CN102212508A - 高比活耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AIO6及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高比活耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AIO6及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的AiiA-AIO6蛋白，是一种新的N-酰基高丝氨酸内酯酶，该酶比活力高、耐热，具有较强的蛋白酶抗性和较好的降解各种底物的能力，可作为一种新型的生防酶制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种高比活耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AIO6及其编码基因与应用。
背景技术
群体感应(quorum sensing，QS)是细菌的一种调控机制，指细菌通过感应特定信号分子的浓度来感知周围环境中自身或其它细菌的数量，并调整相关基因的表达以适应环境的变化，这些特定的信号分子(又称为自诱导物)。
革兰氏阴性细菌中典型的QS系统包括负责信号产生的luxI类基因、反应调节因子luxR类基因和LuxR蛋白结合区luxbox。革兰氏阴性菌群体感应系统中最典型的一类信号分子是N-酰基-高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)类化合物。细菌细胞通过产生AHLs进行信息交流，调控某些特定生理性状的表达。
随着对QS系统的深入研究，发现多种革兰氏阴病原细菌的重要生理过程，包括毒性因子在内的次生代谢物的产生等均受QS系统的调控。如对人类主要条件致病菌铜绿假单胞菌芯片分析表明，在基因组中300多个基因受QS系统调控，其中包括了形成胞外蛋白酶、毒素和脂肪酶等致病因子表达的基因。再如引起植物软腐病的重要致病菌胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)中，QS系统调控了包括合成和分泌能降解植物细胞壁的水解酶的表达及其它与寄主植物互作的毒性因子的产生。因此可以利用QS系统作为细菌病害防治的新靶点。
目前已将干扰QS系统中AHL信号分子的合成作为生物防治革兰氏阴性病原菌的新靶标。而利用QS调控系统控制细菌病害的途径之一是寻找能降解信号分子的酶，使AHL信号分子不能达到调控的临界浓度以阻断细菌间的信息交流从而防止病原菌的感染。目前已报道的N-酰基高丝氨酸内酯酶，比活力较低且耐热性较差，限制了其应用价值。因此，发掘比活力更高、耐热性更好的新酶，成为目前研究的一个重要方向。
发明内容
本发明公开了一种高比活耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AIO6及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白(AiiA-AIO6蛋白)，来自苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能，为如下(a)或(b)或(c)：
(a)序列表中序列1自N末端第2至269位氨基酸残基组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)或(b)或(c)中的AiiA-AIO6蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基数 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述AiiA-AIO6蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述AiiA-AIO6蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述蛋白的基因(AiiA-AIO6基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：
1)序列表中序列2自5’末端第4至807位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2自5’末端第4至810位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS 和1×SSC，0.1％ SDS 各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；所述大肠杆菌优选为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
所述重组菌优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21pET28a(+)/aiia-AIO6，其保藏号为CGMCC No.4621。
扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述蛋白可用于降解N-酰基高丝氨酸内酯。
所述N-酰基高丝氨酸内酯具体可为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-hydroxy-C12-HSL和3-hydroxy-C14-HSL中的至少一种。
所述降解的温度可为0℃-50℃，优选为30℃。
所述降解的pH值可为6.0-9.0，优选为8.0。
本发明提供的AiiA-AIO6蛋白，是一种新的N-酰基高丝氨酸内酯酶，该酶比活力高、耐热，具有较强的蛋白酶抗性和较好的降解各种底物的能力，可作为一种新型的生防酶制剂。
附图说明
图1为AiiA-AIO6蛋白的SDS-PAGE分析。
图2为标准曲线。
图3为N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AO6的最适pH。
图4为N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AO6的pH稳定性。
图5为N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AO6作用的最适温度。
图6为N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AO6的热稳定性。
图7为N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AO6的蛋白酶抗性分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pEASY-T3购自北京全式金生物技术有限公司。大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，载体pET-28a(+)均购自于Invitrogen公司。内切酶购自TaKaRa公司。连接酶购自Invitrogen公司。胰蛋白酶(Trypsin)、α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)、蛋白酶K(Proteinase K)、枯草杆菌蛋白酶A(Subtilisin A)、胶原蛋白酶(Collagenase)、牛血清白蛋白均为Sigma(USA)产品。
N-butyryl-L-homoserine lactone(C4-HSL)、
N-hexanoyl-L-homoserine lactone(C6-HSL)、
N-heptanoyl-L-homoserine lactone(C7-HSL)、
N-Octanoyl-L-homoserine lactone(C8-HSL)、
N-decanoyl-L-homoserine lactone(C10-HSL)、
N-dodecanoyl-L-homoserine lactone(C12-HSL)、
N-tetradecanoyl-L-homoserine lactone(C14-HSL)、
N-(3-Oxohexanoyl)-D-homoserine lactone(3-oxo-C6-HSL)、
N-(3-Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C8-HSL)、
N-(3-Oxodecanoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C10-HSL)、
N-3-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone(3-oxo-C12-HSL)、
N-(3-Oxotetradecanoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C14-HSL)、
N-(3-hydroxy)-dodecanoyl-homoserine lactone(3-hydroxy-C12-HSL)、
N-(3-Hydroxytetradecanoyl)-DL-homoserine lactone(3-hydroxy-C14-HSL)均购自Sigma(St.Louis，Mo，USA)。
LB培养基：溶剂为水；溶质及其浓度如下：1％(质量百分含量)蛋白胨、0.5％(质量百分含量)酵母提取物、1％(质量百分含量)NaCl。
ATmm培养基：KH2PO410.75g/L，NaOH1.76g/L，(NH4)2SO41.98g/L，MgSO4·7H2O0.15g/L，CaCl26.6mg/L，FeSO4·7H2O 7.5mg/L，MnSO4·H2O 1.2mg/L，葡萄糖5g/L，琼脂粉20g/L，用超纯水定容至1L。
KYC55(Agrobacterium tumefaciens KYC55)：公众可从中国农业科学院饲料研究所获得；参考文献：Cho，K.，C.Fuqua，and S.C.Winans.1997. Transcriptional regulation and locations of Agrobacterium tumefaciens genes required for complete ca
实施例1、苍白杆菌AIO6的分离与鉴定
一、菌的分离
将土壤样品按1∶10(土∶水)用无菌水重悬，用无菌水稀释至10-8后涂布于LB平板(涂加5μM C6-HSL和3-oxo-C6-HSL)，25℃培养5天后，将菌落挑至液体LB中25℃培养3天，10000rpm离心1min收集菌体，重悬于0.1mol/L PBS缓冲液(pH 8.0)，超声波破碎后12000rpm离心5min，收集上清检测N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活。
得到一株有酶活菌株，将该菌株命名为AIO6。
二、鉴定
扩增菌株AIO6的16S rDNA，再测序，测序结果与Genbank数据库中的核苷酸序列比对，证明菌株AIO6为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)，将其命名为苍白杆菌AIO6。
三、蛋白及其编码基因的发现
1、苍白杆菌AIO6接菌至LB培养基中，30℃培养24h。取1ml菌液，10000rpm离心2min收集菌体。使用TIANamp Bacteria DNA Kit(Tiangen，Beijing，China)提取基因组DNA，-20℃保存备用。
2、PCR扩增
以步骤1提取的基因组DNA为模板，用AIO6-F和AIO6-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
AIO6-F：5′-AAATCCCATGAAATCGAGACCAGTC-3′；
AIO6-R：5′-GGCCGTGCAGTCGCGCATGAAA-3′。
PCR反应参数：95℃5min；94℃30sec，59℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃10min。
3、测序
将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，回收800bp左右的条带与载体pEASY-T3连接，得到重组质粒。重组质粒的测序结果表明，在载体pEASY-T3中插入了序列表的序列2自5’末端第4至807位核苷酸所示的DNA。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为AiiA-AIO6蛋白，由269个氨基酸残基组成。AiiA-AIO6蛋白属于N-酰基高丝氨酸内酯酶。将AiiA-AIO6蛋白的编码基因命名为AiiA-AIO6基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示(810bp)。
实施例2、重组菌的制备
一、重组表达载体的构建
1、合成序列表的序列2所示的DNA(AiiA-AIO6基因)。
2、以步骤一合成的DNA为模板，用A6-F和A6-R组成的引物对(靶序列如序列表的序列3所示)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
A6-F：5′-CGGAATTCAAATCCCATGAAATCGAGACCAGTC-3′(划线部分为EcoR I酶切位点)；
A6-R：5′-TTAAGCGGCCGCTCAGGCCGTGCAGTCG-3′(划线部分为Not I酶切位点)。
2、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切载体pET-28a(+)，回收载体骨架(约5.4kp)。
4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a(+)/aiia-AIO6。根据测序结果，对重组质粒pET28a(+)/aiia-AIO6的结构描述如下：在载体pET-28a(+)的EcoR I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第4至810位核苷酸所示的DNA。
二、重组菌和对照菌的构建
用重组质粒pET28a(+)/aiia-AIO6热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到重组菌。
将重组菌中的一株命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21pET28a(+)/aiia-AIO6，已于2011年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4621。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21pET28a(+)/aiia-AIO6 CGMCC No.4621简称重组菌aiia-AIO6。
用载体pET-28a(+)热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到对照菌。
五、重组菌和对照菌的诱导、表达和纯化
1、将重组菌aiia-AIO6接种于3mL LB培养液(含50μg/mL的卡那霉素)中，37℃振荡培养过夜，得到过夜培养液。
2、取100μL过夜培养液接种至的20mL LB培养液(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-0.8)，然后加入终浓度1mol/L的IPTG(诱导剂)，震荡培养(20℃、180rpm、旋转半径1.3cm)12h，得到培养液。
3、将步骤2得到的培养液12,000rpm离心5min(离心半径6cm)，分别收集上清和细胞沉淀。
4、将细胞沉淀用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)重悬，超声破碎后12,000rpm离心10min(离心半径6cm)，收集上清。
5、将步骤4得到的上清进行亲和层析
层析柱的内径为1.4cm，长度为1cm，体积为1.5cm3。
Ni-NTA Agarose，Cat.NO.30210，购于QIAGEN公司。
镍亲和层析柱洗脱缓冲液(pH均为7.6，溶剂均为水)：
NTA-0：20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
NTA-20：20mmol/L Tris-HCl，20mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
NTA-40：20mmol/L Tris-HCl，40mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
NTA-60：20mmol/L Tris-HCl，60mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
NTA-80：20mmol/L Tris-HCl，80mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
NTA-100：20mmol/L Tris-HCl，100mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
NTA-200：20mmol/L Tris-HCl，200mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
NTA-300：20mmol/L Tris-HCl，300mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，10％(g/100mL)甘油。
每种洗脱缓冲液的洗脱体积均为5mL，收集NTA-300过柱后的液体(AiiA-AIO6蛋白液)。
用对照菌代替重组菌进行步骤1至5，收集NTA-300过柱后的液体(对照液)。
诱导、表达和纯化过程中的蛋白电泳图见图1。图1中，1为对照菌诱导后的CTP(步骤4的上清)；2：重组菌诱导前的CTP；3：重组菌诱导后的CTP(步骤3的上清)；4：重组菌诱导后的CTP(步骤4的上清)；M：低分子量蛋白质Marker；5：AiiA-AIO6蛋白液；CTP即细胞总蛋白。重组菌纯化后得到电泳纯的单一条带，分子量约为35kDa(与预测分子量相近)。对照菌没有得到目标大小的蛋白。
六、酶活测定
N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测方法如下(琼脂平板扩散法)：
1、将3-oxo-C8-HSL(底物)溶于0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)中，使其终浓度为1mg/L，即为3-oxo-C8-HSL溶液；ATmm培养基平板用手术刀切割成4×60mm的胶条。
2、标准曲线制备
分别向0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)中添加10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005和0.001μL的3-oxo-C8-HSL溶液，用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)将体系定容至200μL，摇匀；30℃温育30min后，反应体系中加入50uL 10％(质量百分含量)SDS水溶液终止反应；用牙签将检测菌(KYC55)间隔4mm点接于胶条上，将10uL的反应终止的反应液滴至胶条左端，30℃培养24h后计数变蓝点数，计算距离(mm)，以加入3-oxo-C8-HSL物质量为纵轴(y)，以扩散距离为横轴(x)，建立回归方程。
回归方程：y＝0.00000652×e0.348x；e＝2.718281828459045。
3、待测溶液的酶活测定
反应体系：将20μL待测溶液，179μL的0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)和1μL3-oxo-C8-HSL溶液混合，摇匀；30℃温育30min后，反应体系中加入50uL 10％(质量百分含量)SDS水溶液终止反应；用牙签将检测菌(KYC55)间隔4mm点接于胶条上，将10uL反应终止的反应液滴至胶条左端，30℃培养24h后计数变蓝点数，计算距离，按酶活计算公式计算待测溶液的酶活。
酶活(U/mL)单位定义：在30℃下每分钟分解1nmol 3-oxo-C8-HSL的酶量被定义为一个酶活单位。
以回归方程(见图2)为基础建立如下酶活计算公式：
酶每活(U)＝6.52×(1.4163Xck-1.4163Xs)×50/30/106
Xs为待测溶液进行上述处理后的扩散距离；Xck为用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)代替待测溶液进行上述处理后的扩散距离。
将AiiA-AIO6蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)配制为0.02mg/mL的溶液(作为待测溶液甲)，进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测。将对照液用0.1mol/LPBS缓冲液(pH8.0)稀释(稀释倍数同AiiA-AIO6蛋白液)，作为待测溶液乙进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测。
待测溶液甲的酶活为877.04U/mL。待测溶液乙的酶活为0U。AiiA-AIO6蛋白的比活力＝待测溶液甲的酶活/待测溶液甲中的总蛋白浓度＝583.33U/mg。AiiA-AIO6蛋白动力学的测定结果为Vmax＝121.95nmol/(mg·min)，Km＝0.015mmol/L。
实施例3、AiiA-AIO6蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的酶学性质
一、最适pH
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)配制为0.02mg/mL的溶液(作为待测溶液)，进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测(活性检测中，除了缓冲液其它同实施例2的步骤六的3)。
分别采用如下几种缓冲液：
pH 4.0、5.0、6.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；
pH 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0的0.1mol/L PBS缓冲液；
pH 8.0、8.5、9.0的Tris-HCl缓冲液；
pH 9.0、10.0、11.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液(NaOH-Gly)。
将采用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)时待测溶液的酶活记为100％(酶活值为877.04U/mL)。采用各种缓冲液的相对酶活力见图3。采用McIlvaine缓冲液，pH4.0时的相对酶活为0％，pH5.0时的相对酶活为0％，pH6.0时的相对酶活为97.03％。采用PBS缓冲液，pH5.0时的相对酶活为0％，pH6.0时的相对酶活为97.14％，pH7.0时的相对酶活为99.58％，pH7.5时的相对酶活为99.72％，pH8.0时的相对酶活为100％。采用Tris-HCl缓冲液，pH8.0时的相对酶活为57.35％，pH8.5时的相对酶活为57.35％，pH9.0时的相对酶活为56.22％。采用甘氨酸-NaOH缓冲液，pH9.0时的相对酶活为35.82％，pH10.0时的相对酶活为12.48％，pH11.0时的相对酶活为2.41％。AiiA-AIO6蛋白的最适作用pH为8.0，采用PBS缓冲液在pH6.0-8.0保持90％以上的相对酶活性，pH低于5或高于10.0几乎丧失所有酶活。
二、pH稳定性
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白液用不同缓冲液配制为0.02mg/mL的溶液，30℃下处理1h后作为待测溶液进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测(活性检测的方法同实施例2的步骤六的3)。
分别用如下几种缓冲液进行处理：pH 4.0、5.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；pH 6.0、7.0、8.0的0.1mol/L PBS缓冲液；pH 9.0的Tris-HCl缓冲液；pH 10.0、11.0、12.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液(NaOH-Gly)。
将pH为8.0处理1h后待测溶液的酶活记为100％，此时的酶活值为877.04U/mL。采用各种缓冲液处理后的待测酶液的相对酶活力见图4。pH7.0时的相对酶活为100.10％、pH8.0时的相对酶活为100％、pH9.0时的相对酶活为100.00％、pH10时的相对酶活为99.92％、pH11时的相对酶活为99.92％、pH12时的相对酶活为100％。AiiA-AIO6蛋白在pH范围为7.0-12.0间都很稳定，保持80％以上的酶活。
三、AiiA-AIO6蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的最适温度
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)配制为0.02mg/mL的溶液(作为待测溶液)，进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测(活性检测中，除了温度其它同实施例2的步骤六的3)。
将温度为30℃时待测溶液的酶活记为100％，此时的酶活值为877.04U/mL。采用各种温度的相对酶活力见图5。0℃时的相对酶活为99.53％、10℃时的相对酶活为99.53％、20℃时的相对酶活为99.53％、30℃时的相对酶活为100％、40℃时的相对酶活为94.83％、50℃时的相对酶活为77.34％、60℃时的相对酶活为45.81％，60℃时的相对酶活不足1％。AiiA-AIO6蛋白的最适作用温度30℃。
四、AiiA-AIO6蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的热稳定性
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)配制为0.02mg/mL的溶液，在不同温度下(80℃或90℃)分别保温不同时间后作为待测溶液进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测(活性检测的方法同实施例2的步骤六的3)。
将未经保温处理的待测溶液的酶活记为100％，此时的酶活值为877.04U/mL。采用各种温度和处理时间处理后的相对酶活力见图6。80℃保温1min为99.86％，80℃保温2min为99.86％、80℃保温3min为99.86％，80℃保温5min为99.86％、80℃保温10min为99.48％、80℃保温20min为99.48％、80℃保温30min为80.92％、80℃保温60min为74.85％。90℃保温1min为99.86％、90℃保温2min为99.86％，90℃保温3min为99.68％、90℃保温5min为99.68％、90℃保温10min为99.48％、90℃保温20min为86.58％、90℃保温30min为76.99％、90℃保温60min为0％。AiiA-AIO6蛋白热稳定性较好。
五、不同金属离子及相关化学试剂对酶活的影响
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白液作为待测溶液进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测(定容前在反应体系分别加入不同的化学试剂，使其在反应体系中的终浓度为1mM或10mM，其它同实施例2的步骤六的3)。
以不加入化学试剂的反应体系中待测溶液的酶活记为100％(CK)，此时的酶活值为877.04U/mL。加入各种化学试剂后待测酶液的相对酶活结果见表2。
表2不同金属离子及相关化学试剂对AiiA-AIO6的影响
六、AiiA-AIO6蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的抗性
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白分别溶于如下溶液(蛋白浓度为0.02mg/mL)：
溶液A：将胰蛋白酶溶于0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.0)，浓度为1mg/mL；
溶液B：将α-糜蛋白酶溶于0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.0)，浓度为1mg/mL；
溶液C：将蛋白酶K溶于0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，浓度为1mg/mL；
溶液D：将枯草杆菌蛋白酶A溶于0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，浓度为1mg/mL；
溶液E：将胶原蛋白酶溶于0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.5)，浓度为1mg/mL。
30℃保温30min或60min后，作为待测溶液进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测(活性检测的方法同实施例2的步骤六的3)。
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白溶于0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)，浓度为0.02mg/mL，30℃保温30min或60min后，作为待测溶液的对照，此时的酶活值均为877.04U/mL，该酶活作为100％。
各种处理后的相对酶活力见图7。除蛋白酶K外AiiA-AIO6蛋白对于胰蛋白酶、糜蛋白酶、枯草芽孢杆菌蛋白酶A、胶原蛋白酶都有很好的抗性。加入蛋白酶K保温30min的相对酶活为75.22％，保温60min的相对酶活为50.19％。
七、AiiA-AIO6蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的底物特异性
将实施例2制备的AiiA-AIO6蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液(pH8.0)配制为0.02mg/mL的溶液，作为待测溶液进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测(活性检测中，除了底物其它实施例2的步骤六的3)。
分别采用如下底物：C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C 14-HSL、3-oxo-C 10-HSL、3-oxo-C 14-HSL、3-hydroxy-C12-HSL、3-hydroxy-C14-HSL。
将3-oxo-C8-HSL作为底物的酶活记为100％，此时的酶活值为877.04U/mL。C4-HSL，C6-HSL，C7-HSL作为底物的相对酶活为316.14U/mL，C8-HSL作为底物的相对酶活为126.10U/mL，C10-HSL作为底物的相对酶活为287.74U/mL，3-oxo-C6-HSL作为底物的相对酶活为0.92U/mL，3-oxo-C14-HSL作为底物的相对酶活为29.46U/mL，3-oxo-C12-HSL作为底物的相对酶活为172.94U/mL，3-oxo-C10-HSL作为底物的相对酶活为232.17U/mL，3-hydroxy-C12-HSL作为底物的相对酶活为28.20U/mL。结果显示，除C12-HSL、C14-HSL、3-hydroxy-C14-HSL外，AiiA-AIO6蛋白对以上信号分子均具有降解作用。
Claims (10)
1.一种蛋白质，为如下(a)或(b)或(c)：
(a)序列表中序列1自N末端第2至269位氨基酸残基组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：它为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子：
1)序列表中序列2自5’末端第4至807位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2自5’末端第4至810位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中序列2所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求4或5所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；所述大肠杆菌优选为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21pET28a(+)/aiia-AIO6，其保藏号为CGMCC No.4621。。
8.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
9.权利要求1所述蛋白在降解N-酰基高丝氨酸内酯中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述N-酰基高丝氨酸内酯为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C 10-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-hydroxy-C12-HSL和3-hydroxy-C14-HSL中的至少一种；所述降解的温度为0℃-50℃，优选为30℃；所述降解的pH值为6.0-9.0，优选为8.0。
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