CN116144533B

CN116144533B - 降解ota和抑制ota产生真菌生长的席勒氏短芽孢杆菌、ota降解酶及其应用

Info

Publication number: CN116144533B
Application number: CN202211505390.9A
Authority: CN
Inventors: 孙长坡; 常晓娇; 刘虎军; 赵程程; 孙晶; 王峻; 刘楚岑
Original assignee: Academy of National Food and Strategic Reserves Administration
Current assignee: Academy of National Food and Strategic Reserves Administration
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2042-11-29
Also published as: CN116144533A

Abstract

本发明公开降解OTA和抑制OTA产生真菌生长的席勒氏短芽孢杆菌、OTA降解酶及其应用。本发明首先公开了席勒氏短芽孢杆菌及其在降解OTA和抑制OTA产生真菌生长中的应用。本发明进一步公开了OTA降解酶及其在降解OTA和抑制OTA产生真菌生长中的应用。本发明席勒氏短芽孢杆菌ASAG56及从席勒氏短芽孢杆菌ASAG56中挖掘到的2个OTA降解酶具有较好OTA降解效果且具有抑制OTA产生菌生长的特性，具有OTA的生物防治功能，在OTA降解和防控领域具有较好的应用前景。

Description

降解OTA和抑制OTA产生真菌生长的席勒氏短芽孢杆菌、OTA降解酶及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域。更具体地，涉及降解OTA和抑制OTA产生真菌生长的席勒氏短芽孢杆菌、OTA降解酶及其应用。

背景技术

赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。它主要是由包括黑曲霉、赭曲霉、炭黑曲霉在内的曲霉属和青霉属产生的一组重要的、污染农产品与食品的真菌毒素，其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)分布最广、毒性最大、产毒量最高、对农产品造成的污染最重，同时与人类健康关系也最为密切，OTA对动物和人类的毒性主要有肾脏毒、肝毒、致癌、致畸、免疫抑制和致突变作用。OTA可以污染小麦、燕麦等粮食及其加工食品、葡萄及其加工制品、咖啡、牛奶、香料，甚至煮沸的水中也可检测到OTA。OTA可污染农产品，威胁禽畜的健康，还可以通过食物链进行富集，从而进一步污染食品，给人体造成危害的同时也造成严重的经济损失。因此，对OTA的防控就显得尤为重要

在OTA的防控中有物理、化学、生物三种方法。物理法会产生二次污染、降毒效率较低、对食物的营养造成损失；化学法会带入化学试剂且容易残留，不利于食品安全，且成本较高；生物法具有高效、专一、持久的特点，最为绿色安全。经多年研究，生物降解产物OTα细胞实验与动物实验验证，确认为低毒、甚至无毒产物。因此，生物法是目前研究较热的OTA防控方法，加强对OTA生物防控的研究，对中国农业的发展及经济效益的保障具有重要意义。

其中，

目前已经发现多种微生物具有降解OTA的效果，并且也有一些微生物具有抑制OTA产生真菌生长的特性。研究表明，一些细菌、酵母等真菌具有降解OTA的能力，不动杆菌(Acinetobacter)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)皆有降解OTA的效果。中国农业大学彭梦雪等(Peng M,Zhao Z,Liang Z.Biodegradation of ochratoxin A andochratoxin B by Brevundimonas naejangsanensis isolated from soil[J].FoodControl,2022,133:108611.)从土壤筛出一株短波单胞菌属(Brevundimonasnaejangsanensis)具有同时降解OTA和OTB的效果，且24小时内可以100％降解OTA；隐球酵母(Cryptococcus)、黑曲霉(Aspergillus niger)也可以降解OTA。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)与巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)被发现不仅可以降解OTA还可以抑制OTA产生菌赭曲霉与炭黑曲霉的生长，但是后者的OTA降解主要是由细胞吸附造成的、非生物降解。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)也被报导其具有抑制炭黑曲霉生长的效果。

目前现有的研究中，未见短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)微生物降解OTA，并且具有抑制黑曲霉、赭曲霉、炭黑曲霉以及青霉等OTA产生真菌生长的特性的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一株席勒氏短芽孢杆菌及其在降解赭曲霉毒素A(OTA)和/或抑制OTA产生真菌生长中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种OTA降解酶及其在降解OTA和/或抑制OTA产生真菌生长中的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明首先提供了一株席勒氏短芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCCNo.25674，分类命名为Brevibacillus schisleri，于2022年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

进一步，本发明还提供了一种微生物制剂，其有效成分包含上述席勒氏短芽孢杆菌或其发酵液或其细胞重悬液或其培养物或其代谢产物。

进一步，所述席勒氏短芽孢杆菌发酵液是将上述席勒氏短芽孢杆菌接种于LB液体培养基中培养获得。

进一步，所述席勒氏短芽孢杆菌细胞重悬液是将上述席勒氏短芽孢杆菌接种于LB液体培养基中培养，离心后重悬细胞获得。

本发明席勒氏短芽孢杆菌菌株ASAG56从小麦样品中筛选、分离纯化而得，经形态学特征和16S rDNA基因序列分析鉴定为席勒氏短芽孢杆菌(Brevibacillus schisleri)，该菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长约1500bp。菌落形态为圆形，不透明；细胞呈杆状，有芽孢；革兰氏阳性。

本发明进一步提供了OTA降解酶，所述OTA降解酶为A2-01或A2-05，所述A2-01的氨基酸序列为A1)或A2)或A3)或A4)所示：

A1)氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的蛋白质；

A2)在SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的N端或C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

A3)在SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的侧链基团上和/或N端和/或C端进行常规修饰得到的产物；

A4)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质；

所述A2-05的氨基酸序列为B1)或B2)或B3)或B4)所示：

B1)氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的蛋白质；

B2)在SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的N端或C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

B3)在SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的侧链基团上和/或N端和/或C端进行常规修饰得到的产物；

B4)将SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

进一步，所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等；所述常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、泛素化或生物素化等；所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

进一步，编码上述OTA降解酶的基因也在本发明的保护范围之内，所述A2-01的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述A2-05的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，扩增上述OTA降解酶基因的引物对也在本发明的保护范围之内，所述A2-01的基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示或SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示，所述A2-05的基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示或SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示。

进一步，含有上述OTA降解酶的基因的表达盒、重组载体或重组微生物也在本发明的保护范围之内。

进一步，所述表达盒指能够在宿主细胞中表达OTA降解酶的基因的DNA，该DNA不但可包括启动OTA降解酶的基因转录的启动子，还可包括终止OTA降解酶的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

进一步，所述重组载体为含有所述OTA降解酶的基因表达盒的载体，所述载体可以为pET-28a(+)或pPIC9K。

在本发明具体的实施方式中，所述重组载体可以为重组质粒pET-28a(+)/A2-01或pET-28a(+)/A2-05，其中，所述重组质粒pET-28a(+)/A2-01是将pET-28a(+)质粒的BamH I和Xho I识别序列间的DNA片段替换为SEQ IDNO.2所示的A2-01的基因且保持其他序列不变得到的重组质粒，所述重组质粒pET-28a(+)/A2-05是将pET-28a(+)质粒的BamH I和Xho I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID NO.3所示的A2-05的基因且保持其他序列不变得到的重组质粒；

所述重组载体还可以为重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-01或pPIC9K-A2-05，其中，所述重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-01是将pPIC9K质粒的SnaB I和Not I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID NO.2所示的A2-01的基因且保持其他序列不变得到的重组质粒，所述重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-05是将pPIC9K质粒的SnaB I和Not I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID NO.3所示的A2-05的基因且保持其他序列不变得到的重组质粒。

进一步，所述重组微生物的宿主可以为真菌和细菌，其中，所述真菌可以为酵母，具体的可以为毕赤酵母菌株GS115，所述细菌可以为大肠杆菌，具体的可以为大肠杆菌Rosetta(DE3)。

在本发明具体的实施例中，所述重组微生物为重组菌株Rosetta[pET-28a(+)/A2-01]或Rosetta[pET-28a(+)/A2-05]，其中，所述重组菌株Rosetta[pET-28a(+)/A2-01]是将重组质粒pET-28a(+)/A2-01转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞构建获得的重组菌株，所述重组菌株Rosetta[pET-28a(+)/A2-05]是将重组质粒pET-28a(+)/A2-05转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞构建获得的重组菌株；

所述重组微生物还可以为重组毕赤酵母菌株GS115[pPIC9K-A2-01]或GS115[pPIC9K-A2-05]，其中，所述重组毕赤酵母菌株GS115[pPIC9K-A2-01]是将重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-01转入毕赤酵母GS115构建获得的重组菌株，所述重组毕赤酵母菌株GS115[pPIC9K-A2-05]是将重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-05转入毕赤酵母GS115构建获得的重组菌株。

本发明进一步还提供了上述席勒氏短芽孢杆菌或上述微生物制剂或上述OTA降解酶或上述OTA降解酶的基因或上述OTA降解酶的基因的表达盒、重组载体或重组微生物在如下任一中的应用：

C1)在降解样品中OTA中的应用；

C2)在制备降解样品中OTA产品中的应用；

C3)在抑制样品中OTA产生真菌生长中的应用；

C4)在制备抑制样品中OTA产生真菌生长产品中的应用。

本发明还提供了降解OTA的方法，包括如下步骤：

将上述席勒氏短芽孢杆菌或上述微生物制剂加入到含有OTA的样品中，培养，实现所述样品中OTA的降解；

将上述OTA降解酶加入到含有OTA的样品中，反应，实现所述样品中OTA的降解。

进一步，所述培养的条件为18-40℃，50-300r/min条件下孵育12-60小时。

进一步，所述反应的条件为20-45℃反应0.5-36小时。

本发明还提供了抑制OTA产生真菌生长的方法，包括如下步骤：

将上述席勒氏短芽孢杆菌或上述微生物制剂加入到含有OTA产生真菌的样品中，培养，实现OTA产生真菌生长的抑制和OTA产生真菌产生的OTA的降解。

本发明中，所述OTA产生真菌包括但不限于黑曲霉、炭黑曲霉、青霉和赭曲霉。

本发明中，所述样品可以为粮食及其加工副产物、饲料、食品等。

本发明席勒氏短芽孢杆菌对OTA具有较好的降解效果，30℃，220r/min孵育48h后细胞重悬液对OTA的降解率达到97％以上；且可以有效的抑制黑曲霉、炭黑曲霉、青霉和赭曲霉等OTA产生真菌的生长，产生抑菌圈。本发明OTA降解酶对OTA具有较好的降解效果，37℃反应1h后对OTA的降解率达到了100％。

本发明的有益效果如下：

本发明席勒氏短芽孢杆菌ASAG56及从席勒氏短芽孢杆菌ASAG56中挖掘到的2个OTA降解酶具有较好OTA降解效果且具有抑制OTA产生菌生长的特性，具有OTA的生物防治功能，在OTA降解和防控领域具有较好的应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为OTA降解前后的液相色谱图。

图2为菌株ASAG56形态特征图；其中，A为菌株ASAG56在LB培养基上的形态特征，B为显微镜下菌株ASAG56的形态特征。

图3为菌株ASAG56的细胞重悬液对OTA的降解效果图。

图4为菌株ASAG56的发酵液对OTA产生真菌生长的抑制作用结果图。

图5为大肠杆菌重组质粒pET-28a(+)/A2-01和pET-28a(+)/A2-05双酶切验证电泳图谱；其中，泳道1为10000bp大小的Marker；泳道2为pET-28a(+)/A2-01经双酶切处理样品；泳道3为基因A2-01；泳道4为pET-28a(+)/A2-05经双酶切处理样品；泳道5为基因A2-05。

图6为SDS-PAGE验证OTA降解酶A2-01和A2-05的表达情况；其中，(a)中泳道1为蛋白Marker、泳道2为A2-01粗酶液、泳道3为A2-01纯酶液；(b)中泳道1为蛋白Marker、泳道2为A2-05粗酶液、泳道3为A2-05纯酶液。

图7为重组酵母表达质粒的图谱；其中，(a)为pPIC9k-A2-01，(b)为pPIC9k-A2-05。

图8为OTA降解酶A2-01和A2-05对OTA的降解效果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下述实施例中用到的培养基和缓冲液的配方如下：

基础盐培养基(MSM培养基)：(NH₄)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 6.15g，KH₂PO₄ 1.52g，CaCl₂ 0.05g，加水定容至1L，调节pH至7.0，121℃灭菌20min后备用。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯浸出粉10g，葡萄糖20g，加水定容至1L，分装时每瓶加入1.5-2％琼脂后，115℃灭菌20min后备用。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD液体培养基)：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水定容至1L，115℃灭菌20min后备用。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水定容至1L，121℃灭菌20min后备用。

LB固体培养基：LB液体培养基分装后每瓶加入1.5-2％琼脂后，121℃灭菌20min后备用。

BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，甘油1％，K₂HPO₄ 3.01g/L，KH₂PO₄11.8g/L，121摄氏度灭菌20min，然后加入过滤除菌后的YNB和生物素，使终浓度分别为13.4g/L和4×10^-4g/L，混匀后使用。

BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，K₂HPO₄ 3.01g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，121摄氏度灭菌20min，然后加入过滤除菌后的YNB和生物素，使终浓度分别为13.4g/L和4×10^-4g/L，混匀后使用。

MD固体培养基：配制20g/L葡萄糖溶液，分装小瓶后，加入1.5～2％的琼脂粉，115℃灭菌20min后，加入过滤除菌的YNB和生物素，使终浓度分别为13.4g/L和4×10^-4g/L，混合均匀后使用。

YPD固体培养基：YPD液体培养基分装后加入1.5～2％的琼脂粉，115℃灭菌20min。

缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)配方(1L)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g，KH₂PO₄ 0.24g，pH＝7.4。

磷酸缓冲液(phosphate buffer，PB)：0.05mol/L Na₂HPO₄同0.05mol/LNaH₂PO₄混匀，调节至目标pH值。

实施例1菌株ASAG56的分离筛选和鉴定

一、菌株ASAG56的分离筛选

将20mL无菌生理盐水加入20g的小麦样品中，得到微生物富集样品。将微生物富集样品振荡洗脱后，移取其中50μL洗液，加入含有2.5μg OTA的MSM培养基，使最终体系为500μL，30℃、200r/min摇床培养7天，然后从培养体系中取100μL于新的含有2.5μg OTA的MSM培养基，使最终体系为500μL，得到富集样品。将富集样品在30℃、200r/min摇床培养7天得培养液，用高效液相色谱(HPLC)法检测样品中OTA含量变化，对能够降解OTA的样品吸取100μL培养液加入无菌生理盐水依次稀释10^-2、10^-3、10^-4后，取100μL涂布于含LB固体培养基的平板上，置于30℃培养箱中培养。挑取涂布平板上的单菌落到含有5μg/mL OTA的500μL MSM培养基中，在30℃，220r/min条件下共孵育7d得反应液，将反应液与等体积甲醇充分振荡混合，10000rpm离心10min，用0.22μm滤膜过滤，该处理为实验组。对照组为将含有5μg/mL OTA的500μL MSM培养基中，在30℃，220r/min条件下共孵育7d得反应液，将反应液与等体积甲醇充分振荡混合，10000rpm离心10min，用0.22μm滤膜过滤。使用HPLC法检测各组OTA残留量(含量)，测定菌株对OTA的降解效果。

其中，HPLC法检测OTA残留量(含量)的条件：采用C18色谱柱(250mm×4.6mm)，流动相为A：B＝1：1，A为冰乙酸-水(2+100)，B为乙腈，检测波长：激发波长333nm，发射波长460nm，进样量10μL，流速1mL/min，柱温30℃。

OTA降解率(％)＝(对照组OTA含量-实验组OTA含量)/对照组OTA含量×100％；

通过比较获得1株具有OTA高效降解效果的菌株，命名为ASAG56。结果如图1所示，在共孵育7d后菌株ASAG56对OTA降解率为99.20％，表明本发明分离得到的菌株ASAG56具备降解OTA的能力，下一步对该菌株进行鉴定分析。

二、菌株ASAG56的鉴定

按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)中描述的方法，对菌株ASAG56进行形态特征和生理生化特征鉴定，具体结果如下：

1、形态特征：如图2中A和B所示，菌株ASAG56在LB培养基上菌落形态呈圆形，表面凸起，不透明；革兰氏染色为阳性，显微镜下细胞呈杆状。

2、菌株ASAG56具有如下生物学性质：能利用甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、鼠李糖，不能利用山梨醇、阿拉伯糖。

3、16S rDNA基因鉴定：

提取菌株ASAG56的细菌基因组DNA，以其为模板，采用细菌的16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)经PCR扩增其16S rDNA基因；其中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次。PCR扩增体系为：27F 1μL，1492R 1μL，模板1μL，Taq酶25μL，ddH₂O22μL。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测并切胶回收纯化后测序分析，得到菌株ASAG56的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长约1500bp。经与Genbank中BLAST比对分析，确定该菌为短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)细菌。

以上鉴定结果表明菌株ASAG56为短芽孢杆菌属(Brevibacillus sp.)细菌，属于非芽胞杆菌科，短芽孢杆菌属。为进一步确认，将该菌株ASAG56于2021年9月被送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行鉴定，结果菌株ASAG56被鉴定为席勒氏短芽孢杆菌(Brevibacillus schisleri)。菌株ASAG56于2022年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，其保藏编号为CGMCC No.25674，分类命名为Brevibacillus schisleri。

实施例2菌株ASAG56对OTA的降解效果

挑取菌株ASAG56单菌落于5mL LB液体培养基于30℃摇床过夜培养获得菌株ASAG56的发酵液，发酵液经8000r/min离心20min去除上清，用无菌生理盐水洗涤2次后使用生理盐水重悬细胞获得菌株ASAG56的细胞重悬液。

将菌株ASAG56的细胞重悬液(终浓度为1×10⁷CFU/mL)以5％的接种量接种于5mL含OTA的MSM培养基中(OTA终浓度为5μg/mL)，30℃，220r/min条件下孵育0、6、12、18、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96小时得反应液，将反应液与等体积甲醇充分振荡混合，10000rpm离心10min，用0.22μm滤膜过滤，该处理为实验组。对照组为将5mL含OTA的MSM培养基中(OTA终浓度为5μg/mL)，30℃，220r/min条件下孵育0、6、12、18、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96小时得反应液，将反应液与等体积甲醇充分振荡混合，10000rpm离心10min，用0.22μm滤膜过滤。使用HPLC法检测各组OTA残留量(含量)，方法同实施例1。

结果如图3所示，孵育24h后菌株ASAG56的细胞重悬液对OTA降解率大于85％，孵育48h后菌株ASAG56的细胞重悬液对OTA的降解率大于97％，表明菌株ASAG56可高效降解OTA。

实施例3菌株ASAG56对OTA产毒真菌生长的抑制作用

挑取菌株ASAG56单菌落于5mL LB液体培养基，30℃过夜震荡培养，5％转接至60mL新鲜LB液体培养基中培养48小时获得菌株ASAG56的发酵液。选取OTA产生真菌：2株黑曲霉(分别编号黑曲霉①、黑曲霉②)、炭黑曲霉、青霉和2株赭曲霉(分别编号赭曲霉①、赭曲霉②)，分别活化于PDA培养基，30℃培养72-96h，使用10mL无菌生理盐水刮洗收集孢子，并稀释至1×10⁶CFU/mL，制成孢子悬浮液。

采用牛津杯法测定ASAG56的抑菌效果，分别取100μL上述真菌的孢子悬浮液涂布于PDA培养基，取150μL菌株ASAG56的发酵液于培养基中心牛津杯中，30℃条件下培养，记录真菌的生长情况。结果如图4所示，发酵液可以有效的抑制黑曲霉、炭黑曲霉、青霉和赭曲霉等OTA产生真菌的生长，产生抑菌圈。

实施例4菌株ASAG56中OTA降解酶基因的克隆、构建、表达和功能验证

一、OTA降解酶基因的克隆

经过基因发掘，筛选获得了2个新型OTA降解酶，分别命名为A2-01和A2-05，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，2个基因的上游引物与下游引物分别为：

A2-01-F：5’-CGGGATCCATGACAGCAACGGCAGTGGTAACG-3’(SEQ ID NO.6)；

A2-01-R：5’-CCGCTCGAGTTCCATCACGATTTTTCTTGCCGCGTTG-3’(SEQ ID NO.7)；

A2-05-F：5’-CGGGATCCATGGAAGAAAAACTGTTTGCCCGGCTG-3’(SEQ ID NO.8)；

A2-05-R：5’-CCGCTCGAGTTGATGACGTGCCTGATAGGCAAG-3’(SEQ ID NO.9)；

上下游引物中分别添加限制性内切酶BamH I、Xho I酶切位点(限制性内切酶用下划线标注，保护碱基为斜体序列)。

提取菌株ASAG56的细菌基因组DNA，以其为模板，分别利用A2-01-F和A2-01-R、A2-05-F和A2-05-R为引物，进行扩增得到含OTA降解酶基因A2-01和A2-05的PCR产物。

二、构建和表达

将含OTA降解酶基因A2-01和A2-05的PCR产物及大肠杆菌表达载体pET-28a(+)分别用BamH I和Xho I进行双酶切。含OTA降解酶基因A2-01或A2-05的PCR产物的酶切体系150μL，具体如下：含OTA降解酶基因A2-01的PCR产物6.7μL、10×Buffer 15μL、BamH I 5μL、XhoI 5μL、ddH₂O 123.3μL；或，含OTA降解酶基因A2-05的PCR产物6μL、10×Buffer 15μL、BamHI 5μL、Xho I 5μL、ddH₂O 124μL。大肠杆菌表达载体pET-28a(+)酶切体系160μL，具体如下：pET-28a(+)94.8μL、10×H buffer 16μL、BamH I 8μL、Xho I 8μL、ddH₂O 33.2μL。均在37℃条件下BamH I和Xho I双酶切3h。琼脂糖凝胶电泳回收，分别得到A2-01基因双酶切产物、A2-05基因双酶切产物和表达载体pET-28a(+)双酶切产物，产物进行连接，连接体系如下：表达载体pET-28a(+)双酶切产物1.2μL、A2-01基因双酶切产物6.3μL，Solution I 7.5μL；或，表达载体pET-28a(+)双酶切产物1.0μL、A2-05基因双酶切产物6.5μL，Solution I 7.5μL。16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养后挑取转化子提取质粒进行双酶切验证和测序验证，利用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切验证的结果如图5所示，从图中可以看出，质粒pET-28a(+)/A2-01经过双酶切后，出现同OTA降解酶基因A2-01同样大小的片段，证明质粒pET-28a(+)/A2-01构建成功。质粒pET-28a(+)/A2-05经过双酶切后，出现同OTA降解酶基因A2-05同样大小的片段，证明质粒pET-28a(+)/A2-05构建成功。酶切验证和测序验证正确的转化子分别提取质粒，得到降解酶基因A2-01和A2-05的重组质粒pET-28a(+)/A2-01和pET-28a(+)/A2-05。将重组质粒pET-28a(+)/A2-01和pET-28a(+)/A2-05分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞构建2个降解酶基因A2-01和A2-05的重组菌株Rosetta[pET-28a(+)/A2-01]和Rosetta[pET-28a(+)/A2-05]。

Rosetta[pET-28a(+)/A2-01]和Rosetta[pET-28a(+)/A2-05]两个重组菌株分别在5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃条件下摇床过夜培养。取1％上述培养液转接至新的60mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养，培养至OD600达到0.6时，加入终浓度0.8mM的IPTG，18℃诱导18小时。在4℃条件下7000r/min离心10min收集菌体，使用6mL的PBS对菌体进行重悬，在冰浴条件下进行超声破碎后，4℃条件下12000r/min离心20min，收集上清液，分别获得2个OTA降解酶A2-01和A2-05粗酶液，将20mL粗酶液使用Ni柱进行纯化，并使用PBS作为平衡液，收集样品穿透液后依次使用从低到高浓度咪唑溶液进行洗脱，并且收集每个浓度的咪唑洗脱样品。使用上述收集样品及已知浓度的牛血清蛋白样品进行SDA-PAGE电泳，经过SDA-PAGE电泳结果显示菌体破碎上清中含有目的蛋白，A2-01和A2-05粗酶液纯化后样品在500mM咪唑浓度条件下被洗脱下来，即得到A2-01和A2-05纯酶液，测定其浓度。2个OTA降解酶A2-01、A2-05的理论分子分别为43.5kDa、43.0kDa，SDS-PAGE分析结果如图6中(a)和(b)所示，(a)中，同泳道1中的Marker进行比较，明显可以看出泳道3中目标蛋白约为43kDa，即与OTA降解酶A2-01大小相似；(b)中，同泳道1中的Marker进行比较，明显可以看出泳道3中目标蛋白小于50kDa，明显大于37kDa，约为43kDa，即与OTA降解酶A2-05大小相似。

三、功能验证

将添加PBS缓冲液、含有pET-28a(+)空质粒的Rosetta(DE3)破碎液、A2-01和A2-05粗酶液分别加入500μL(OTA终浓度5μg/mL)反应体系中，37℃反应1h后加入500μL甲醇终止反应，离心取上清，HPLC法检测OTA残留量(含量)，方法同实施例1。以添加PBS检测得到的OTA含量作为对照组OTA含量，添加pET-28a(+)空质粒的Rosetta(DE3)破碎液、A2-01和A2-05粗酶液检测得到的OTA含量分别作为实验组OTA含量计算OTA降解率(％)。

结果表明，以添加PBS缓冲液的对照组相比，含有pET-28a(+)空质粒的Rosetta(DE3)破碎液对OTA无降解活性；2个粗酶液对OTA的降解率可达100％。

实施例5 2个OTA降解酶在毕赤酵母中的构建、表达

一、OTA降解酶基因的克隆

提取菌株ASAG56的细菌基因组DNA，以其为模板，利用上游引物A2-01-F和下游引物A2-01-R、上游引物A2-05-F和下游引物A2-05-R进行PCR扩增得到含OTA降解酶基因A2-01或A2-05的PCR产物。

其中，

A2-01-F：5’-CGCTACGTAATGACAGCAACGGCAGTGGT-3’(SEQ ID NO.10)

A2-01-R：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTCCATCACGATTTTTCTTG-3’(SEQ ID NO.11)

A2-05-F：5’-CGCTACGTAATGGAAGAAAAACTGTTTGCCCGGCTG-3’(SEQ ID NO.12)

A2-05-R：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTGATGACGTGCCTGATAGGCAAG-3’(SEQ ID NO.13)

上下游引物中分别添加限制性内切酶SnaB I和Not I酶切位点(限制性内切酶用下划线标注，保护碱基为斜体序列)。

二、构建和表达

将含OTA降解酶基因A2-01或A2-05的PCR产物分别用限制性内切酶SnaB I和Not I进行双酶切，100μL酶切体系如下：含OTA降解酶基因A2-01或A2-05的PCR产物40μL、10×Hbuffer 10μL、SnaB I 5μL、Not I 5μL、ddH₂O 40μL。37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收，分别得到A2-01和A2-05基因双酶切产物。

表达载体pPIC9K用限制性内切酶SnaB I和Not I进行双酶切，100μL酶切体系如下：载体pPIC9K 20μL、10×H buffer 10μL、SnaB I 5μL、Not I 5μL、ddH₂O 65μL。37℃酶切4h后，琼脂糖凝胶电泳回收，得到表达载体pPIC9K双酶切产物。

将A2-01和A2-05基因双酶切产物分别与经表达载体pPIC9K双酶切产物连接，构建重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-01与pPIC9K-A2-05。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物4.5μL、A2-01基因双酶切产物或A2-05基因双酶切产物3μL、Solution I 7.5μL。16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB(含50μg/mL卡那霉素)液体培养基中，37℃过夜培养，提取质粒，分别得到重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-01、pPIC9K-A2-05(质粒图谱如图7所示)。

将重组酵母表达质粒pPIC9K-A2-01、pPIC9K-A2-05分别用BspE I与Sal I进行线性化，线性化产物纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD固体培养基。在MD固体培养基上生长出的菌落为毕赤酵母工程菌株，即得到重组毕赤酵母菌株GS115[pPIC9K-A2-01]和GS115[pPIC9K-A2-05]，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD固体培养基上筛选多拷贝的转化子。

实施例6重组酶对OTA的降解效果实验

挑取单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220r/min振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220r/min振荡培养，每24h补加0.5％的甲醇。连续诱导表达5d，同时收集样品，离心去除菌体得上清液，即得到重组酶A2-01和A2-05粗酶液，进行体外的OTA降解实验。降解体系包含1μg OTA，100μL重组酶A2-01粗酶液或10μL重组酶A2-05粗酶液，PBS(pH 7.4)补足至500μL(OTA终浓度为2μg/mL)，37℃反应60min内，每隔10min取一次样，甲醇终止反应，离心取上清，该处理设置为实验组。将重组酶A2-01粗酶液或重组酶A2-05粗酶液替换为含有pPIC9K空质粒的毕赤酵母GS115发酵上清液的处理设置为对照组。用HPLC法检测OTA含量变化，方法同实施例1。结果如图8所示，结果表明，与添加含有pPIC9K空质粒的毕赤酵母GS115发酵上清液的对照组(图中以“CK-pPIC9K”表示)相比，两个粗酶液(图中以“A2-01”和“A2-05”表示)对OTA的降解率均可达到100％。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一株席勒氏短芽孢杆菌(Brevibacillus schisleri)，其特征在于，所述席勒氏短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.25674。

2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂的有效成分包含权利要求1所述的席勒氏短芽孢杆菌或其发酵液或其细胞重悬液。

3.赭曲霉毒素A降解酶，其特征在于，所述赭曲霉毒素A降解酶为A2-01，所述A2-01的氨基酸序列为A1)或A2)或A3)所示：

A1)氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的蛋白质；

A3)在SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的侧链基团上和/或N端和/或C端进行常规修饰得到的产物；所述常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、泛素化或生物素化。

4.编码权利要求3所述的赭曲霉毒素A降解酶的基因，其特征在于，所述A2-01的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.扩增权利要求4所述的基因的引物对，其特征在于，所述A2-01的基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示或SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

6.含有权利要求4所述的基因的表达盒、重组载体或重组微生物。

7.权利要求1所述的席勒氏短芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物制剂或赭曲霉毒素A降解酶或编码所述赭曲霉毒素A降解酶的基因或含有所述赭曲霉毒素A降解酶的基因的表达盒、重组载体或重组微生物在如下任一中的应用：

C1)在降解样品中赭曲霉毒素A中的应用；

C2)在制备降解样品中赭曲霉毒素A产品中的应用；

C3)在抑制样品中赭曲霉毒素A产生真菌生长中的应用；

C4)在制备抑制样品中赭曲霉毒素A产生真菌生长产品中的应用；

其中，所述赭曲霉毒素A降解酶为A2-01或A2-05，所述A2-01的氨基酸序列为A1)或A2)或A3)所示：

A1)氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的蛋白质；

A3)在SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的侧链基团上和/或N端和/或C端进行常规修饰得到的产物；所述常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、泛素化或生物素化；

所述A2-05的氨基酸序列为B1)或B2)或B3)所示：

B1)氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的蛋白质；

B3)在SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的侧链基团上和/或N端和/或C端进行常规修饰得到的产物；所述常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、泛素化或生物素化；

编码所述赭曲霉毒素A降解酶A2-01的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述赭曲霉毒素A降解酶A2-05的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.降解赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1所述的席勒氏短芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物制剂加入到含有赭曲霉毒素A的样品中，培养，实现所述样品中赭曲霉毒素A的降解；或，

将赭曲霉毒素A降解酶加入到含有赭曲霉毒素A的样品中，反应，实现所述样品中赭曲霉毒素A的降解；其中，所述赭曲霉毒素A降解酶为A2-01或A2-05；

所述A2-01的氨基酸序列为A1)或A2)或A3)所示：

A1)氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的蛋白质；

所述A2-05的氨基酸序列为B1)或B2)或B3)所示：

B1)氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的蛋白质；

B3)在SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的侧链基团上和/或N端和/或C端进行常规修饰得到的产物；所述常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、泛素化或生物素化。

9.抑制赭曲霉毒素A产生真菌生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1所述的席勒氏短芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物制剂加入到含有赭曲霉毒素A产生真菌的样品中，培养，实现赭曲霉毒素A产生真菌生长的抑制和赭曲霉毒素A产生真菌产生的赭曲霉毒素A的降解。

10.根据权利要求7所述的应用，或权利要求9所述的方法，其特征在于，所述赭曲霉毒素A产生真菌为黑曲霉、炭黑曲霉、青霉和/或赭曲霉。

11.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述样品为粮食及其加工副产物、饲料或食品。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为18-40℃，50-300r/min条件下孵育12-60小时，所述反应的条件为20-45℃反应0.5-36小时。