CN103190478A

CN103190478A - 含Levan果聚糖的酸奶的制备方法

Info

Publication number: CN103190478A
Application number: CN2013101218131A
Authority: CN
Inventors: 肖敏; 付峰; 卢丽丽
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN103190478B

Abstract

本发明涉及含Levan果聚糖的酸奶的制备方法，包括如下步骤：（1）将产Levan蔗糖酶的菌株经活化培养和产酶发酵培养制得发酵培养液；（2）离心收集发酵液上清或者菌体；（3）向发酵液上清中添加硫酸铵粉末，离心，收集蛋白沉淀；或者，将菌体经超声波破碎离心后，上清液中添加硫酸铵粉末，离心，收集蛋白沉淀；纯化后制得纯酶蛋白Levansucrase；（4）向原料奶中添加蔗糖和纯酶蛋白Levansucrase，然后接种乳酸杆菌，经发酵，制得含Levan果聚糖的酸奶。本发明利用微生物Levan蔗糖酶在酸奶发酵的同时生成Levan果聚糖，从而直接获得含有功能性多糖的酸奶新品种，避免了复杂的多糖纯化工艺，应用前景广阔。

Description

含Levan果聚糖的酸奶的制备方法

技术领域

本发明涉及含Levan果聚糖的酸奶的制备方法，属于乳制品技术领域。

背景技术

Levan果聚糖是一类来源于植物或微生物的果聚糖，分子中含有大量β-(2,6)-果糖苷键组成的聚糖主链及少量β-(2,1)-果糖苷键组成的支链，与主要是由β-(2,1)-果糖苷键组成的菊粉(Inulin)类果聚糖显著不同。来源于植物的Levan果聚糖分子量在2000～3,3000Da范围内，而来源于微生物的Levan果聚糖分子量较高，通常在2×10⁶～100×10⁶Da。Levan果聚糖是功能性食品的重要组成部分，不易被人体消化，且热量低，微生物来源的Levan果聚糖具有一定的抗肿瘤、抗内毒素、降胆固醇、降血糖等免疫保健功能。Levan果聚糖可通过微生物Levan蔗糖酶(Levansucrase,EC2.4.1.10)以蔗糖为底物转果糖基聚合而成，反应同时还会生成低聚果糖。

近年来，酸奶等乳制品越来越得到消费者的青睐，尤其添加功能性低聚糖的成品酸奶更是备受关注，但目前酸奶中添加的功能性低聚糖的品种较少。此外，由于功能性多糖制备纯化工艺较为繁琐、成本高，因而添加功能性多糖的成品酸奶的研究和开发还是空白。目前酸奶中所添加的成本较低的多糖一般仅作为增稠剂使用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种含Levan果聚糖的酸奶的制备方法。

本发明技术方案如下：

含Levan果聚糖的酸奶的制备方法，包括如下步骤：

（1）将产Levan蔗糖酶的菌株进行活化培养，将活化菌以1～10%（v/v）的接种量接种于产酶发酵培养基中，在30～45℃的条件下培养16～48小时，获得最终发酵培养液；

上述产酶发酵培养基组分如下，单位为g/L：

牛肉膏0.5～20，酵母粉0.2～10，磷酸二氢钾2.5～10，磷酸氢二钾2.5～10，氯化钠0.2～5，蔗糖或棉籽糖10～200，七水硫酸镁0.1～1，pH4.0～8.0。

（2）将步骤（1）中获得的发酵培养液以10000～12000转/分的速度，离心25～30分钟，收集发酵液上清或者菌体；

（3）将步骤（2）制得的发酵液上清置于冰浴中，然后添加硫酸铵粉末至饱和度达到60～80%，在10000～12000转/分的条件下离心25～30分钟，收集沉淀即为蛋白沉淀；或者，将步骤（2）制得的菌体经超声波破碎离心，上清液置于冰浴中，然后添加硫酸铵粉末至饱和度达到60～80%，在10000～12000转/分的条件下离心25～30分钟，收集沉淀即为蛋白沉淀；

将蛋白沉淀重悬于30～50ml的20～100mM、pH7.0～9.0的Tris-HCL缓冲液中，透析除盐得到粗酶液；将粗酶液进行DEAE阴离子交换柱纯化，获得纯酶蛋白Levansucrase；

（4）按质量百分数为5～15%的添加量向原料奶中添加蔗糖，搅拌均匀，然后按每百毫升原料奶添加100～300μg的比例添加步骤（3）中制得的纯酶蛋白Levansucrase，按原料奶质量百分数为4%～10%的接种量接种乳酸杆菌，混合均匀，在40～45℃条件下，密封静置4～8小时，然后在4℃条件下冷藏6～24h，制得含Levan果聚糖的酸奶。

根据本发明优选的，还包括向步骤（4）制得的含Levan果聚糖的酸奶中添加食品添加剂的步骤。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的产Levan蔗糖酶的菌株选自：地衣芽孢杆菌ATCC14580（Bacillus licheniformis）、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）CICC10232、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC6051或产左聚糖微杆菌（Microbacterium laevaniformans）ATCC15953之一。

上述ATCC为美国标准生物品收藏中心菌种保藏中心缩写，CICC为中国工业微生物菌种保藏管理中心缩写。

根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的产Levan蔗糖酶的菌株选自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）ATCC14580。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的活化培养为在20～45℃的条件下，于LB培养基中活化培养8～24小时；

LB培养基组分如下，单位为g/L：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH7.0。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的产酶发酵培养基组分如下，单位为g/L：牛肉膏1.0，酵母粉0.6，磷酸二氢钾3.0，磷酸氢二钾3.0，氯化钠1.0，蔗糖100，七水硫酸镁0.2，pH5.0。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中的Tris-HCl缓冲液为50mM、pH7.5的缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤（3）中超声波破碎条件为超声功率400W，超声间隔5s，超声时间30min。

所述步骤（4）中的乳酸杆菌为保加利亚乳杆菌CICC6046、嗜热链球菌CICC6038等酸奶制备用菌。

根据本发明优选的，所述步骤（4）中乳酸杆菌的接种量为4%。

有益效果

1、本发明通过先制备纯酶蛋白Levansucrase，然后将纯酶蛋白Levansucrase、蔗糖添加到牛奶中，接种乳酸菌，在牛奶发酵的同时合成Levan果聚糖和部分低聚果糖，该工艺简单合理，避免了直接添加Levan果聚糖或低聚果糖的高成本问题；并且所获得的酸奶中的Levan果聚糖具有免疫保健和增稠剂的双重功能，低聚果糖具有益生元功能，极大提升了酸奶产品的附加值，减少了其他增稠剂的添加量。

2、本发明利用微生物Levan蔗糖酶在酸奶发酵的同时生成Levan果聚糖，从而直接获得含有功能性多糖的酸奶新品种，避免了复杂的多糖纯化工艺，操作简单，成本低，应用前景广阔。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的描述，但本发明所保护范围不限于此。

菌种来源

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580购自美国标准生物品收藏中心菌种保藏中心；

发酵运动单胞菌（Zymomonasmobilis）CICC10232购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；

产左聚糖微杆菌（Microbacterium laevaniformans）ATCC15953购自美国标准生物品收藏中心；

德式保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulqaricus）CICC6046购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）CICC6038购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；

所得产品酸奶的糖组成采用薄层扫描分析法分析，设备及条件如下：

取制得的酸奶煮沸离心后取上清，将上清稀释10倍左右后取0.5μl在薄层层析板（Silicagel60,Merck）上点样，在展层剂（正丁醇:无水乙醇:水=5:3:2）中展开，雾喷显色剂（20%硫酸溶液+0.5%的3,5-二羟基甲苯），于120℃烘烤5分钟，糖斑点显色后，将薄板扫描后通过软件ImageJ v1.28（http://rsb.info.nih.gov/ij/）进行定量分析。

苯酚-硫酸法检测所得产品酸奶中糖含量所用设备及条件如下：

取制得的Levan果聚糖酸奶煮沸离心后上清中加入体积分数为1/1的冷乙醇，静置12h后离心取沉淀即为Levan多糖，沉淀用90%乙醇洗涤3次后用苯酚-硫酸法测定Levan含量。

实施例1

含Levan果聚糖的酸奶的制备方法，包括如下步骤：

（1）将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580菌株接种于LB培养基中，在30℃的条件下，活化培养12小时，将活化菌以4%（v/v）的接种量接种于产酶发酵培养基中，在30℃、200转/分的条件下培养24小时，制得发酵培养液；

上述产酶发酵培养基组分如下，单位为g/L：

牛肉膏1.0，酵母粉0.6，磷酸二氢钾3.0，磷酸氢二钾3.0，氯化钠1.0，蔗糖100，七水硫酸镁0.2，pH5.0。

（2）将步骤（1）中获得的发酵培养液以12000转/分的速度，离心30分钟，收集发酵液上清；

（3）将步骤（2）制得的发酵液上清置于冰浴中，然后添加硫酸铵粉末至饱和度达到80%，在12000转/分的条件下离心25分钟，收集沉淀即为蛋白沉淀；将蛋白沉淀重悬于50ml的50mM、pH7.5的Tris-HCL缓冲液中，透析除盐得到粗酶液；将粗酶液进行DEAE阴离子交换柱（GE Healthcare）纯化，获得纯酶蛋白Levansucrase；

（4）按质量百分数为8%的添加量向原料奶中添加蔗糖，搅拌均匀，然后按每百毫升原料奶添加200μg的添加量添加步骤（3）中制得的纯酶蛋白Levansucrase，按原料奶质量百分数为4%的接种量接种保加利亚乳杆菌CICC6046、嗜热链球菌CICC6038，混合均匀，在40℃条件下，密封静置6小时，然后在4℃条件下冷藏12h，制得含Levan果聚糖的酸奶。

经薄层扫描分析检测，所得的Levan果聚糖酸奶中其糖组分含量比例为：Levan12.1%，低聚果糖19.5%，乳糖19.5%，葡萄糖和果糖15.8%，蔗糖33.1%。经苯酚-硫酸法测得产品中Levan含量为15.1mg/ml。

用Viscometer Brookfield DV-E型粘度计（美国）测量含Levan果聚糖酸奶的粘度，所用转速为12转/分，温度为30℃。经测定，用上述方法制备得到的酸奶的粘度为2310cP。

实施例2

如实施例1所述的含Levan果聚糖的酸奶的制备方法，不同之处在于：

步骤（1）中：产Levan蔗糖酶的菌株为发酵运动单胞菌（Zymomonas mobilis）CICC10232。

产酶发酵培养基组分如下，单位为g/L：

牛肉膏1.0，酵母粉10.0，磷酸二氢钾2.0，磷酸氢二钾2.0，氯化钠1.0，蔗糖150，七水硫酸镁0.3，pH6.0。

将活化菌以4%（v/v）的接种量接种于产酶发酵培养基中，在37℃、200转/分的条件下培养28小时，制得发酵培养液；

步骤（3）中，将步骤（2）获得的菌体经超生波破碎后，离心，上清液置于冰浴中，然后添加硫酸铵粉末至饱和度达到60%，在12000转/分的条件下离心25分钟，收集沉淀即为蛋白沉淀；纯化方法与实施例1相同。

酸奶制备过程与实施例1相同。

经薄层扫描分析检测，所得的Levan果聚糖酸奶中其糖组分含量比例为Levan10.8%，低聚果糖17.3%，乳糖20.3%，葡萄糖和果糖12.3%，蔗糖39.3%。经苯酚-硫酸法测得产品中Levan含量为12.9mg/ml。经粘度计测得酸奶粘度为2189cP。

实施例3

如实施例2所述的含Levan果聚糖的酸奶的制备方法，不同之处在于：

步骤（1）中：产Levan蔗糖酶的菌株为产左聚糖微杆菌（Microbacterium laevaniformans）ATCC15953。

产酶发酵培养基组分如下，单位为g/L：

牛肉膏10，酵母粉3，磷酸二氢钾10，磷酸氢二钾10，氯化钠1.0，蔗糖30，七水硫酸镁0.5，pH6.5。

培养条件与实施例1相同。

酶的制备及酸奶制备过程与实施例1相同

经薄层扫描分析检测，所得的Levan果聚糖酸奶中其糖组分含量比例为Levan8.7%，低聚果糖15.2%，乳糖19.3%，葡萄糖和果糖13.3%，蔗糖43.5%。经苯酚-硫酸法测得产品中Levan含量为10.3mg/ml。经粘度计测得酸奶粘度为2015cP。

对比例

按质量百分数为8%的添加量向原料奶中添加蔗糖，搅拌均匀，然后按原料奶质量百分数为4%的接种量接种保加利亚乳杆菌CICC6046、嗜热链球菌CICC6038，混合均匀，在40℃条件下，密封静置6小时，然后在4℃条件下冷藏12h。

检测制得的酸奶的粘度为1573cP。

在实施例中，最终酸奶成品的粘度一般在2000cP以上，而不加Levan蔗糖酶制得的酸奶的粘度只有1573cP，故本申请所述技术方案可以少加或不加增稠剂。

Claims

1.含Levan果聚糖的酸奶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

上述产酶发酵培养基组分如下，单位为g/L：

牛肉膏0.5～20，酵母粉0.2～10，磷酸二氢钾2.5～10，磷酸氢二钾2.5～10，氯化钠0.2～5，蔗糖或棉籽糖10～200，七水硫酸镁0.1～1，pH4.0～8.0。（2）将步骤（1）中获得的发酵培养液以10000～12000转/分的速度，离心25～30分钟，收集发酵液上清或者菌体；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括向步骤（4）制得的含Levan果聚糖的酸奶中添加食品添加剂的步骤。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的产Levan蔗糖酶的菌株选自：地衣芽孢杆菌ATCC14580（Bacillus licheniformis）、运动发酵单胞菌（Zymomonasmobilis）CICC10232、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC6051或产左聚糖微杆菌（Microbacterium laevaniformans）ATCC15953之一。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的产Levan蔗糖酶的菌株选自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）ATCC14580。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的活化培养为在20～45℃的条件下，于LB培养基中活化培养8～24小时；

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的产酶发酵培养基组分如下，单位为g/L：牛肉膏1.0，酵母粉0.6，磷酸二氢钾3.0，磷酸氢二钾3.0，氯化钠1.0，蔗糖100，七水硫酸镁0.2，pH5.0。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的Tris-HCl缓冲液为50mM、pH7.5的缓冲液。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中超声波破碎条件为超声功率400W，超声间隔5s，超声时间30min。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中乳酸杆菌的接种量为4%。