する場合に特に重要であ
る。定義された量のＰＧＬを添加することが可能である
結果として、反応の促進およびその結果の測定シグナル
の倍増をよりよく算出することができ、結果として、対
応する試験はより再現可能である。
は、例えば組換え法によって生産されるＧ６ＰＤＨに関
する場合であるＰＧＬ反応に影響を及ぼす如何なる成分
も含有しないＧ６ＰＤＨを使用する場合に特に重要であ
る。定義された量のＰＧＬを添加することが可能である
結果として、反応の促進およびその結果の測定シグナル
の倍増をよりよく算出することができ、結果として、対
応する試験はより再現可能である。
【００１６】適切な診断薬は、本発明のＰＧＬおよび上
記補助酵素または助酵素を含有する。全ての成分は、配
合した形態で約２０〜３０℃で約２４時間貯蔵すること
ができ、測定を行う直前に試験しようとする試料とその
まま混合することができる。
記補助酵素または助酵素を含有する。全ての成分は、配
合した形態で約２０〜３０℃で約２４時間貯蔵すること
ができ、測定を行う直前に試験しようとする試料とその
まま混合することができる。
【００１７】以下に添付図面について説明する。
【００１８】図１は、pＨ安定性を示すグラフである。
ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬおよびツィ
モモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関して、＋２０℃で
pＨを増大させた場合の残存活性を％で示す(５０ミリモ
ル／リットルのリン酸カリウム緩衝液中ＰＧＬ ０.２Ｕ
／ミリリットル；２時間)。
ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬおよびツィ
モモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関して、＋２０℃で
pＨを増大させた場合の残存活性を％で示す(５０ミリモ
ル／リットルのリン酸カリウム緩衝液中ＰＧＬ ０.２Ｕ
／ミリリットル；２時間)。
【００１９】図２は、活性至適条件を示すグラフであ
る。ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬおよび
ツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関して、＋２５
℃でpＨを増大させた場合の残存活性を％で示す(０.１
Ｍ ＭＥＳ、２ミリモル／リットルＭgＣl2、３０ミリモ
ル／リットルＮaＣl)。ＭＥＳ＝４−モルホリノエタン
スルホン酸。
る。ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬおよび
ツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関して、＋２５
℃でpＨを増大させた場合の残存活性を％で示す(０.１
Ｍ ＭＥＳ、２ミリモル／リットルＭgＣl2、３０ミリモ
ル／リットルＮaＣl)。ＭＥＳ＝４−モルホリノエタン
スルホン酸。
【００２０】図３は、温度依存性を示すグラフである。
ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬおよびツィ
モモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関して、pＨ６.５で
温度を上昇させた場合の活性をＵ／mgで示す。
ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬおよびツィ
モモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関して、pＨ６.５で
温度を上昇させた場合の活性をＵ／mgで示す。
【００２１】以下の実施例によって本発明をさらに説明
する。
する。
【００２２】
実施例１ ロイコノストック(Ｌeuconostoc)の発酵：主成分として
酵母エキス、グルコース、塩および微量元素を含有して
いる培養培地を１００リットルの発酵容器中で蒸気滅菌
する。光学密度３に予め培養したロイコノストック・メ
センテロイデス・エスピー・デキストラニカム(Ｌeucon
ostoc mesenteroides sp. dextranicum) ＤＳＭ ２０１
８７の培養液３リットルを、この１００リットルの発酵
容器に接種した。
酵母エキス、グルコース、塩および微量元素を含有して
いる培養培地を１００リットルの発酵容器中で蒸気滅菌
する。光学密度３に予め培養したロイコノストック・メ
センテロイデス・エスピー・デキストラニカム(Ｌeucon
ostoc mesenteroides sp. dextranicum) ＤＳＭ ２０１
８７の培養液３リットルを、この１００リットルの発酵
容器に接種した。
【００２３】１００リットル培養液に曝気速度０.２vvm
で空気を供給し、温度を２５℃に維持し、全工程中、水
酸化ナトリウム溶液によって培養液のpＨ値をpＨ６.８
に調節した。この方法で、ＰＧＬは、バイオマスの増大
に伴って、細胞中に蓄積する。１６時間後、パッドバー
グ(Ｐadberg)遠心分離機中で細菌を収穫し、該細胞から
ＰＧＬを単離した。
で空気を供給し、温度を２５℃に維持し、全工程中、水
酸化ナトリウム溶液によって培養液のpＨ値をpＨ６.８
に調節した。この方法で、ＰＧＬは、バイオマスの増大
に伴って、細胞中に蓄積する。１６時間後、パッドバー
グ(Ｐadberg)遠心分離機中で細菌を収穫し、該細胞から
ＰＧＬを単離した。
【００２４】実施例２ ロイコノストック(Ｌeuconostoc)発酵ブロスから６−ホ
スホグルコノラクトナーゼ(ＰＧＬ)の単離：ロイコノス
トック・デキストラニカム(Ｌeuconostoc dextranicum)
発酵培養液１００リットルを遠心分離した。これによっ
て、乾燥マス３２０gに対応する湿細胞マス１４７０gを
得た。該バイオマスを１０ミリモル／リットルのリン酸
カリウム緩衝液(pＨ６.５)１５リットルに懸濁させ、リ
ゾチーム７.３５gを添加し、２０℃で１２時間溶解させ
た。完全に溶解させるために、氷上で冷却しながら、７
００barで２回、高圧分散を行った。細胞デブリスから
核酸を分離するために、１.２％ポリミン(Ｐolimin) Ｇ
２０（ＢＡＳＦ)で処理した。遠心分離または濾過の
後、上澄み液中に酵素が完全に残った。その後、該酵素
溶液に、２０ミリモル／リットルのリン酸カリウム緩衝
液(pＨ６.５)で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス
(Ｓephadex)を添加し、＋４℃で６０分間撹拌した。溶
液から該陰イオン交換体を分離し、各回、０.８モル／
リットルの硫酸アンモニウムを含有する１００ミリモル
／リットルのリン酸カリウム緩衝液(pＨ６.５)１リット
ルで２回溶離した。合わせた溶出液を、１.４〜３.２モ
ル／リットルの間の固体硫酸アンモニウムと一緒に分留
した。沈殿したＰＧＬ沈殿物を、減少勾配液(１.５モル
／リットル硫酸アンモニウム、２０ミリモル／リットル
リン酸カリウム、pＨ６.５)を用いてフェニルセファロ
ース上でクロマトグラフィー処理した。約１モル／リッ
トル硫酸アンモニウムで該カラムから酵素が放出され
る。活性画分を約＋４℃で５０mg蛋白／ミリリットルに
濃縮した後、セファクリル(Ｓephacryl)Ｓ２００カラム
を介するモレキュラーシーブ通過の後、５００ Ｕ／mg
蛋白以上のＰＧＬ調製物を得た。使用するカラム材料に
よって、約１５００ Ｕ／mgの比活性を有するＰＧＬ画
分を得ることができる。
スホグルコノラクトナーゼ(ＰＧＬ)の単離：ロイコノス
トック・デキストラニカム(Ｌeuconostoc dextranicum)
発酵培養液１００リットルを遠心分離した。これによっ
て、乾燥マス３２０gに対応する湿細胞マス１４７０gを
得た。該バイオマスを１０ミリモル／リットルのリン酸
カリウム緩衝液(pＨ６.５)１５リットルに懸濁させ、リ
ゾチーム７.３５gを添加し、２０℃で１２時間溶解させ
た。完全に溶解させるために、氷上で冷却しながら、７
００barで２回、高圧分散を行った。細胞デブリスから
核酸を分離するために、１.２％ポリミン(Ｐolimin) Ｇ
２０（ＢＡＳＦ)で処理した。遠心分離または濾過の
後、上澄み液中に酵素が完全に残った。その後、該酵素
溶液に、２０ミリモル／リットルのリン酸カリウム緩衝
液(pＨ６.５)で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス
(Ｓephadex)を添加し、＋４℃で６０分間撹拌した。溶
液から該陰イオン交換体を分離し、各回、０.８モル／
リットルの硫酸アンモニウムを含有する１００ミリモル
／リットルのリン酸カリウム緩衝液(pＨ６.５)１リット
ルで２回溶離した。合わせた溶出液を、１.４〜３.２モ
ル／リットルの間の固体硫酸アンモニウムと一緒に分留
した。沈殿したＰＧＬ沈殿物を、減少勾配液(１.５モル
／リットル硫酸アンモニウム、２０ミリモル／リットル
リン酸カリウム、pＨ６.５)を用いてフェニルセファロ
ース上でクロマトグラフィー処理した。約１モル／リッ
トル硫酸アンモニウムで該カラムから酵素が放出され
る。活性画分を約＋４℃で５０mg蛋白／ミリリットルに
濃縮した後、セファクリル(Ｓephacryl)Ｓ２００カラム
を介するモレキュラーシーブ通過の後、５００ Ｕ／mg
蛋白以上のＰＧＬ調製物を得た。使用するカラム材料に
よって、約１５００ Ｕ／mgの比活性を有するＰＧＬ画
分を得ることができる。
【００２５】ＮＡＤＨオキシダーゼ、Ｇ６ＰＤＨ、６Ｐ
ＧＤＨ、ＡＴＰase、ヘキソキナーゼ、クレアチンキナ
ーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルタチオンリダクター
ゼ、ホスホグルコース−イソメラーゼ、グルコースデヒ
ドロゲナーゼおよびグルコースオキシダーゼによる汚染
は、全ての場合において、ＰＧＬ活性に対して０.０１
％以下である。
ＧＤＨ、ＡＴＰase、ヘキソキナーゼ、クレアチンキナ
ーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルタチオンリダクター
ゼ、ホスホグルコース−イソメラーゼ、グルコースデヒ
ドロゲナーゼおよびグルコースオキシダーゼによる汚染
は、全ての場合において、ＰＧＬ活性に対して０.０１
％以下である。
【００２６】硫酸アンモニウムによって酵素を３.２モ
ル／リットルに飽和させ、１０mg蛋白／ミリリットル、
pＨ６.５、＋４℃で貯蔵し、分析測定に関して、この形
態で使用する。
ル／リットルに飽和させ、１０mg蛋白／ミリリットル、
pＨ６.５、＋４℃で貯蔵し、分析測定に関して、この形
態で使用する。
【００２７】
【表１】 ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬの精製(１００リットル培養液) 工程 ＫＵ Ｕ／mg 蛋白(g) 収率(%) リゾチーム ＋ 高圧 １８９０ １０ １８９ １００ Ｇ20上澄み液 １５００ ４４ ３４ ７９ ＤＥＡＥ溶出液 １６４０ ５４ ３０ ８６ ＡＳ画分１.４〜３.２Ｍ １６００ ６４ ２５ ８４ フェニルセファロース溶出液 １２５０ ２９０ ４.３ ６６ セファクリル(Sephacryl) S200を 介するモレキュラーシーブ通過 １０５０ ５９０ １.８ ５５
【００２８】実施例３ ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬの安定性：
実施例２に従って得たＰＧＬ画分およびツィモモナス
(Ｚymomonas)から単離したスコウプス(Ｓcopes)の酵素
を、各々、２０℃で５０ミリモル／リットル リン酸カ
リウム(pＨ７.０)中０.２ Ｕ／ミリリットルの濃度に維
持する。２または２０時間後に残存する酵素活性を測定
した(表２参照)。
実施例２に従って得たＰＧＬ画分およびツィモモナス
(Ｚymomonas)から単離したスコウプス(Ｓcopes)の酵素
を、各々、２０℃で５０ミリモル／リットル リン酸カ
リウム(pＨ７.０)中０.２ Ｕ／ミリリットルの濃度に維
持する。２または２０時間後に残存する酵素活性を測定
した(表２参照)。
【００２９】
【表２】 ２０時間後の残存活性(％) 残存活性(％) ２時間 ２０時間 ツィモモナス・モビリス(Ｚymomonas mob.) ４５ ０ ロイコノストック・デキストラニカム (Ｌeuconostoc dex.) １００ １００
【００３０】実施例４ クレアチンキナーゼの測定：
【００３１】Ｉ．溶液 １．緩衝液：イミダゾール(０.１モル／リットル；pＨ
６.７)、グルコース(２０ミリモル／リットル)、酢酸マ
グネシウム(１０ミリモル／リットル)、ＥＤＴＡ(２ミ
リモル／リットル) ２．クレアチンリン酸溶液(３０ミリモル／リットル） ３．ＡＤＰ溶液（２ミリモル／リットル) ４．ヘキソキナーゼ溶液(２.５ Ｕ／ミリリットル) ５．ＮＡＤまたはＮＡＤＰ溶液(２ミリモル／リットル) ６．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液(１.
５Ｕ／ミリリットル) ７．ＰＧＬ溶液(１Ｕ／ミリリットル) ８．６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(１Ｕ／ミ
リリットル)イミダゾール緩衝液中に試料を希釈する。
６.７)、グルコース(２０ミリモル／リットル)、酢酸マ
グネシウム(１０ミリモル／リットル)、ＥＤＴＡ(２ミ
リモル／リットル) ２．クレアチンリン酸溶液(３０ミリモル／リットル） ３．ＡＤＰ溶液（２ミリモル／リットル) ４．ヘキソキナーゼ溶液(２.５ Ｕ／ミリリットル) ５．ＮＡＤまたはＮＡＤＰ溶液(２ミリモル／リットル) ６．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液(１.
５Ｕ／ミリリットル) ７．ＰＧＬ溶液(１Ｕ／ミリリットル) ８．６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(１Ｕ／ミ
リリットル)イミダゾール緩衝液中に試料を希釈する。
【００３２】II．方法 ３６５nmで測定；光路１.０cm；試験体積０.５ミリリッ
トル；温度３７℃；吸収係数ε＝３.４または３.５cm2
／μモル；試料体積０.０２ミリリットル。
トル；温度３７℃；吸収係数ε＝３.４または３.５cm2
／μモル；試料体積０.０２ミリリットル。
【００３３】III．計算
【数１】
【００３４】IV．結果 直線性、標準偏差(％)およびその結果の精度は、標準
法、例えばベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍa
nnheim)の“活性化ＣＫ ＮＡＣ”に匹敵するかまたはそ
れよりも良好である(表３参照)。
法、例えばベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍa
nnheim)の“活性化ＣＫ ＮＡＣ”に匹敵するかまたはそ
れよりも良好である(表３参照)。
【００３５】
【表３】
【００３６】特に低濃度ＣＫ−ＭＢではしばしば不正確
さが見られる。ＣＫ−ＭＢの測定は、対応する酵素を添
加することによって改良され、結果は、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ測
定シグナルの倍増化である。これは、方法１と比較して
方法２の非常に低いＣV値によって示される。対応する
ｘ値は、同一計算因子による測定シグナルの倍増を反映
する。したがって、ＣＫ−ＭＢ濃度を計算すると、クレ
アチンリン酸１モル当たりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
２モルを形成するという事実も考慮しなければならな
い。
さが見られる。ＣＫ−ＭＢの測定は、対応する酵素を添
加することによって改良され、結果は、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ測
定シグナルの倍増化である。これは、方法１と比較して
方法２の非常に低いＣV値によって示される。対応する
ｘ値は、同一計算因子による測定シグナルの倍増を反映
する。したがって、ＣＫ−ＭＢ濃度を計算すると、クレ
アチンリン酸１モル当たりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ
２モルを形成するという事実も考慮しなければならな
い。
【００３７】例えばＡＴＰおよびグルコースのような他
のパラメータは、同様に測定することができる。
のパラメータは、同様に測定することができる。
【図１】 ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬ
およびツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関するp
Ｈ安定性を示すグラフ。
およびツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関するp
Ｈ安定性を示すグラフ。
【図２】 ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬ
およびツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関する活
性至適条件を示すグラフ。
およびツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関する活
性至適条件を示すグラフ。
【図３】 ロイコノストック(Ｌeuconostoc)由来ＰＧＬ
およびツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関する温
度依存性を示すグラフ。
およびツィモモナス(Ｚymomonas)由来ＰＧＬに関する温
度依存性を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲオルク・ブルクハルト・クレッセ ドイツ連邦共和国デー−8122ペンツベル グ、アルプスピッツシュトラーセ６番
Claims (4)
- 【請求項１】 ＤＭＳＯを添加せずにpＨ７.０および２
０℃で約２０時間後に少なくとも９０％の６−ホスホグ
ルコノラクトナーゼ(ＰＧＬ)活性が存在し、ＰＧＬ活性
を有するロイコノストック(Ｌeuconostoc)属の微生物か
ら得ることができ、以下の特徴： （１）６.５〜７.０の至適pＨ； （２）約２５℃の至適温度；および （３）０.１ミリモル／リットル以下のミハエーリス定
数 を有することを特徴とする６−ホスホグルコノラクトナ
ーゼ画分。 - 【請求項２】 ロイコノストック菌株を培養する微生物
培養を行い、バイオマスからまたは培養ブロスから請求
項１記載の６−ホスホグルコノラクトナーゼ画分を単離
することを特徴とする微生物から該６−ホスホグルコノ
ラクトナーゼ画分の製造方法。 - 【請求項３】 ロイコノストック・メセンテロイデス・
デキストラニカム(Ｌeuconostoc mesenteroides dextra
nicum)(ＤＳＭ ２０１８７、ＮＣＩＢ ３３５５)を培養
する請求項２記載の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の６−ホスホグルコノラク
トナーゼ画分を使用することを特徴とする６−ホスホグ
ルコノラクトンおよび６−ホスホグルコノラクトンに酵
素的に変換することができる反応相手またはこれらの反
応において含まれる酵素の測定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028086A DE4028086A1 (de) | 1990-09-05 | 1990-09-05 | Stabile 6-phosphogluconolactonase, verfahren zu deren gewinnung sowie verwendung des enzyms zur bestimmung |
| DE4028086.1 | 1990-09-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0556778A JPH0556778A (ja) | 1993-03-09 |
| JP2579082B2 true JP2579082B2 (ja) | 1997-02-05 |
Family
ID=6413609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3223936A Expired - Lifetime JP2579082B2 (ja) | 1990-09-05 | 1991-09-04 | 安定な６−ホスホグルコノラクトナーゼ、その製造方法および該酵素の使用 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5426034A (ja) |
| EP (1) | EP0474116B1 (ja) |
| JP (1) | JP2579082B2 (ja) |
| AT (1) | ATE125567T1 (ja) |
| AU (1) | AU638658B2 (ja) |
| DE (2) | DE4028086A1 (ja) |
| DK (1) | DK0474116T3 (ja) |
| ES (1) | ES2077125T3 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MY142798A (en) * | 2003-03-04 | 2010-12-31 | Smithkline Beecham Corp | Methods for preventing glyconoylation of proteins |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122255B2 (de) * | 1971-05-05 | 1979-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Creatinin |
| JPS56169598A (en) * | 1980-05-26 | 1981-12-26 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Measuring composition |
| US4740488A (en) * | 1985-11-25 | 1988-04-26 | The University Of Michigan | Modified clay sorbents |
| JP2638877B2 (ja) * | 1988-02-10 | 1997-08-06 | 日本電気株式会社 | 免疫化学的測定法 |
-
1990
- 1990-09-05 DE DE4028086A patent/DE4028086A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-08-29 DE DE59106076T patent/DE59106076D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-29 DK DK91114528.2T patent/DK0474116T3/da active
- 1991-08-29 ES ES91114528T patent/ES2077125T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-29 AT AT91114528T patent/ATE125567T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-08-29 EP EP91114528A patent/EP0474116B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-03 AU AU83536/91A patent/AU638658B2/en not_active Ceased
- 1991-09-04 JP JP3223936A patent/JP2579082B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-02-25 US US08/022,873 patent/US5426034A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BIOCHEM.INT.=1988 * |
| BRITISH J. HAEMATOLOGY=1986 * |
| FEBS LETT.=1985 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0474116B1 (de) | 1995-07-26 |
| JPH0556778A (ja) | 1993-03-09 |
| US5426034A (en) | 1995-06-20 |
| DE4028086A1 (de) | 1992-03-12 |
| AU8353691A (en) | 1992-05-14 |
| ES2077125T3 (es) | 1995-11-16 |
| DE59106076D1 (de) | 1995-08-31 |
| EP0474116A1 (de) | 1992-03-11 |
| ATE125567T1 (de) | 1995-08-15 |
| AU638658B2 (en) | 1993-07-01 |
| DK0474116T3 (da) | 1995-11-27 |
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