JP4111489B2 - 新規バクテリオシン - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌性ペプチドである新規バクテリオシン、その製造方法、及びその用途等に関し、詳しくは新規バクテリオシンであるムンディティシンＫＳとその製造方法、該バクテリオシンをコードする遺伝子、該バクテリオシン関連遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質、及び、該バクテリオシン、その生産微生物及びその培養物を用いる保存性に優れた食品の製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品の腐敗や品質の低下などを防止する目的で、食品保存料が種々の食品に添加されている。かかる食品保存料としては、これまでは主に化学的に合成された合成保存料が用いられている。しかしながら、合成保存料の大量摂取は、人体にとって健康面から好ましくなく、その原因の１つは、化学合成保存料が人体内で容易に分解されないことにある。このような問題を解決するためには、人体内で容易に分解される抗菌性物質の開発が必要である。
【０００３】
ところで、乳酸菌は、古来より醤油、味噌、漬け物、日本酒などの様々な発酵食品や発酵飲料の生産に利用されている有用な微生物の１つである。乳酸菌を発酵食品などの製造過程で用いることにより乳酸発酵が行われて、生産された乳酸によって系のｐＨが低下したり、該乳酸菌が抗菌性物質を産生したりすることで、製造過程及び製品中での雑菌などの生育を阻害することが可能となり、製品の腐敗や品質の低下を防ぐことができる。
【０００４】
乳酸菌の生成するバクテリオシンについてもいくつかの報告がある。日本食品科学工学雑誌第４７巻第１０号（2000年10月）752-759頁には、ラクトコッカス・ラクチスから生成したナイシンを味噌の醸造に利用することについて、Biochimica et Biophysica Acta 1373 (1998) 47-58には、エンテロコッカス・ムンディティが生産するバクテリオシンについて、特開平７−５１０５５号公報には、リステリア・モノサイトジェネスに対して生育抑制作用を有するエンテロコッカス属に属する新規微生物について報告されている。また、特許第2618148号には、ペディオコッカス・アシディラクティシィ中のプラスミドから誘導されるバクテリオシンをコードする遺伝子配列について開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、古くから食品及び食品加工に利用されている乳酸菌が生産する、安全性の高い新規バクテリオシン、その製造法、その利用方法及び該バクテリオシンをコードする遺伝子等を提供することにある。詳細には、ナイシンやペディオシン等の、乳酸菌に由来し、人体内で容易に分解される抗菌物質であると共に、乳酸菌が産生するバクテリオシンとして広く利用され、多くの微生物の生育を阻害することが知られている公知のバクテリオシンに比較して、阻害する微生物の選択性が高く、より安全性が高い新規バクテリオシンや、該新規バクテリオシンをコードする遺伝子や、該遺伝子に関連する遺伝子及びそれがコードするタンパク質や、新規バクテリオシンを用いた保存性に優れた食品の製造法等を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究し、発酵食品やサイレージなどに存在する乳酸菌を分離して、バクテリオシン生産能を有する菌株の探索を行ったところ、バクテリオシン生産能を有する新規乳酸菌株の分離に成功し、更に該菌株によって生産されるバクテリオシンやその遺伝子が新規物質であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、配列番号２に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項１）に関する。
【０００８】
また本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン活性を有するムンディティシンＫＳ（請求項２）に関する。
【０００９】
さらに本発明は、エンテロコッカス属に属するムンディティシンＫＳ生産菌を培養し、培養物からムンディティシンＫＳを採取することを特徴とするムンディティシンＫＳの製造法（請求項３）や、ムンディティシンＫＳの生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ（請求項４）や、ムンディティシンＫＳの生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）（請求項５）や、ムンディティシンＫＳ、ムンディティシンＫＳ生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ又はその培養液を食品に添加することを特徴とする保存性に優れた食品の製造法（請求項６）や、エンテロコッカス・ムンディティが、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）であることを特徴とする請求項６に記載の保存性に優れた食品の製造法（請求項７）や、食品が非加熱食肉であることを特徴とする請求項６又は７に記載の保存性に優れた食品の製造法（請求項８）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡや、配列番号２に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号４に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡや、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン耐性機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号６に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡであれば特に制限されるものではなく、中でも、新規バクテリオシンであるムンディティシンＫＳや、バクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質や、バクテリオシン耐性機能を有するタンパク質をそれぞれコードする遺伝子ＤＮＡを好適に例示することができ、これらＤＮＡの由来は特に制限されない。ムンディティシンＫＳをコードする配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、組換えムンディティシンＫＳの大量生産や、食品製造に通常用いられているバクテリオシン耐性微生物にバクテリオシン産生能を付与するために用いることができ、その相補配列は遺伝子レベルでのバクテリオシン遺伝子の検出に用いることができる。また、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡや配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡは、遺伝子レベルでの、バクテリオシンの細胞外分泌機構の解明や、バクテリオシンの作用機序を解明する上で有用である。さらに、配列番号１に示される塩基配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列は、食品製造に通常用いられている微生物にバクテリオシン産生能を付与するために用いることができる。そして、バクテリオシン産生能が付与された形質転換微生物は、生ハム等のｐＨにシビアな食品に有利に用いることができる。
【００１１】
本発明の対象となるタンパク質としては、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン活性を有するムンディティシンＫＳや、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質や、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン耐性機能を有するタンパク質であれば特に制限されるものではなく、ここで、バクテリオシン細胞外排出活性とは、菌体内に生成したバクテリオシンを細胞外に排出する活性をいい、またバクテリオシン耐性機能とは、菌体内に生成したバクテリオシンから菌自らを守る機能をいう。配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるムンディティシンＫＳ、あるいは配列番号５又は配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列番号４又は配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡを、公知のホストベクター系を利用して発現させることにより得ることができる。上記ムンディティシンＫＳは、非加熱食肉等の食品に存在するリステリア・モノサイトジェネスを死滅あるいは減少させ、保存性に優れた食品を製造する上で有利に用いることができ、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質や配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン耐性機能を有するタンパク質は、バクテリオシンの細胞外分泌機構の解明や、バクテリオシンの作用機序を解明する上で有用である。
【００１２】
上記ムンディティシンＫＳは、エンテロコッカス属に属するムンディティシンＫＳ生産菌、好ましくはエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）を培養し、培養物からムンディティシンＫＳを採取することによっても、有利に生産することができる。かかるムンディティシンＫＳ生産菌の培養培地としては、特に制限されるものではないが、ＴＧＥ培地（組成：１リットルあたり牛肉抽出物（ディフコ社製）６ｇ、トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、グルコース（和光純薬社製）２ｇ）が大量生産用培地としては好ましく、この培地を用いて３７℃で嫌気的に１０〜１２時間培養することが好ましい。このようにして得られるムンディティシンＫＳは、現在食品保存料として利用されている唯一のバクテリオシンであるナイシン（日本食品科学工学会誌 第４７巻第１０号2000年10月）に比べて、リステリア菌に対する抗菌活性が強く、また、ナイシンはバチルス等などにも抗菌活性を示すが、本発明のムンディティシンＫＳは、バチルス等への抗菌活性がないことから、よりリステリア菌に特異的であり、安全であると考えられる。
【００１３】
ムンディティシンＫＳ生産能を有する野生型微生物や形質転換微生物、好ましくは食品に存在するリステリア・モノサイトジェネスを死滅あるいは減少させることができる乳酸菌、より好ましくは本発明のエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）や、これらの培養液を食品に添加することにより保存性に優れた食品を製造することができる。ムンディティシンＫＳ生産微生物や該微生物を含む培養液を食品に添加した場合、ムンディティシンＫＳ生産微生物が食品の表面や内部で増殖し、ムンディティシンＫＳを分泌することから、保存性に優れた食品を簡便に製造することができる。かかる食品としては、リステリア・モノサイトジェネス等の汚染微生物を加熱殺菌することができない非加熱食品、例えば生ハム等の非加熱食肉を好適に例示することができる。また、生ハム等の非加熱肉製品において乳酸菌をスターターとして用いる場合、ｐＨの低下による味への影響が懸念されるが、上記本発明のエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）は、他のスターター株と比べ、塩漬肉中でｐＨを下げないという特徴を有することから、風味への影響の少ないスターター株として特に有利に使用することができる。
【００１４】
以下に、本発明を実施例により詳述するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
実施例１［ムンディティシンＫＳの生産］
（乳酸菌の分離）
本発明者らは、発酵食品及びサイレージを分離源として多数の乳酸菌を分離した。分離した乳酸菌から、エンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標として、抗菌性物質生産能を有する乳酸菌を選択した。
乳酸菌の分離は以下の方法で実施した。各種の発酵食品及びサイレージから採取した試料を０．５％の炭酸カルシウムを含むLactobacilli MRS培地（組成：プロテオースペプトン１％、牛肉エキス１％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖２％、ツィーン 80 ０．１％、クエン酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸二カリウム０．２％、ディフコ社製）を用いて培養し、必要に応じて数回の継代培養を行った後、Lactobacilli MRS寒天培地（組成：上記の培地組成に寒天２％を添加したもの）に塗抹培養し、生じたコロニーから乳酸菌を５５０株分離した。
【００１５】
（分離した乳酸菌の同定）
次に、このようにして分離した乳酸菌５５０株から、エンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標として、ペーパーディスク法（Hoover,D.G. & Harlander,S.K., In Bacteriocins of lactic acid bacteria, Academic Press 社刊、23-39、1993）によって抗菌性物質生産能を有する乳酸菌４５株を選択した。この中でも、特に強い抗菌活性を有する菌株を選択し、選択した乳酸菌の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列の相同性（Mori,K. et al.:Int.J.Syst.Bacteriol.,47巻、54-57、1997）によりエンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株と１００％の相同性を示したこと、糖質の発酵性がエンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株と一致したことなどの性質から、本菌はエンテロコッカス・ムンディティに属する菌株であることが分かった。そこで、本菌をエンテロコッカス・ムンディティ７３９３と命名した。本菌の同定に関する知見を表１に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】
（従来菌株との比較）
アガーウェル法により、エンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株（Type Strain）の培養上清と、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養上清のリステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌活性を、トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用して調べた。７ｍｍ以上の阻止円を形成した場合に抗菌活性ありと評価した。結果を表２に示す。表２中、“＋”は７〜１２ｍｍの阻止円を形成したことを、“＋＋”は１３〜１８ｍｍの阻止円を形成したことをそれぞれ示している。表２から、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株はリステリア抗菌活性物質を生産するが、エンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株は抗菌活性物質を生産しないことが明らかとなった。このことから、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株は新規な菌株であると認定し、該７３９３株を経済産業省独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１８３００である。
【００１８】
【表２】
【００１９】
（エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株による抗菌性物質の生産）
次に、単離したエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３００）をLactobacilli MRS培地（組成：前記の通り、ディフコ社製）に接種し、３７℃で０〜１０時間培養した際の、７３９３株の生育状態ならびに抗菌性物質生産性について調べた。結果を図１に示す。図１には、３７℃で培養したときの７３９３株の増殖量をＯＤ600で測定し、抗菌性物質の活性をエンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標としたアガーウェル法によって調べた結果が示されている。図１から明らかなように、３７℃で培養した場合、４時間で十分な菌の発育が認められ、多量の抗菌性物質が生産されることがわかった。図中、■は７３９３株の発育を、●は抗菌性物質の生産性を示す。また、培養温度による抗菌性物質生産性への影響について調べた。１５℃〜４５℃で培養した際の結果を図２に示す。図２には、１５℃〜４５℃で培養したときの、抗菌性物質生産性をエンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標としたアガーウェル法によって調べた結果が示されている。図２から明らかなように、２０℃〜３７℃で培養したときに抗菌活性が強いことがわかった。
【００２０】
（エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養）
本発明のバクテリオシンであるムンディティシンＫＳの取得を目的として、７３９３株を大量に培養する場合は、培地としてＴＧＥ培地（組成：１リットルあたり牛肉抽出物（ディフコ社製）６ｇ、トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、グルコース（和光純薬社製）２ｇ）を用いることが好ましく、この培地を用いて３７℃で嫌気的に１０〜１２時間培養することが好ましい。
【００２１】
（抗菌活性物質の検出）
培養ろ液を６０％の硫酸アンモニウムで沈殿させ、Ｃ−１８の逆相カラムを用いてアセトニトリルで段階溶出したものを、Ｔｒｉｃｉｎ−ＳＤＳ ＰＡＧＥにより電気泳動を行い、エンテロコッカス・ファセウムに対する活性染色を行った。図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及び活性染色（Ｂ）の写真である。図３から明らかなように、分子量約５ｋＤａの位置に抗菌活性が検出された。
【００２２】
実施例２［ムンディティシンＫＳ遺伝子とその関連遺伝子］
（ムンディティシンＫＳ遺伝子のクローニング）
ムンディティシンＫＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列表の配列番号１記載のＤＮＡ）のクローニングは次のように行った。
乳酸菌−大腸菌のシャトルベクターpRH100（選択マーカー；アンピシリン耐性＜大腸菌＞，エリスロマイシン耐性＜乳酸菌＞）を、文献（Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook.1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）記載の方法に準じて構築し、これに制限酵素Sau3AIで部分分解した７３９３株ゲノムＤＮＡを挿入してゲノムライブラリーを作製した。宿主菌としてバクテリオシン感受性菌エンテロコッカス・ファセウムを用い、作製したゲノムライブラリーをエレクトロポーレーションにより導入し、７３９３株を取り除いたバクテリオシンを含む培養液（５％ｖ／ｖ）とエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を添加したLactobacilli MRS寒天培地で形質転換体を選択した。
【００２３】
次に、この形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡを制限酵素BamHI、HindIIIで部分消化し、ベクターpBluescript II KS(+)（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、選択マーカー；アンピシリン耐性＜大腸菌＞）に挿入し、エレクトロポーレーションにより大腸菌に導入し、アンピシリンを添加した寒天培地で形質転換体を選択した。この形質転換体の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。その結果、配列番号１に記載の配列を有するＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片中には、少なくとも３つの解読枠（ＯＲＦ）が存在し、配列番号１記載の配列中１７７６番目から１９４９番目に存在するＯＲＦ１（配列番号２）がコードするアミノ酸配列と他のバクテリオシンのアミノ酸配列とのホモロジーを比較した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、本アミノ酸配列は既知のバクテリオシンと類似性が高く、バクテリオシンのアミノ酸配列を示していることがわかった。ＯＲＦ１を常法によりＰＣＲ増幅し、このＰＣＲ産物を発現ベクターpET-3を用いて常法により大腸菌で発現させ、大腸菌よりバクテリオシンを精製したところ、その精製物にエンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を確認した。したがって、ＯＲＦ１がバクテリオシン生合成遺伝子を含むことも明らかとなった。また、本バクテリオシンの精製標品をプロテインシークエンサーにより解析したところ、ＯＲＦ１がコードするアミノ酸配列の１６番目の残基であるリジン残基以降がバクテリオシンのアミノ酸配列であることが明らかとなった（配列番号３）。
【００２４】
（ムンディティシンＫＳ）
上記配列番号３に示されるアミノ酸配列は、新規な構造を有することが判明したので、このバクテリオシンをムンディティシンＫＳと命名した。なお、このバクテリオシンの有する保存アミノ酸から、このバクテリオシンはKlaenhammerの示したバクテリオシンの分類（Klaenhammer,T.R.：FEMS Microbiol. Rev.,12巻、39-86、1993）における低分子量・耐熱性クラス（クラスIIa）に属することも判明した。
【００２５】
（バクテリオシン関連遺伝子の領域の決定）
上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片には、上記ＯＲＦ１の他に少なくとも２つのＯＲＦ、すなわち、配列番号１に示される塩基配列のうち、２０９４番目から４１１８番目に存在するＯＲＦ２（配列番号４）と４１４３番目から４４３９番目に存在するＯＲＦ３（配列番号６）が存在する。これらＯＲＦ２とＯＲＦ３がコードするタンパク質の性質について調べてみた。
ホモロジー検索の結果ＯＲＦ２（配列番号４）がコードするアミノ酸配列（配列番号５）からなるタンパク質は既存の細菌由来のＡＴＰ依存性膜輸送タンパク質のいくつかとアミノ酸配列全体に渡り高い相同性を示したことから、バクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質であることがわかった。したがって、ＯＲＦ２（配列番号４）がバクテリオシンの細胞外への排出に関与する遺伝子であることも明らかとなった。また、ＯＲＦ３（配列番号６）のみを常法によりＰＣＲ増幅し、このＰＣＲ産物を乳酸菌−大腸菌のシャトルベクターpRH100を用いて常法によりエンテロコッカス・ファセウムで発現させたところ、ムンディティシンＫＳに耐性を示すことを確認した。このことから、ＯＲＦ３（配列番号６）が、バクテリオシン耐性付与活性を有するタンパク質をコードするバクテリオシンの耐性付与に関与する遺伝子であることも明らかとなった。
【００２６】
実施例３［ムンディティシンＫＳの物性］
（ムンディティシンＫＳのｐＨ安定性）
実施例１により得られた精製ムンディティシンＫＳを、最終濃度が０．０１重量％となるように各種ｐＨの緩衝液に溶解し、３７℃で３０分間保温した後、ｐＨを６．０に戻し、ムンディティシンＫＳのｐＨ安定性を調べた。緩衝液としては、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ４〜６）、１０ｍＭ ＴＥＳ（ｐＨ６〜８）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８〜１１）を用い、ｐＨ６．０への調整は、等量の５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）添加により行った。リステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌活性は、前記トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用するアガーウェル法により測定した。その結果、ムンディティシンＫＳはｐＨ４〜１１のときは８０〜１００％の活性を保ち、広いｐＨ範囲で安定性を有することが明らかとなった。
【００２７】
（ムンディティシンＫＳの温度安定性）
実施例１により得られた精製ムンディティシンＫＳを、最終濃度が０．０１重量％となるように２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、このバクテリオシン溶解液を０〜１００℃で１時間加熱又は冷却した後の残存抗菌活性を測定することにより、ムンディティシンＫＳの温度安定性を調べた。リステリア・モノサイトジェネスに対する残存抗菌活性は、前記トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用するアガーウェル法により測定した。結果を図５に示す。図５から、０℃〜７０℃では１００％の抗菌活性を維持し、８０℃で約８０％、１００℃で約５０％の抗菌活性を維持していることがわかった。
【００２８】
実施例４［ムンディティシンＫＳの抗菌特性］
（ムンディティシンＫＳの抗菌スペクトル）
実施例１により得られた精製ムンディティシンＫＳを、最終濃度が０．０１重量％となるようにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、このバクテリオシン溶解液を用いて、ムンディティシンＫＳの各種病原菌に対する抗菌スペクトルをアガーウェル法により調べた。７ｍｍ以上の阻止円を形成した場合に、抗菌効果ありと評価した。測定結果と被検菌の培養条件を表３に示す。表３中、“＋”は７〜１２ｍｍの阻止円を形成したことを、“＋＋”は１３〜１８ｍｍの阻止円を形成したことをそれぞれ示している。表３から明らかなように、食中毒などの原因となるリステリア・モノサイトジェネスやクロストリジウム・パーフリンジェンスに対してムンディティシンＫＳは生育阻害効果があることが明らかとなった。なお、試験に用いた培地の組成は以下の通りである。
トリプトソーヤ寒天培地：ペプトン１．５％、ダイズペプトン０．５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％（日水製薬社製）
ＧＡＭ寒天培地：ペプトン１％、ダイズペプトン０．３％、プロテオーゼペプトン１％、消化血清末１．３５％、酵母エキス０．５％、肉エキス０．２２％、肝臓エキス０．１２％、ブドウ糖０．３％、リン酸二水素カリウム０．２５％、塩化ナトリウム０．３％、溶性デンプン０．５％、Ｌ−システイン塩酸塩０．０３％、チオグリコール酸ナトリウム０．０３％、寒天１．５％（日水製薬社製）
【００２９】
【表３】
【００３０】
（ムディティシンＫＳの食品腐敗・変敗菌に対する抗菌効果）
ムンディティシンＫＳの各種食品の腐敗・変敗の原因となるエンテロコッカス・フェカリスに対する抗菌効果を調べた。抗菌効果の測定は、液体培地系（培地組成：トリプトン１．２５％、酵母エキス０．７５％、ブドウ糖１．０％、クエン酸ナトリウム０．５％、チアミン塩酸塩０．０００１％、塩化ナトリウム１．５％、リン酸水素二カリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０８％、塩化マンガン０．０１４％、硫酸鉄（II）０．００４％、ツィーン８０ ０．０２％、ｐＨ６．０）で行い、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養上清液を１０倍濃縮し、０％（コントロール；◆）、１％（●）及び１０％（△）をそれぞれ添加した。結果を図６に示す。図６から明らかなように、エンテロコッカス・フェカリスに対して、ムンディティシンＫＳは生育阻害効果があることが明らかとなった。
【００３１】
（ムンディティシンＫＳとナイシンとの比較）
ムンディティシンＫＳと公知のバクテリオシンであるナイシンのリステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌効果を比較した。抗菌効果の測定は、上記液体培地系で行い、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養上清液を１０倍濃縮し、０％（コントロール；◆）、１％（○）及び１０％（×）をそれぞれ添加した。また、ナイシンは、４００ＩＵ／ｍｌ溶液を１％（４ＩＵ／ｍｌ；△）及び１０％（４０ＩＵ／ｍｌ；■）をそれぞれ添加した。結果を図７に示す。図７から明らかなように、ムンディティシンＫＳは、食中毒の原因となるリステリア・モノサイトジェネスに対して、ナイシンより強い生育阻害効果を有することがわかった。
【００３２】
（ムンディティシンＫＳとエンテロシンＳＥ−Ｋ４との比較）
ムンディティシンＫＳと公知のバクテリオシンであるエンテロシンＳＥ−Ｋ４（Biosci.Biotechnol.Biochem. Vol.65, No.2, 2001, 247-253）のリステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌効果を比較した。抗菌効果の測定は、トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用するアガーウェル法により行った。結果を表４に示す。表４中、“＋”は７〜１２ｍｍの阻止円を形成したことを、“＋＋”は１３〜１８ｍｍの阻止円を形成したことをそれぞれ示している。表４から、エンテロシンＳＥ−Ｋ４よりもムンディティシンＫＳの方が、リステリアに対する抗菌効果が高いことがわかった。
【００３３】
【表４】
【００３４】
実施例５［ムンディティシンＫＳの食品への適用］
エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株を生ハム製造におけるスターターとして使用した。生ハムをモデルとした塩漬肉（挽肉２００ｇ、食塩４．１３％、亜硝酸ナトリウム３００ｐｐｍ、アスコルビン酸ナトリウム０．０６％、糖類２．０％）にリステリア・モノサイトジェネスを１０4個／ｇ接種した。次いで、スターター株として、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株とラクトバシルス・サケを１０7個／ｇ〜１０8個／ｇそれぞれ接種し、空気封入包装をした後、１０℃、１５℃及び２０℃で９日間それぞれ保管した。エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合のリステリア・モノサイトジェネスの生菌数の推移を図８に、ラクトバシルス・サケをスターターとした場合のリステリア・モノサイトジェネスの生菌数の推移を図９にそれぞれ示す。その結果、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合、２０℃保管でリステリアの殺菌効果が認められたが、ラクトバシルス・サケをスターターとした場合、リステリアの殺菌効果が認められなかった。また、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合、２０℃で保管９日目における製品のｐＨは、１０℃；ｐＨ５．７３、１５℃；ｐＨ５．５５、２０℃；ｐＨ５．３７であったのに対し、ラクトバシルス・サケをスターターとした場合、２０℃で保管９日目における製品のｐＨは、１０℃；ｐＨ４．８５、１５℃；ｐＨ４．８０、２０℃；ｐＨ４．７５であり、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合にはｐＨの低下が少なく、肉製品における味への影響も少ないことがわかった。なお、製品のｐＨは、５倍量の脱イオン水を添加後、ホモゲナイズした上清をｐＨメータにより測定した。
【００３５】
実施例６[大腸菌での組換え型ムンディティシンＫＳとムンディティシンＡＴＯ６の発現]
ムンディティシンＫＳとムンディティシンＡＴＯ６との生物活性における差異を検証するために、大腸菌での組換え型ムンディティシンＫＳとＡＴＯ６の発現を行った。Ｎ末端にヒスチジンのタグ配列とｒＴＥＶ（recombinant tabbaco etch virus）プロテアーゼ切断認識配列を付加したムンディティシンを大腸菌で大量発現し、タグ配列を利用してアフィニティクロマトグラフィーで精製した。そして、ｒＴＥＶプロテアーゼ切断により余分なＮ末端付加配列を取り除き、組換え型ムンディティシンのｒＭｕｎＫＳとｒＭｕｎＡＴＯ６を得た。ｒＭｕｎＫＳとｒＭｕｎＡＴＯ６ペプチドは、ともに天然型には存在しないグリシン残基をＮ末端に1つ余分に持っていたが、これら組換え型ムンディティシンは、いずれもエンテロコッカス・ファセウム（E.faecium）に対して、天然のムンディティシンＫＳと同等の抗菌比活性（４．１×１０6ＡＵ／ｍｇタンパク質）を有したが、その他のムンディティシン感受性乳酸菌に対しては、ｒＭｕｎＫＳとｒＭｕｎＡＴＯ６との抗菌比活性には差があり、その程度が感受性菌によって異なっていた。すなわち、ラクトバシルス・プランタルム（L.plantarum）に対してｒＭｕｎＡＴＯ６はｒＭｕｎＫＳの約１０％、ラクトバシルス・カルバタス（L.carvatus）に対してｒＭｕｎＡＴＯ６はｒＭｕｎＫＳの約５０％の抗菌比活性を示したにすぎなかった（図１０参照）。これらのことから、ムンディティシンＫＳは一次構造と抗菌活性の両方で、ムンディティシンＡＴＯ６とは異なる新規バクテリオシンであることが明らかとなった。さらに、バクテリオシンのＣ末端の特定のアミノ酸配列が標的細胞の特異性に関与することも明らかになった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のムンディティシンＫＳは、耐熱性に優れたバクテリオシンであり、リステリア・モノサイトジェネスやクロストリジウムなど、特定の細菌に対して抗菌スペクトルを示す。そのため、このバクテリオシンを食品などに添加することによってこうした食中毒菌や一部の腐敗・変敗菌など特定の生育を阻害し、食品の腐敗や品質の低下を有効に防止することができる。また、このバクテリオシンは乳酸菌に由来しており、しかも人体内で容易に分解されるため、従来の化学合成された食品保存料と比べ、大量に摂取しても安全性の上で心配がなく、健康面から好ましいものである。しかも、従来のバクテリオシンに比べ、抗菌スペクトルが特異的であるため、腸内細菌などへの影響も少なく、より安全性が高い。
【００３７】
また、本発明のムンディティシンＫＳ産生新規乳酸菌株は、食中毒の原因となるリステリアに対して特異的な抗菌活性を有するとともに、乳酸菌であってもｐＨの低下が少ない等の特性を有し、例えば、非加熱食肉の製造において、製品の味を変えずに、有効な抗菌活性を付与する等、食品製造に有利に用いることができる。
【００３８】
さらに、本発明のムンディティシンＫＳをコードするＤＮＡは組換えムンディティシンＫＳ等の大量生産に用いることができる。また、本発明のバクテリオシン関連遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質は、上記組換えムンディティシンＫＳ等の大量生産への応用が期待できるばかりか、バクテリオシンの細胞外への排出機構の解明や、バクテリオシンの作用機序を解明する上で有用である。
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の３７℃における増殖及びムンディティシンＫＳ生産量を示す図である。
【図２】ムンディティシンＫＳ生産量に及ぼす培養温度の影響を示す図である。
【図３】ムンディティシンＫＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）や活性染色（Ｂ）の結果を示す図である。
【図４】ムンディティシンＫＳのアミノ酸配列と他のバクテリオシンとの比較を示す図である。
【図５】ムンディティシンＫＳの熱安定性を示す図である。
【図６】ムンディティシンＫＳの食品の腐敗・変敗菌への生育阻害効果を示す図である。
【図７】ムンディティシンＫＳのリステリア・モノサイトジェネスに対する生育阻害効果を示す図である。
【図８】エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株のリステリアに対する殺菌効果を示す図である。
【図９】ラクトバシルス・サケのリステリアに対する殺菌効果を示す図である。
【図１０】組換え型ムンディティシンＫＳとＡＴＯ６の抗菌スペクトルの違いを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗菌性ペプチドである新規バクテリオシン、その製造方法、及びその用途等に関し、詳しくは新規バクテリオシンであるムンディティシンＫＳとその製造方法、該バクテリオシンをコードする遺伝子、該バクテリオシン関連遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質、及び、該バクテリオシン、その生産微生物及びその培養物を用いる保存性に優れた食品の製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品の腐敗や品質の低下などを防止する目的で、食品保存料が種々の食品に添加されている。かかる食品保存料としては、これまでは主に化学的に合成された合成保存料が用いられている。しかしながら、合成保存料の大量摂取は、人体にとって健康面から好ましくなく、その原因の１つは、化学合成保存料が人体内で容易に分解されないことにある。このような問題を解決するためには、人体内で容易に分解される抗菌性物質の開発が必要である。
【０００３】
ところで、乳酸菌は、古来より醤油、味噌、漬け物、日本酒などの様々な発酵食品や発酵飲料の生産に利用されている有用な微生物の１つである。乳酸菌を発酵食品などの製造過程で用いることにより乳酸発酵が行われて、生産された乳酸によって系のｐＨが低下したり、該乳酸菌が抗菌性物質を産生したりすることで、製造過程及び製品中での雑菌などの生育を阻害することが可能となり、製品の腐敗や品質の低下を防ぐことができる。
【０００４】
乳酸菌の生成するバクテリオシンについてもいくつかの報告がある。日本食品科学工学雑誌第４７巻第１０号（2000年10月）752-759頁には、ラクトコッカス・ラクチスから生成したナイシンを味噌の醸造に利用することについて、Biochimica et Biophysica Acta 1373 (1998) 47-58には、エンテロコッカス・ムンディティが生産するバクテリオシンについて、特開平７−５１０５５号公報には、リステリア・モノサイトジェネスに対して生育抑制作用を有するエンテロコッカス属に属する新規微生物について報告されている。また、特許第2618148号には、ペディオコッカス・アシディラクティシィ中のプラスミドから誘導されるバクテリオシンをコードする遺伝子配列について開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、古くから食品及び食品加工に利用されている乳酸菌が生産する、安全性の高い新規バクテリオシン、その製造法、その利用方法及び該バクテリオシンをコードする遺伝子等を提供することにある。詳細には、ナイシンやペディオシン等の、乳酸菌に由来し、人体内で容易に分解される抗菌物質であると共に、乳酸菌が産生するバクテリオシンとして広く利用され、多くの微生物の生育を阻害することが知られている公知のバクテリオシンに比較して、阻害する微生物の選択性が高く、より安全性が高い新規バクテリオシンや、該新規バクテリオシンをコードする遺伝子や、該遺伝子に関連する遺伝子及びそれがコードするタンパク質や、新規バクテリオシンを用いた保存性に優れた食品の製造法等を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究し、発酵食品やサイレージなどに存在する乳酸菌を分離して、バクテリオシン生産能を有する菌株の探索を行ったところ、バクテリオシン生産能を有する新規乳酸菌株の分離に成功し、更に該菌株によって生産されるバクテリオシンやその遺伝子が新規物質であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、配列番号２に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項１）に関する。
【０００８】
また本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン活性を有するムンディティシンＫＳ（請求項２）に関する。
【０００９】
さらに本発明は、エンテロコッカス属に属するムンディティシンＫＳ生産菌を培養し、培養物からムンディティシンＫＳを採取することを特徴とするムンディティシンＫＳの製造法（請求項３）や、ムンディティシンＫＳの生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ（請求項４）や、ムンディティシンＫＳの生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）（請求項５）や、ムンディティシンＫＳ、ムンディティシンＫＳ生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ又はその培養液を食品に添加することを特徴とする保存性に優れた食品の製造法（請求項６）や、エンテロコッカス・ムンディティが、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）であることを特徴とする請求項６に記載の保存性に優れた食品の製造法（請求項７）や、食品が非加熱食肉であることを特徴とする請求項６又は７に記載の保存性に優れた食品の製造法（請求項８）に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡや、配列番号２に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡや、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号４に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡや、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン耐性機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号６に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡであれば特に制限されるものではなく、中でも、新規バクテリオシンであるムンディティシンＫＳや、バクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質や、バクテリオシン耐性機能を有するタンパク質をそれぞれコードする遺伝子ＤＮＡを好適に例示することができ、これらＤＮＡの由来は特に制限されない。ムンディティシンＫＳをコードする配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡは、組換えムンディティシンＫＳの大量生産や、食品製造に通常用いられているバクテリオシン耐性微生物にバクテリオシン産生能を付与するために用いることができ、その相補配列は遺伝子レベルでのバクテリオシン遺伝子の検出に用いることができる。また、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡや配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡは、遺伝子レベルでの、バクテリオシンの細胞外分泌機構の解明や、バクテリオシンの作用機序を解明する上で有用である。さらに、配列番号１に示される塩基配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列は、食品製造に通常用いられている微生物にバクテリオシン産生能を付与するために用いることができる。そして、バクテリオシン産生能が付与された形質転換微生物は、生ハム等のｐＨにシビアな食品に有利に用いることができる。
【００１１】
本発明の対象となるタンパク質としては、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン活性を有するムンディティシンＫＳや、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質や、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン耐性機能を有するタンパク質であれば特に制限されるものではなく、ここで、バクテリオシン細胞外排出活性とは、菌体内に生成したバクテリオシンを細胞外に排出する活性をいい、またバクテリオシン耐性機能とは、菌体内に生成したバクテリオシンから菌自らを守る機能をいう。配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるムンディティシンＫＳ、あるいは配列番号５又は配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列番号４又は配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡを、公知のホストベクター系を利用して発現させることにより得ることができる。上記ムンディティシンＫＳは、非加熱食肉等の食品に存在するリステリア・モノサイトジェネスを死滅あるいは減少させ、保存性に優れた食品を製造する上で有利に用いることができ、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質や配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン耐性機能を有するタンパク質は、バクテリオシンの細胞外分泌機構の解明や、バクテリオシンの作用機序を解明する上で有用である。
【００１２】
上記ムンディティシンＫＳは、エンテロコッカス属に属するムンディティシンＫＳ生産菌、好ましくはエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）を培養し、培養物からムンディティシンＫＳを採取することによっても、有利に生産することができる。かかるムンディティシンＫＳ生産菌の培養培地としては、特に制限されるものではないが、ＴＧＥ培地（組成：１リットルあたり牛肉抽出物（ディフコ社製）６ｇ、トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、グルコース（和光純薬社製）２ｇ）が大量生産用培地としては好ましく、この培地を用いて３７℃で嫌気的に１０〜１２時間培養することが好ましい。このようにして得られるムンディティシンＫＳは、現在食品保存料として利用されている唯一のバクテリオシンであるナイシン（日本食品科学工学会誌 第４７巻第１０号2000年10月）に比べて、リステリア菌に対する抗菌活性が強く、また、ナイシンはバチルス等などにも抗菌活性を示すが、本発明のムンディティシンＫＳは、バチルス等への抗菌活性がないことから、よりリステリア菌に特異的であり、安全であると考えられる。
【００１３】
ムンディティシンＫＳ生産能を有する野生型微生物や形質転換微生物、好ましくは食品に存在するリステリア・モノサイトジェネスを死滅あるいは減少させることができる乳酸菌、より好ましくは本発明のエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）や、これらの培養液を食品に添加することにより保存性に優れた食品を製造することができる。ムンディティシンＫＳ生産微生物や該微生物を含む培養液を食品に添加した場合、ムンディティシンＫＳ生産微生物が食品の表面や内部で増殖し、ムンディティシンＫＳを分泌することから、保存性に優れた食品を簡便に製造することができる。かかる食品としては、リステリア・モノサイトジェネス等の汚染微生物を加熱殺菌することができない非加熱食品、例えば生ハム等の非加熱食肉を好適に例示することができる。また、生ハム等の非加熱肉製品において乳酸菌をスターターとして用いる場合、ｐＨの低下による味への影響が懸念されるが、上記本発明のエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）は、他のスターター株と比べ、塩漬肉中でｐＨを下げないという特徴を有することから、風味への影響の少ないスターター株として特に有利に使用することができる。
【００１４】
以下に、本発明を実施例により詳述するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
実施例１［ムンディティシンＫＳの生産］
（乳酸菌の分離）
本発明者らは、発酵食品及びサイレージを分離源として多数の乳酸菌を分離した。分離した乳酸菌から、エンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標として、抗菌性物質生産能を有する乳酸菌を選択した。
乳酸菌の分離は以下の方法で実施した。各種の発酵食品及びサイレージから採取した試料を０．５％の炭酸カルシウムを含むLactobacilli MRS培地（組成：プロテオースペプトン１％、牛肉エキス１％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖２％、ツィーン 80 ０．１％、クエン酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸二カリウム０．２％、ディフコ社製）を用いて培養し、必要に応じて数回の継代培養を行った後、Lactobacilli MRS寒天培地（組成：上記の培地組成に寒天２％を添加したもの）に塗抹培養し、生じたコロニーから乳酸菌を５５０株分離した。
【００１５】
（分離した乳酸菌の同定）
次に、このようにして分離した乳酸菌５５０株から、エンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標として、ペーパーディスク法（Hoover,D.G. & Harlander,S.K., In Bacteriocins of lactic acid bacteria, Academic Press 社刊、23-39、1993）によって抗菌性物質生産能を有する乳酸菌４５株を選択した。この中でも、特に強い抗菌活性を有する菌株を選択し、選択した乳酸菌の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列の相同性（Mori,K. et al.:Int.J.Syst.Bacteriol.,47巻、54-57、1997）によりエンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株と１００％の相同性を示したこと、糖質の発酵性がエンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株と一致したことなどの性質から、本菌はエンテロコッカス・ムンディティに属する菌株であることが分かった。そこで、本菌をエンテロコッカス・ムンディティ７３９３と命名した。本菌の同定に関する知見を表１に示す。
【００１６】
【表１】
（従来菌株との比較）
アガーウェル法により、エンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株（Type Strain）の培養上清と、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養上清のリステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌活性を、トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用して調べた。７ｍｍ以上の阻止円を形成した場合に抗菌活性ありと評価した。結果を表２に示す。表２中、“＋”は７〜１２ｍｍの阻止円を形成したことを、“＋＋”は１３〜１８ｍｍの阻止円を形成したことをそれぞれ示している。表２から、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株はリステリア抗菌活性物質を生産するが、エンテロコッカス・ムンディティＪＣＭ８７３１株は抗菌活性物質を生産しないことが明らかとなった。このことから、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株は新規な菌株であると認定し、該７３９３株を経済産業省独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１８３００である。
【００１８】
【表２】
（エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株による抗菌性物質の生産）
次に、単離したエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３００）をLactobacilli MRS培地（組成：前記の通り、ディフコ社製）に接種し、３７℃で０〜１０時間培養した際の、７３９３株の生育状態ならびに抗菌性物質生産性について調べた。結果を図１に示す。図１には、３７℃で培養したときの７３９３株の増殖量をＯＤ600で測定し、抗菌性物質の活性をエンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標としたアガーウェル法によって調べた結果が示されている。図１から明らかなように、３７℃で培養した場合、４時間で十分な菌の発育が認められ、多量の抗菌性物質が生産されることがわかった。図中、■は７３９３株の発育を、●は抗菌性物質の生産性を示す。また、培養温度による抗菌性物質生産性への影響について調べた。１５℃〜４５℃で培養した際の結果を図２に示す。図２には、１５℃〜４５℃で培養したときの、抗菌性物質生産性をエンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を指標としたアガーウェル法によって調べた結果が示されている。図２から明らかなように、２０℃〜３７℃で培養したときに抗菌活性が強いことがわかった。
【００２０】
（エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養）
本発明のバクテリオシンであるムンディティシンＫＳの取得を目的として、７３９３株を大量に培養する場合は、培地としてＴＧＥ培地（組成：１リットルあたり牛肉抽出物（ディフコ社製）６ｇ、トリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、グルコース（和光純薬社製）２ｇ）を用いることが好ましく、この培地を用いて３７℃で嫌気的に１０〜１２時間培養することが好ましい。
【００２１】
（抗菌活性物質の検出）
培養ろ液を６０％の硫酸アンモニウムで沈殿させ、Ｃ−１８の逆相カラムを用いてアセトニトリルで段階溶出したものを、Ｔｒｉｃｉｎ−ＳＤＳ ＰＡＧＥにより電気泳動を行い、エンテロコッカス・ファセウムに対する活性染色を行った。図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）及び活性染色（Ｂ）の写真である。図３から明らかなように、分子量約５ｋＤａの位置に抗菌活性が検出された。
【００２２】
実施例２［ムンディティシンＫＳ遺伝子とその関連遺伝子］
（ムンディティシンＫＳ遺伝子のクローニング）
ムンディティシンＫＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列表の配列番号１記載のＤＮＡ）のクローニングは次のように行った。
乳酸菌−大腸菌のシャトルベクターpRH100（選択マーカー；アンピシリン耐性＜大腸菌＞，エリスロマイシン耐性＜乳酸菌＞）を、文献（Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook.1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor）記載の方法に準じて構築し、これに制限酵素Sau3AIで部分分解した７３９３株ゲノムＤＮＡを挿入してゲノムライブラリーを作製した。宿主菌としてバクテリオシン感受性菌エンテロコッカス・ファセウムを用い、作製したゲノムライブラリーをエレクトロポーレーションにより導入し、７３９３株を取り除いたバクテリオシンを含む培養液（５％ｖ／ｖ）とエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を添加したLactobacilli MRS寒天培地で形質転換体を選択した。
【００２３】
次に、この形質転換体から抽出したプラスミドＤＮＡを制限酵素BamHI、HindIIIで部分消化し、ベクターpBluescript II KS(+)（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、選択マーカー；アンピシリン耐性＜大腸菌＞）に挿入し、エレクトロポーレーションにより大腸菌に導入し、アンピシリンを添加した寒天培地で形質転換体を選択した。この形質転換体の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。その結果、配列番号１に記載の配列を有するＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片中には、少なくとも３つの解読枠（ＯＲＦ）が存在し、配列番号１記載の配列中１７７６番目から１９４９番目に存在するＯＲＦ１（配列番号２）がコードするアミノ酸配列と他のバクテリオシンのアミノ酸配列とのホモロジーを比較した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、本アミノ酸配列は既知のバクテリオシンと類似性が高く、バクテリオシンのアミノ酸配列を示していることがわかった。ＯＲＦ１を常法によりＰＣＲ増幅し、このＰＣＲ産物を発現ベクターpET-3を用いて常法により大腸菌で発現させ、大腸菌よりバクテリオシンを精製したところ、その精製物にエンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を確認した。したがって、ＯＲＦ１がバクテリオシン生合成遺伝子を含むことも明らかとなった。また、本バクテリオシンの精製標品をプロテインシークエンサーにより解析したところ、ＯＲＦ１がコードするアミノ酸配列の１６番目の残基であるリジン残基以降がバクテリオシンのアミノ酸配列であることが明らかとなった（配列番号３）。
【００２４】
（ムンディティシンＫＳ）
上記配列番号３に示されるアミノ酸配列は、新規な構造を有することが判明したので、このバクテリオシンをムンディティシンＫＳと命名した。なお、このバクテリオシンの有する保存アミノ酸から、このバクテリオシンはKlaenhammerの示したバクテリオシンの分類（Klaenhammer,T.R.：FEMS Microbiol. Rev.,12巻、39-86、1993）における低分子量・耐熱性クラス（クラスIIa）に属することも判明した。
【００２５】
（バクテリオシン関連遺伝子の領域の決定）
上記配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ断片には、上記ＯＲＦ１の他に少なくとも２つのＯＲＦ、すなわち、配列番号１に示される塩基配列のうち、２０９４番目から４１１８番目に存在するＯＲＦ２（配列番号４）と４１４３番目から４４３９番目に存在するＯＲＦ３（配列番号６）が存在する。これらＯＲＦ２とＯＲＦ３がコードするタンパク質の性質について調べてみた。
ホモロジー検索の結果ＯＲＦ２（配列番号４）がコードするアミノ酸配列（配列番号５）からなるタンパク質は既存の細菌由来のＡＴＰ依存性膜輸送タンパク質のいくつかとアミノ酸配列全体に渡り高い相同性を示したことから、バクテリオシン細胞外排出活性を有するタンパク質であることがわかった。したがって、ＯＲＦ２（配列番号４）がバクテリオシンの細胞外への排出に関与する遺伝子であることも明らかとなった。また、ＯＲＦ３（配列番号６）のみを常法によりＰＣＲ増幅し、このＰＣＲ産物を乳酸菌−大腸菌のシャトルベクターpRH100を用いて常法によりエンテロコッカス・ファセウムで発現させたところ、ムンディティシンＫＳに耐性を示すことを確認した。このことから、ＯＲＦ３（配列番号６）が、バクテリオシン耐性付与活性を有するタンパク質をコードするバクテリオシンの耐性付与に関与する遺伝子であることも明らかとなった。
【００２６】
実施例３［ムンディティシンＫＳの物性］
（ムンディティシンＫＳのｐＨ安定性）
実施例１により得られた精製ムンディティシンＫＳを、最終濃度が０．０１重量％となるように各種ｐＨの緩衝液に溶解し、３７℃で３０分間保温した後、ｐＨを６．０に戻し、ムンディティシンＫＳのｐＨ安定性を調べた。緩衝液としては、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ４〜６）、１０ｍＭ ＴＥＳ（ｐＨ６〜８）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８〜１１）を用い、ｐＨ６．０への調整は、等量の５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）添加により行った。リステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌活性は、前記トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用するアガーウェル法により測定した。その結果、ムンディティシンＫＳはｐＨ４〜１１のときは８０〜１００％の活性を保ち、広いｐＨ範囲で安定性を有することが明らかとなった。
【００２７】
（ムンディティシンＫＳの温度安定性）
実施例１により得られた精製ムンディティシンＫＳを、最終濃度が０．０１重量％となるように２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、このバクテリオシン溶解液を０〜１００℃で１時間加熱又は冷却した後の残存抗菌活性を測定することにより、ムンディティシンＫＳの温度安定性を調べた。リステリア・モノサイトジェネスに対する残存抗菌活性は、前記トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用するアガーウェル法により測定した。結果を図５に示す。図５から、０℃〜７０℃では１００％の抗菌活性を維持し、８０℃で約８０％、１００℃で約５０％の抗菌活性を維持していることがわかった。
【００２８】
実施例４［ムンディティシンＫＳの抗菌特性］
（ムンディティシンＫＳの抗菌スペクトル）
実施例１により得られた精製ムンディティシンＫＳを、最終濃度が０．０１重量％となるようにＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、このバクテリオシン溶解液を用いて、ムンディティシンＫＳの各種病原菌に対する抗菌スペクトルをアガーウェル法により調べた。７ｍｍ以上の阻止円を形成した場合に、抗菌効果ありと評価した。測定結果と被検菌の培養条件を表３に示す。表３中、“＋”は７〜１２ｍｍの阻止円を形成したことを、“＋＋”は１３〜１８ｍｍの阻止円を形成したことをそれぞれ示している。表３から明らかなように、食中毒などの原因となるリステリア・モノサイトジェネスやクロストリジウム・パーフリンジェンスに対してムンディティシンＫＳは生育阻害効果があることが明らかとなった。なお、試験に用いた培地の組成は以下の通りである。
トリプトソーヤ寒天培地：ペプトン１．５％、ダイズペプトン０．５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％（日水製薬社製）
ＧＡＭ寒天培地：ペプトン１％、ダイズペプトン０．３％、プロテオーゼペプトン１％、消化血清末１．３５％、酵母エキス０．５％、肉エキス０．２２％、肝臓エキス０．１２％、ブドウ糖０．３％、リン酸二水素カリウム０．２５％、塩化ナトリウム０．３％、溶性デンプン０．５％、Ｌ−システイン塩酸塩０．０３％、チオグリコール酸ナトリウム０．０３％、寒天１．５％（日水製薬社製）
【００２９】
【表３】
（ムディティシンＫＳの食品腐敗・変敗菌に対する抗菌効果）
ムンディティシンＫＳの各種食品の腐敗・変敗の原因となるエンテロコッカス・フェカリスに対する抗菌効果を調べた。抗菌効果の測定は、液体培地系（培地組成：トリプトン１．２５％、酵母エキス０．７５％、ブドウ糖１．０％、クエン酸ナトリウム０．５％、チアミン塩酸塩０．０００１％、塩化ナトリウム１．５％、リン酸水素二カリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０８％、塩化マンガン０．０１４％、硫酸鉄（II）０．００４％、ツィーン８０ ０．０２％、ｐＨ６．０）で行い、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養上清液を１０倍濃縮し、０％（コントロール；◆）、１％（●）及び１０％（△）をそれぞれ添加した。結果を図６に示す。図６から明らかなように、エンテロコッカス・フェカリスに対して、ムンディティシンＫＳは生育阻害効果があることが明らかとなった。
【００３１】
（ムンディティシンＫＳとナイシンとの比較）
ムンディティシンＫＳと公知のバクテリオシンであるナイシンのリステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌効果を比較した。抗菌効果の測定は、上記液体培地系で行い、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の培養上清液を１０倍濃縮し、０％（コントロール；◆）、１％（○）及び１０％（×）をそれぞれ添加した。また、ナイシンは、４００ＩＵ／ｍｌ溶液を１％（４ＩＵ／ｍｌ；△）及び１０％（４０ＩＵ／ｍｌ；■）をそれぞれ添加した。結果を図７に示す。図７から明らかなように、ムンディティシンＫＳは、食中毒の原因となるリステリア・モノサイトジェネスに対して、ナイシンより強い生育阻害効果を有することがわかった。
【００３２】
（ムンディティシンＫＳとエンテロシンＳＥ−Ｋ４との比較）
ムンディティシンＫＳと公知のバクテリオシンであるエンテロシンＳＥ−Ｋ４（Biosci.Biotechnol.Biochem. Vol.65, No.2, 2001, 247-253）のリステリア・モノサイトジェネスに対する抗菌効果を比較した。抗菌効果の測定は、トリプトソーヤ寒天培地（日水製薬株製）を使用するアガーウェル法により行った。結果を表４に示す。表４中、“＋”は７〜１２ｍｍの阻止円を形成したことを、“＋＋”は１３〜１８ｍｍの阻止円を形成したことをそれぞれ示している。表４から、エンテロシンＳＥ−Ｋ４よりもムンディティシンＫＳの方が、リステリアに対する抗菌効果が高いことがわかった。
【００３３】
【表４】
実施例５［ムンディティシンＫＳの食品への適用］
エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株を生ハム製造におけるスターターとして使用した。生ハムをモデルとした塩漬肉（挽肉２００ｇ、食塩４．１３％、亜硝酸ナトリウム３００ｐｐｍ、アスコルビン酸ナトリウム０．０６％、糖類２．０％）にリステリア・モノサイトジェネスを１０4個／ｇ接種した。次いで、スターター株として、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株とラクトバシルス・サケを１０7個／ｇ〜１０8個／ｇそれぞれ接種し、空気封入包装をした後、１０℃、１５℃及び２０℃で９日間それぞれ保管した。エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合のリステリア・モノサイトジェネスの生菌数の推移を図８に、ラクトバシルス・サケをスターターとした場合のリステリア・モノサイトジェネスの生菌数の推移を図９にそれぞれ示す。その結果、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合、２０℃保管でリステリアの殺菌効果が認められたが、ラクトバシルス・サケをスターターとした場合、リステリアの殺菌効果が認められなかった。また、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合、２０℃で保管９日目における製品のｐＨは、１０℃；ｐＨ５．７３、１５℃；ｐＨ５．５５、２０℃；ｐＨ５．３７であったのに対し、ラクトバシルス・サケをスターターとした場合、２０℃で保管９日目における製品のｐＨは、１０℃；ｐＨ４．８５、１５℃；ｐＨ４．８０、２０℃；ｐＨ４．７５であり、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株をスターターとした場合にはｐＨの低下が少なく、肉製品における味への影響も少ないことがわかった。なお、製品のｐＨは、５倍量の脱イオン水を添加後、ホモゲナイズした上清をｐＨメータにより測定した。
【００３５】
実施例６[大腸菌での組換え型ムンディティシンＫＳとムンディティシンＡＴＯ６の発現]
ムンディティシンＫＳとムンディティシンＡＴＯ６との生物活性における差異を検証するために、大腸菌での組換え型ムンディティシンＫＳとＡＴＯ６の発現を行った。Ｎ末端にヒスチジンのタグ配列とｒＴＥＶ（recombinant tabbaco etch virus）プロテアーゼ切断認識配列を付加したムンディティシンを大腸菌で大量発現し、タグ配列を利用してアフィニティクロマトグラフィーで精製した。そして、ｒＴＥＶプロテアーゼ切断により余分なＮ末端付加配列を取り除き、組換え型ムンディティシンのｒＭｕｎＫＳとｒＭｕｎＡＴＯ６を得た。ｒＭｕｎＫＳとｒＭｕｎＡＴＯ６ペプチドは、ともに天然型には存在しないグリシン残基をＮ末端に1つ余分に持っていたが、これら組換え型ムンディティシンは、いずれもエンテロコッカス・ファセウム（E.faecium）に対して、天然のムンディティシンＫＳと同等の抗菌比活性（４．１×１０6ＡＵ／ｍｇタンパク質）を有したが、その他のムンディティシン感受性乳酸菌に対しては、ｒＭｕｎＫＳとｒＭｕｎＡＴＯ６との抗菌比活性には差があり、その程度が感受性菌によって異なっていた。すなわち、ラクトバシルス・プランタルム（L.plantarum）に対してｒＭｕｎＡＴＯ６はｒＭｕｎＫＳの約１０％、ラクトバシルス・カルバタス（L.carvatus）に対してｒＭｕｎＡＴＯ６はｒＭｕｎＫＳの約５０％の抗菌比活性を示したにすぎなかった（図１０参照）。これらのことから、ムンディティシンＫＳは一次構造と抗菌活性の両方で、ムンディティシンＡＴＯ６とは異なる新規バクテリオシンであることが明らかとなった。さらに、バクテリオシンのＣ末端の特定のアミノ酸配列が標的細胞の特異性に関与することも明らかになった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のムンディティシンＫＳは、耐熱性に優れたバクテリオシンであり、リステリア・モノサイトジェネスやクロストリジウムなど、特定の細菌に対して抗菌スペクトルを示す。そのため、このバクテリオシンを食品などに添加することによってこうした食中毒菌や一部の腐敗・変敗菌など特定の生育を阻害し、食品の腐敗や品質の低下を有効に防止することができる。また、このバクテリオシンは乳酸菌に由来しており、しかも人体内で容易に分解されるため、従来の化学合成された食品保存料と比べ、大量に摂取しても安全性の上で心配がなく、健康面から好ましいものである。しかも、従来のバクテリオシンに比べ、抗菌スペクトルが特異的であるため、腸内細菌などへの影響も少なく、より安全性が高い。
【００３７】
また、本発明のムンディティシンＫＳ産生新規乳酸菌株は、食中毒の原因となるリステリアに対して特異的な抗菌活性を有するとともに、乳酸菌であってもｐＨの低下が少ない等の特性を有し、例えば、非加熱食肉の製造において、製品の味を変えずに、有効な抗菌活性を付与する等、食品製造に有利に用いることができる。
【００３８】
さらに、本発明のムンディティシンＫＳをコードするＤＮＡは組換えムンディティシンＫＳ等の大量生産に用いることができる。また、本発明のバクテリオシン関連遺伝子や該遺伝子がコードするタンパク質は、上記組換えムンディティシンＫＳ等の大量生産への応用が期待できるばかりか、バクテリオシンの細胞外への排出機構の解明や、バクテリオシンの作用機序を解明する上で有用である。
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株の３７℃における増殖及びムンディティシンＫＳ生産量を示す図である。
【図２】ムンディティシンＫＳ生産量に及ぼす培養温度の影響を示す図である。
【図３】ムンディティシンＫＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）や活性染色（Ｂ）の結果を示す図である。
【図４】ムンディティシンＫＳのアミノ酸配列と他のバクテリオシンとの比較を示す図である。
【図５】ムンディティシンＫＳの熱安定性を示す図である。
【図６】ムンディティシンＫＳの食品の腐敗・変敗菌への生育阻害効果を示す図である。
【図７】ムンディティシンＫＳのリステリア・モノサイトジェネスに対する生育阻害効果を示す図である。
【図８】エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株のリステリアに対する殺菌効果を示す図である。
【図９】ラクトバシルス・サケのリステリアに対する殺菌効果を示す図である。
【図１０】組換え型ムンディティシンＫＳとＡＴＯ６の抗菌スペクトルの違いを示す図である。
Claims (8)
- 配列番号２に示される塩基配列又はその相補的配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるバクテリオシン活性を有するムンディティシンＫＳ。
- エンテロコッカス属に属するムンディティシンＫＳ生産菌を培養し、培養物からムンディティシンＫＳを採取することを特徴とするムンディティシンＫＳの製造法。
- ムンディティシンＫＳの生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ。
- ムンディティシンＫＳの生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）。
- ムンディティシンＫＳ、ムンディティシンＫＳ生産能を有するエンテロコッカス・ムンディティ又はその培養液を食品に添加することを特徴とする保存性に優れた食品の製造法。
- エンテロコッカス・ムンディティが、エンテロコッカス・ムンディティ７３９３株（ＦＥＲＭ−Ｐ１８３００）であることを特徴とする請求項６に記載の保存性に優れた食品の製造法。
- 食品が非加熱食肉であることを特徴とする請求項６又は７に記載の保存性に優れた食品の製造法。
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