CN102965357A

CN102965357A - 具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA-RH5及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102965357A
Application number: CN2012105094453A
Authority: CN
Inventors: 周志刚; 张美超; 杨雅麟; 徐俐; 李青; 姚斌; 于会民; 何夙旭
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-03
Filing date: 2012-12-03
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明公开了具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA-RH5及其编码基因与应用。所述蛋白QsdA-RH5是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的QsdA-RH5蛋白，具有底物特异性，可降解各种无取代集团的N-酰基高丝氨酸内酯，其作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的比活力为292.83U/mg，在pH范围为4.0-12.0间都很稳定，可保持90%以上的酶活；热稳定性较好，在70℃保温10min的相对酶活仍为100%。本发明所提供的QsdA-RH5蛋白可用于制备新型生防酶制剂。

Description

具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA-RH5及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA-RH5及其编码基因与应用。

背景技术

1994年Fuqua等人首次发现微生物群体在生长过程中,因群体密度增加，其生理生化特性发生变化，出现少量菌体或单个菌体所不具备的一些特征。种群密度达到阈值时，所分泌的自诱导信号分子(autoinducers,AI)也达到一定浓度。AI与受体结合后，通过信号传导而影响特定基因表达，调控群体生理特征，这就是所谓的群体感应(quorum-sensing,QS)。

随着病原菌耐药性特别是多重耐药性的日益严重，抗菌药作用新靶点的发现和新型抗菌药物的研发显得尤为重要。众多病原菌的致病基因受到QS的调控，包括毒力因子、黏附因子以及介导病原菌抵抗宿主免疫和药物的相关基因。

在众多的AI中研究最为深入的是调控革兰氏阴性群体感应的信号分子酰基高丝氨酸内酯（AHL）。迄今发现的酰基高丝氨酸内酯降解酶有两大类，一类是酰基高丝氨酸内酯酶,一类是酰基高丝氨酸酰基转移酶。而红球菌中产生的一种氧化还原酶（QsdA）是一类具有酰基高丝氨酸内酯酶活性的淬灭酶。

目前已报道的N-酰基高丝氨酸内酯酶，底物特异性较为广泛，缺乏底物专一性，这使得在应用时对没有致病性的菌种的正常调控受到影响。因此，发掘专一性强，针对性强的新N-酰基高丝氨酸内酯酶，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA-RH5及其编码基因与应用。

本发明所提供的QsdA-RH5蛋白来自红平红球菌（Rhodococcus erythropolis），具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能，为如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）或（b）中的QsdA-RH5蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基数	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述QsdA-RH5蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述QsdA-RH5蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白的基因（qsdA-rh5基因）也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；所述大肠杆菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)；所述重组菌具体可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)QsdA-RH5，已于2012年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6569。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明保护所述蛋白在降解N-酰基高丝氨酸内酯或制备具N-酰基高丝氨酸内酯酶活性产品中的应用。

在上述应用中，所述N-酰基高丝氨酸内酯具体可为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL和C12-HSL中的至少一种。

在上述应用中，所述降解的pH值可为7.0—9.0，或7.0—8.0，或7.5—8.0；具体可为8.0、7.5、7.0或9.0。

在上述应用中，所述降解的温度可为0—65℃，或10—50℃，或10—40℃，或10—35℃，或20—35℃，或25—35℃，或30—35℃；具体可为0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃或65℃。

实验证明，本发明所提供的QsdA-RH5蛋白，具有底物特异性，可降解各种无取代集团的N-酰基高丝氨酸内酯的能力，其作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的比活力为292.83U/mg，在pH范围为4.0-12.0间都很稳定，可保持90%以上的酶活；热稳定性较好，在70℃保温10min的相对酶活仍为100%。本发明所提供的QsdA-RH5蛋白可用于制备新型生防酶制剂。

附图说明

图1为重组菌诱导、表达和纯化过程中产物的SDS-PAGE图。

图2为N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活测定标准曲线。

图3为QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶在不同pH下的相对酶活。

图4为QsdA-RH5蛋白经不同pH值处理后的N-酰基高丝氨酸内酯酶相对酶活。

图5为QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶在不同反应温度下的相对酶活。

图6为QsdA-RH5蛋白经70℃保温处理不同时间后的N-酰基高丝氨酸内酯酶相对酶活。

图7为QsdA-RH5蛋白在经不同蛋白酶处理后的N-酰基高丝氨酸内酯酶相对酶活。

图8为琼脂平板扩散法检测QsdA-RH5蛋白对底物C4-HSL降解。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

载体pEASY-T3：购自北京全式金生物技术有限公司。

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和载体pET-28a(+)均购自Invitrogen公司。内切酶购自TaKaRa公司。连接酶购自Invitrogen公司。胰蛋白酶（Trypsin）、α-糜蛋白酶（α-Chymotrypsin）、蛋白酶K(proteinase K)均为Sigma(USA)产品。

N-butyryl-L-homoserine lactone(N-丁酰-L-高丝氨酸内酯，C4-HSL)、

N-hexanoyl-L-homoserine lactone(N-己酰-L-高丝氨酸内酯，C6-HSL)、

N-heptanoyl-L-homoserine lactone（N-庚酰-L-高丝氨酸内酯，C7-HSL）、

N-Octanoyl-L-homoserine lactone(N-辛酰-L-高丝氨酸内酯，C8-HSL)、

N-decanoyl-L-homoserine lactone(N-癸酰-L-高丝氨酸内酯，C10-HSL)、

N-dodecanoyl-L-homoserine lactone(N-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯，C12-HSL)、

N-(3-oxo-hexanoyl)-D-homoserine lactone(N-3-氧-己酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C6-HSL)、

N-(3-oxo-octanoyl)-L-homoserine lactone(N-3-氧-辛酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C8-HSL)、

N-(3-oxo-decanoyl)-L-homoserine lactone（N-3-氧-癸酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C10-HSL）、

N-（3-oxo-dodecanoyl）-L-homoserine lactone(N-3-氧-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C12-HSL)、

N-(3-hydroxy)-dodecanoyl-homoserine lactone(N-3-氢-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯，3-hydroxy-C12-HSL)、

和N-(3-Hydroxytetradecanoyl)-DL-homoserine lactone(N-3-氢-十四烷酰-L-高丝氨酸内酯，3-hydroxy-C14-HSL)均购自Sigma。

LB液体培养基：溶剂为水；溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。

红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）BFXJ-1：中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC NO.02579。

根癌农杆菌KYC55（Agrobacterium tumefaciens Strain KYC55）：文献：Cho,K.,C.Fuqua,and S.C.Winans.Transcriptional regulation and locations ofAgrobacterium tumefaciens genes required for complete catabolism of octopine.J.Bacteriol.1997，179:1-8.公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。

紫色杆菌CV026(Chromobacterium violaceum Strain CV026)：文献：Kay H.McClean,Michael K.Winson,Leigh Fish,Adrian Taylor,Siri Ram Chhabra,MiguelCamara,Mavis Daykin,John H.amb,Simon Swift,Barrie W.Bycroft,Gordon S.A.B.Stewart and Paul Williams Quorum sensing and Chrornobacteriurnviolaceurn:exploitation of violacein production and inhibition for thedetection of N-acyl homoserine lactones Microbiology.1997,143,3703-3711.公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。

实施例1、红平红球菌QsdA-RH5蛋白及其编码基因的获得

取红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）BFXJ-1接种于LB液体培养基中，30℃培养24h，取1ml菌液，10000rpm离心2min收集菌体，提取基因组DNA，用引物Qs dA-F：5′-AGTTCAGTACAAACCGTTCGTG-3′和Qs dA-R：5′-TCAGCTCTCGAAGTACCG-3′进行PCR扩增；PCR反应条件为95℃5min、94℃30sec、55℃30sec、72℃1min，30个循环，72℃10min；将得到PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化1000bp左右的条带，与载体pEASY-T3连接，将得到的重组质粒进行测序，结果表明，该重组质粒为在载体pEASY-T3中插入了序列表序列2自5’末端第4位至第969位核苷酸所示的DNA。

将序列表序列1所示由323个氨基酸残基组成的蛋白质命名为QsdA-RH5蛋白。QsdA-RH5蛋白属于N-酰基高丝氨酸内酯酶。将QsdA-RH5蛋白的编码基因命名为qsda-rh5基因，其开放阅读框如序列表序列2所示（972bp）。

实施例2、QsdA-RH5蛋白的制备

一、重组表达载体的构建

1、合成序列表序列3所示的DNA，两端含有保护碱基及酶切识别序列。

2、以步骤1合成的DNA为模板，用QsdA 2-F和QsdA 2-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

QsdA 2-F：5′-CGGAATTCATGAGTTCAGTACAAACCGTTCGTG-3′(下划线碱基为EcoR I酶切识别序列)；

QsdA 2-R：5′-AAGCGGCCGCTCAGCTCTCGAAGTACCG-3′(下划线碱基为Not I酶切识别序列)。

2、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切载体pET-28a(+)，回收载体骨架（约5.4kb）。

4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pET28a(+)/qsda-rh5，经测序证实，重组质粒pET28a(+)/qsda-rh5为在载体pET-28a(+)的EcoR I和Not I酶切位点之间插入了序列表序列2自5’末端第4位至第972位核苷酸所示的DNA。

二、重组菌和对照菌的构建

用重组质粒pET28a(+)/qsda-rh5热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET28a(+)/qsda-rh5的重组菌。

将上述重组菌中的一株命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)QsdA-RH5，已于2012年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6569。将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)QsdA-RH5CGMCCNo.6569简称重组菌QsdA-RH5。

用载体pET-28a(+)热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到对照菌。

三、重组菌和对照菌的诱导、表达和纯化

1、将重组菌QsdA-RH5接种于3mL LB液体培养基（含50μg/mL的卡那霉素）中，37℃振荡培养过夜，得到过夜培养液。

2、取100μL过夜培养液接种至20mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃振荡培养2-3h（OD₆₀₀达到0.6-0.8），然后加入终浓度1mol/L的IPTG（诱导剂，诱导目的蛋白QsdA-RH5的表达），震荡培养（20℃、180rpm、旋转半径1.3cm）12h，得到诱导培养液。

3、将步骤2得到的诱导培养液12,000rpm离心5min（离心半径6cm），收集细胞沉淀。

4、将步骤3得到的细胞沉淀用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）重悬，超声破碎后12,000rpm离心10min（离心半径6cm），收集上清（即细胞破碎液）。

5、将步骤4得到的上清进行亲和层析纯化，使用层析柱（Ni-NTA Agarose，Cat.N0.30210,购于QIAGEN公司）的内径为1.4cm，长度为1cm，体积为1.5cm³，使用的洗脱缓冲液（pH均为7.6，溶剂均为水）如下：

NTA-0：含20mmol/L Tri s-HCl，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-20：含20mmol/L Tris-HCl，20mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-40：含20mmol/L Tris-HCl，40mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-60：含20mmol/L Tris-HCl，60mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-80：含20mmol/L Tris-HCl，80mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油。

洗脱过程：（1）将柱子用10-20mL水平衡，每次加5mL待流净后再加，以后皆同；（2）用NTA-0平衡15-20mL，然后上样5mL步骤4得到的上清液；（3）依次用5mLNTA-20、5mL NTA-40和5mL NTA-60进行洗脱，以去除杂蛋白；（4）用5mL NTA-80洗脱目的蛋白，收集过柱后的溶液，即为QsdA-RH5蛋白液。

用对照菌代替重组菌进行上述步骤1至5，收集NTA-80过柱后的液体（即对照液）。

将重组菌诱导、表达和纯化过程中的产物进行SDS-PAGE，结果如图1所示，其中，M为低分子量蛋白质Marker，1为重组菌经步骤5纯化后的蛋白液，2为没有经IPTG诱导培养的重组菌的细胞破碎液，3为经IPTG诱导培养后的重组菌的细胞破碎液。结果表明，重组菌经亲和层析纯化后得到电泳纯的单一条带，分子量约为38kDa（与预测分子量相近）；对照菌没有得到目标大小的蛋白。

四、N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活测定（琼脂平板扩散法）

1、将C7-HSL（N-酰基高丝氨酸内酯酶的一种底物，是一种革兰氏阴性细菌群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯，可使指示菌根癌农杆菌KYC55落显示为蓝色）溶于无水乙醇中，使其终浓度为10mmol/L，获得C7-HSL溶液；将ATmm培养基平板用手术刀切割成4mm×60mm大小的胶条。

上述ATmm培养基的制备方法如下：溶质及其浓度分别为KH₂PO₄10.75g/L，NaOH1.76g/L，(NH₄)₂SO₄1.98g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，CaCl₂6.6mg/L，FeSO₄·7H₂O7.5mg/L，MnSO₄·H₂O 1.2mg/L，葡萄糖5g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为超纯水。

2、标准曲线制备

分别向0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）中添加10μL、5μL、1μL、0.5μL、0.1μL、0.05μL、0.01μL、0.005μL和0.001μL步骤1得到的10mmol/L C7-HSL溶液，用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）分别定容至200μL，摇匀，得到一系列底物浓度不同的标准反应体系；

将上述一系列标准反应体系于35℃温育45min后，分别加入50μL 100g/L SDS水溶液终止反应，获得一系列标准终止反应液；

用牙签将检测菌（根癌农杆菌KYC55）间隔4mm点接于步骤1制得的胶条上，分别取10μL终止反应液滴至每个胶条的左端，将胶条置于30℃培养24h后计数变蓝点数，并计算扩散距离（mm），以标准反应体系中加入的C7-HSL物质量为纵轴（y），以扩散距离（mm）为横轴（x），建立回归方程，结果如图2所示，回归方程为：y=0.0005×e^0.2984x（R²=0.980）；e=2.718281828459045。

3、待测溶液的酶活测定

将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）稀释成总蛋白浓度为1.0mg/mL的溶液，作为待测溶液甲；将实施例2步骤三中5得到的对照液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）稀释（稀释倍数同QsdA-RH5蛋白液），作为待测溶液乙；将待测溶液甲和待测溶液乙分别按照如下方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测：

1）反应体系：将20μL待测溶液、179μL的0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）和1μL10mmol/L的C7-HSL（底物）溶液混合，摇匀；

2）反应条件：35℃温育45min；

3）终止：向反应体系中加入50μL 100g/L SDS水溶液终止反应；

4）检测：用牙签将检测菌（根癌农杆菌KYC55）间隔4mm点接于步骤1制得的胶条上，取10μL反应终止的反应液滴至该胶条的左端，30℃培养24h后计数变蓝点数，计算扩散距离（mm），按酶活计算公式计算待测溶液的酶活。

酶活（U/mL）单位定义：在35℃下每分钟分解1nmol C7-HSL的酶量被定义为一个酶活单位。

以回归方程(图2)为基础建立如下酶活计算公式：

酶活（U）=5×(1.3476^Xck-1.3476^Xs)×50/35/10⁴；其中，Xs为待测溶液进行上述1）—4）处理后的扩散距离；Xck为用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）代替待测溶液进行上述1）—4）处理后的扩散距离。

结果：待测溶液甲的酶活为8.5U/mL。待测溶液乙的酶活为0U。

实施例3、QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的性质鉴定

一、最适pH

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白浓度为1.0mg/mL的溶液（作为待测溶液），按照实施例2步骤四中3的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测，差异在于将反应体系中的0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）分别采用如下不同pH值的缓冲液：

pH 4.0、5.0、6.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液（柠檬酸）；

pH 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0的0.1mol/L PBS缓冲液（PBS）；

pH 8.0、8.5、9.0的Tris-HCl缓冲液（Tris-HCl）；

pH 9.0、10.0、11.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液（Gly-NaOH）。

将反应体系中采用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）时待测溶液的酶活记为100%（酶活值为8.5U/mL），计算采用其它各种不同pH值不同缓冲液的相对酶活（%）。

结果：采用McIlvaine缓冲液，pH4.0时的相对酶活为0%，pH5.0时的相对酶活为0%，pH6.0时的相对酶活为0%。采用PBS缓冲液，pH5.0时的相对酶活为0%，pH6.0时的相对酶活为0%，pH6.5时的相对酶活为0%，pH7.0时的相对酶活为83.63%，pH7.5时的相对酶活为99.69%，pH8.0时的相对酶活为100%。采用Tris-HCl缓冲液，pH8.0时的相对酶活为99.91%，pH9.0时的相对酶活为54.89%。采用甘氨酸-NaOH缓冲液，pH9.0时的相对酶活为54.80%，pH10.0时的相对酶活为0%，pH11.0时的相对酶活为0%。部分结果如图3所示。

结果表明，QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的最适pH为8.0，采用PBS缓冲液在pH7.0-8.0保持80％以上的相对酶活性，pH低于6.5或高于10.0几乎丧失所有酶活。

二、pH稳定性

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用下述不同pH的缓冲液配制成总蛋白浓度1.0mg/mL的溶液，30℃下处理1h后作为待测溶液，按照实施例2步骤四中3的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测。

不同pH的缓冲液分别为：pH 3.0、4.0、5.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液（柠檬酸）；pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.1mol/L PBS缓冲液（PBS）；pH 9.0的Tris-HCl缓冲液（Tris-HCl）；pH 10.0、11.0、12.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液（Gly-NaOH）。

将pH为8.0处理1h后待测溶液的酶活记为100%，此时的酶活值为8.5U/mL，计算采用其它各种不同pH的缓冲液的相对酶活（%）。

结果：如图4所示。pH 3.0时的相对酶活为0%、pH4.0时的相对酶活为93.99%、pH5.0时的相对酶活为97.89%、pH6.0时的相对酶活为98.91%、pH6.5时的相对酶活为98.63%、pH7.0时的相对酶活为99.61%、pH7.5时的相对酶活为99.71%、pH8.0时的相对酶活为100%、pH9.0时的相对酶活为100.00%、pH10时的相对酶活为100.00%、pH11时的相对酶活为100.00%、pH12时的相对酶活为100%。

结果表明：QsdA-RH5蛋白在pH范围为4.0-12.0间都很稳定，保持90%以上的酶活。

三、QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的最适温度

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白浓度1.0mg/mL的溶液（作为待测溶液），按照实施例2步骤四中3的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测，差异仅在于反应条件中使用不同的温度（0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃或65℃）。

将温度为35℃时待测溶液的酶活记为100%，此时的酶活值为8.5U/mL，计算采用其它不同温度的相对酶活（%）。

结果：如图5所示。0℃时的相对酶活为6.58%、10℃时的相对酶活为79.65%、20℃时的相对酶活为92.15%、25℃时的相对酶活为92.15%、30℃时的相对酶活为97.47%、35℃时的相对酶活为100.00%、40℃时的相对酶活为60.00%、50℃时的相对酶活为21.00%、60℃时的相对酶活为2.20%，65℃时的相对酶活不足1%。

结果表明：QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的最适作用温度为35℃，在20—35℃保持90%以上的酶活。

四、QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的热稳定性

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白浓度1.0mg/mL的溶液，在70℃保温不同时间（0、5、10、15、20、30、60min）后作为待测溶液，按照实施例2步骤四中3的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测。

将未经保温处理（即70℃保温0min）的待测溶液的酶活记为100%，此时的酶活值为8.5U/mL，计算采用其它70℃保温不同时间的相对酶活（%）。

结果：如图6所示。70℃保温5min的相对酶活为100.00%、70℃保温10min的相对酶活为100.00%，70℃保温15min的相对酶活为77.86%、70℃保温20min的相对酶活为63.47%、70℃保温30min的相对酶活为42.05%、70℃保温60min的相对酶活为27.69%。

结果表明：QsdA-RH5蛋白的热稳定性较好，70℃保温10min的相对酶活仍为100%。

五、不同金属离子及相关化学试剂对酶活的影响

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白浓度1.0mg/mL的溶液，按照实施例2步骤四中3的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测，差异在于在反应体系定容前分别加入不同的化学试剂，使其在反应体系中的终浓度为1mM或10mM（如表2所示）。

以不加入化学试剂的反应体系中待测溶液的酶活记为100%（CK），此时的酶活值为8.5U/mL，计算加入各种化学试剂后待测溶液的相对酶活（%），结果如表2所示。

表2.不同金属离子及相关化学试剂对QsdA-RH5的影响

六、QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的对蛋白酶的抗性

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液分别溶于如下溶液A、B或C中（QsdA-RH5蛋白终浓度均为0.08mg/mL），30℃保温30min或60min后，作为待测溶液，按照实施例2步骤四中3的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测。

溶液A：将胰蛋白酶溶于0.1mol/L Tris-HCl（pH 7.0），浓度为1mg/mL；

溶液B：将α-糜蛋白酶溶于0.1mol/L Tris-HCl（pH 7.0），浓度为1mg/mL；

溶液C：将蛋白酶K溶于0.1mol/L Tris-HCl（pH 7.5），浓度为1mg/mL。

将实施例2制备的QsdA-RH5蛋白溶于0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0），QsdA-RH5蛋白终浓度为0.08mg/mL，30℃保温30min或60min后，作为待测溶液的对照，此时的酶活值均为8.5U/mL，将该酶活记为100%，计算各处理的相对酶活（%）。

结果：如图7所示。除蛋白酶K外QsdA-RH5蛋白对于胰蛋白酶、糜蛋白酶都有较好的抗性。

七、QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的底物特异性

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白含量为1.0mg/mL的溶液作为待测溶液，按照实施例2步骤四中3的方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶活性检测，差异在于反应体系中的底物分别采用如下底物：C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C 10-HSL、3-hydroxy-C 12-HSL、3-hydroxy-C 12-HSL、3-hydroxy-C 14-HSL。

结果：C6-HSL作为底物的酶活为1.19U/mL，C7-HSL作为底物的酶活为8.5U/mL，C8-HSL作为底物的酶活为4.05U/mL，C10-HSL作为底物的酶活为38.51U/mL，C12-HSL作为底物的酶活为16.54U/mL；QsdA-RH5蛋白对底物3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-hydroxy-C12-HSL和3-hydroxy-C14-HSL没有降解作用。另外，QsdA-RH5蛋白对底物C4-HSL也有降解作用，其定性结果如图8所示，该结果是通过如下步骤1）-2）的琼脂平板扩散法得到的：

1）将C4-HSL（N-酰基高丝氨酸内酯酶的一种底物，是一种革兰氏阴性细菌群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯，可使指示紫色杆菌CV026落显示为紫色）溶于无水乙醇中，使其终浓度为100mg/mL，获得C4-HSL溶液；将含有卡那霉素的LB固体培养基平板用手术刀切割成4mm×60mm大小的胶条。

2）待测溶液的酶活测定

将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）稀释成总蛋白浓度为1.0mg/mL的溶液，作为待测溶液甲(图8中的QsdA-RH5)；将实施例2步骤三中5得到的对照液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）稀释（稀释倍数同QsdA-RH5蛋白液），作为待测溶液乙(图8中的CK)；将待测溶液甲和待测溶液乙分别按照如下方法进行N-酰基高丝氨酸内酯酶的活性检测：

a反应体系：将20μL待测溶液、179μL的0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）和1μL100mg/mL的C4-HSL（底物）溶液混合，摇匀；

b反应条件：35℃温育2h；

c终止：向反应体系中加入50μL 100g/L SDS水溶液终止反应；

d检测：用牙签将检测菌（紫色杆菌CV026）间隔4mm点接于步骤1）制得的胶条上，取10μL反应终止的反应液滴至该胶条的左端，30℃培养24h后计数变紫点数，计算扩散距离（mm）。

图8的结果表明，CK的扩散距离大于QsdA-RH5的扩散距离，说明QsdA-RH5蛋白对C4-HSL有降解作用。

上述结果表明：QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶对无取代集团的N-酰基高丝氨酸内酯具有底物特异性。

实施例4、QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的动力学常数测定

1、将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白含量为1.0mg/mL的溶液作为待测溶液，按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异如下：（1）反应体系中底物C7-HSL的终浓度为40μmol/L，（2）依次在反应1、2、3、5、10、15、20、30min时终止酶活反应。

通过计算酶活性与反应时间的比值大小，如该酶在某个时间段内比值不变时，则在该时间段内的酶促反应为一级反应，来确定此时间内为测K_m和K_max的反应最佳时间。

根据确定的一级反应时间，测定蛋白QsdA-RH5的K_m值及K_max的反应时间为15min。

2、将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白含量为1.0mg/mL的溶液作为待测溶液，按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定，差异如下：（1）反应体系中底物C7-HSL的终浓度依次采用400、200、20、10、4、2、0.4、0.2、0．04、0.02μmol/L；（2）采用步骤1确定的反应时间（即15min）。

通过上述不同的底物浓度[S]测定相对应的反应速度V，求出两者的倒数，以1/V对1/[S]作图，即采用米氏方程双倒数方法（方程如下）求得K_m值及V_max：

\frac{1}{v} = \frac{K_{m}}{V_{\max}} \times \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}}

结果：QsdA-RH5蛋白降解底物C7-HSL的Vmax＝250.00nmol/(mg·min)，Km＝0.0125mmol/L。

实施例5、QsdA-RH5蛋白作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的比活力测定

比活力单位的定义为：每毫克酶蛋白所含的酶活力单位。

方法：将实施例2步骤三中5得到的QsdA-RH5蛋白液用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）配制成总蛋白含量为1.0mg/mL的溶液作为待测溶液，按实施例2的步骤三中5的方法进行酶活测定；通过考马斯亮蓝法（G-250）试剂测定QsdA-RH5蛋白液中的蛋白浓度。酶活与蛋白浓度的比值即为QsdA-RH5蛋白的比活力。

结果：以C7-HSL为底物计算得到QsdA-RH5蛋白的比活力是292.83U/mg。

Claims

1.一种蛋白质，是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述基因，其特征在于：所述基因为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于：

所述重组表达载体是将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的；

所述重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)QsdA-RH5，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.6569。

6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白在降解N-酰基高丝氨酸内酯或制备N-酰基高丝氨酸内酯酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述N-酰基高丝氨酸内酯为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL和C12-HSL中的至少一种。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述降解的pH值为7.0—9.0，或7.0—8.0，或7.5—8.0；具体可为8.0、7.5、7.0或9.0。

10.根据权利要求7—9中任一所述的应用，其特征在于：所述降解的温度为0—65℃，或10—50℃，或10—40℃，或10—35℃，或20-35℃，或25-35℃，或30-35℃；具体可为0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃或65℃。