JP3472804B2 - 新規バクテリオシン及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規バクテリオシ
ンであるエンテロシンＳＥ−Ｋ４、該バクテリオシンの
製造方法に関し、詳しくは抗菌性ペプチドである新規バ
クテリオシンとその製造方法に関する。この抗菌性ペプ
チドは、食品保存料等として有用である。

【０００２】

【従来の技術】食品の腐敗や品質の低下等を防止する目
的で、食品保存料が種々の食品に添加されている。かか
る食品保存料としては、これまでは主に化学的に合成さ
れた食品保存料が用いられている。しかしながら、化学
的に合成された食品保存料の大量摂取は、人間にとって
健康面から好ましくない。その原因の１つは、化学合成
保存料が人体内で容易に分解されないことである。この
ような問題を解決するためには、人体内で容易に分解さ
れる抗菌性物質の開発が必要である。ところで、乳酸菌
は、古来より醤油、味噌、漬け物、日本酒等の様々な発
酵食品や発酵飲料の生産に利用されている有用な微生物
の１つである。乳酸菌を発酵食品等の製造過程で用いる
ことにより、乳酸発酵が行われて産生された乳酸によっ
て系のｐＨが低下したり、該乳酸菌が抗菌性物質を産生
したりすることで、製造過程及び製品中での雑菌等の生
育を阻害することが可能となり、製品の腐敗や品質の低
下を防ぐことができる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記したように、乳酸
菌は、古くから食品及び食品加工に利用されており、安
全性の面で心配がない。したがって、乳酸菌が生産する
抗菌性物質は、化学的に合成された物質よりも安全性が
高いと考えられる。本発明の目的は、乳酸菌に由来し、
人体内で容易に分解される抗菌性ペプチドを開発するこ
とである。

【０００４】各種細菌によって生産されるタンパク質性
の抗菌性物質はバクテリオシンと称されている。本発明
者らは、発酵食品やサイレージ等に存在する乳酸菌を分
離して、バクテリオシン生産能を有する菌株の探索を行
った。その結果、抗菌性ペプチド生産能を有する乳酸菌
の分離に成功し、本菌によって生産される抗菌性物質
は、新規物質であることを確認して本発明を完成した。
なお、本発明者らは、当該新規バクテリオシンをエンテ
ロシンＳＥ−Ｋ４と命名した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の本発明
は、下記の性質を有する新規バクテリオシン、エンテロ
シンＳＥ−Ｋ４である。 （ａ）分子量：約５ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法による） （ｂ）エンテロコッカス・ファセウムに対し抗菌活性を
有する （ｃ）耐熱性を有する （ｄ）食中毒菌に対し抗菌作用がある （ｅ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の
配列を有する

【０００６】請求項２記載の本発明は、エンテロコッカ
ス・フェカリスＫ−４株（ＦＥＲＭＢＰ−７１６２）を
培養し、培養物から請求項１記載の新規バクテリオシ
ン、エンテロシンＳＥ−Ｋ４を採取することを特徴とす
る新規バクテリオシン、エンテロシンＳＥ−Ｋ４の製造
方法である。請求項３記載の本発明は、請求項１記載の
新規バクテリオシン、エンテロシンＳＥ−Ｋ４の生産能
を有するエンテロコッカス・フェカリスＫ−４株（ＦＥ
ＲＭＢＰ−７１６２）である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明者らは、タイ国において発
酵食品及びサイレージを分離源として多数の乳酸菌を分
離した。分離した乳酸菌から、エンテロコッカス・ファ
セウム（Enterococcus faecium) に対する抗菌活性を指
標として、抗菌性物質生産能を有する乳酸菌を選択し
た。乳酸菌の分離は以下の方法で実施した。各種の発酵
食品及びサイレージから採取した試料を０．５％の炭酸
カルシウムを含むLactobacilli MRS培地（組成：プロテ
オースペプトン１％、牛肉エキス１％、酵母エキス０．
５％、ブドウ糖２％、Tween 80 ０．１％、クエン酸ア
ンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫
酸マンガン０．００５％、リン酸二カリウム０．２％、
ディフコ社製）を用いて培養し、必要に応じて数回の継
代培養を行った後、Lactobacilli MRS寒天培地（組成：
上記の培地組成に寒天２％を添加したもの）に塗抹培養
し、生じたコロニーから乳酸菌を採取した。

【０００８】次に、このようにして分離した乳酸菌か
ら、エンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を
指標として、ペーパーディスク検定法（Hoover, D.G. &
Harlander, S.K., In Bacteriocins of lactic acid b
acteria, Academic Press 社刊、23-39 、1993) によっ
て抗菌性物質生産能を有する乳酸菌を選択した。選択し
た乳酸菌の菌学的性質を調べたところ、１６Ｓリボソー
ムＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列の相同性の解析（Mor
i, K. et al.:Int. J. Syst. Bacteriol., 47巻、54-57
、1997) によりエンテロコッカス・フェカリスＮＣＤ
Ｏ５８１株と９９．５％の相同性を示したこと、ＤＮＡ
−ＤＮＡハイブリダイゼーション法（Ezaki, T. et a
l.: J. Clin. Microbiol., 26 巻、1708-1713 、1988)
によりエンテロコッカス・フェカリスＮＣＤＯ５８１株
と７０％以上のハイブリッドを形成し、他の菌株とは７
０％以下のハイブリッドしか形成しないこと、糖質の発
酵性がエンテロコッカス・フェカリスＮＣＤＯ５８１株
の発酵性と一致したこと等の性質から、本菌はエンテロ
コッカス・フェカリスに属する菌株であることが分かっ
た。しかし、１６Ｓ ｒＤＮＡにおいて１００％のホモ
ロジーを示さず、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン法においても１００％のハイブリッドを形成しなかっ
たことから、公知菌とは明らかに異なる新規な菌株と認
め、本菌をエンテロコッカス・フェカリスＫ−４株と命
名した。本菌は、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託されており、その寄託番号はＦＥＲＭ
ＢＰ−７１６２である。

【０００９】次に、エンテロコッカス・フェカリスＫ−
４株をLactobacilli MRS培地（組成：前記の通り、ディ
フコ社製）を用いて所定の条件で培養し、抗菌性ペプチ
ドを生産するための最適条件について検討した。その結
果を図１及び図２に示した。図１は、本菌の増殖の程度
をＯＤ₆₀₀ で調べたものであり、３７〜４５℃の範囲で
は培養温度による差はなく、いずれも培養５時間程で十
分な生育が認められた。また、図２は、抗菌性ペプチド
の生産量をエンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌
活性を指標としたアガーウェル法によって調べた結果を
示しており、４３〜４５℃という高温で培養することに
より、多量の抗菌性ペプチドが生産されることが分かっ
た。また、培養時間については、８〜１２時間で抗菌性
ペプチドの生産量は最大値に達することが分かった。

【００１０】抗菌性ペプチド、エンテロシンＳＥ−Ｋ４
の取得を目的として、本菌を大量に培養する場合は、培
地としてＴＧＥ培地（組成：１リットルあたり牛肉抽出
物（ディフコ社製）６ｇ、トリプトン（ディフコ社製）
１０ｇ、グルコース（和光純薬社製）２ｇ）を用いるこ
とが好ましく、この培地を用いて４３〜４５℃で嫌気的
に１０〜１２時間培養する。

【００１１】次に、培養物から目的とするバクテリオシ
ンを採取し、精製する方法について説明する。エンテロ
コッカス・フェカリスＫ−４株の生産するバクテリオシ
ンの分離、精製は常法によって行うことができるが、酸
抽出法が好ましい方法である。図３はその１例を示した
ものである。すなわち、培養物にタンパク質分解酵素阻
害剤であるフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭ
ＳＦ）を最終濃度が１ｍＭとなるように添加した後、ｐ
Ｈを６に調整し、バクテリオシンを一旦、菌体に吸着さ
せる。次いで、必要に応じて培養物の温度を４℃まで冷
却して３０分間攪拌したのち、遠心分離を行って上清を
除去し、菌体を沈殿物として回収する。次に、沈殿物で
ある菌体を緩衝液、例えば２−（Ｎ−モルホリノ）エタ
ンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ６）で１〜５回、好まし
くは２〜３回洗浄する。

【００１２】その後、洗浄した菌体を１Ｍ 食塩と０．
１％ 界面活性剤（例えばBrij-35、半井社製) を含む
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ２）５０ｍＬに懸濁し、
必要に応じて懸濁液を４℃で１時間攪拌し、菌体に吸着
しているバクテリオシンを遊離させる。次に、遠心分離
を行ってバクテリオシンを含む上清を回収する。回収さ
れた上清を逆相シリカゲルカートリッジ（例えばSep-Pa
c C18 、ミリポア社製) を用いてバクテリオシンを濃縮
した後、例えば Sephasil Peptide C185μST（ファルマ
シア社製）を用いた逆相カラムクロマトグラフィーで活
性画分を分画する。該活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で泳動す
ると、分子量約５ｋＤａの単一バンドが検出された（図
４Ａ、Ｂ参照）。このことから抗菌性ペプチドは完全に
精製されていることが確認された。さらに、この単一バ
ンドを示すペプチドについて、アミノ酸シーケンサーを
用いてＮ末端のアミノ酸を決定した（配列表の配列番号
１参照）。配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を既
知のバクテリオシンのアミノ酸配列と比較した結果、新
規な構造を有することが判明したので、この抗菌性ペプ
チドをエンテロシンＳＥ−Ｋ４と命名した。

【００１３】このエンテロシンＳＥ−Ｋ４の抗菌スペク
トルを調べた結果、エンテロコッカス・ファセウムの他
に、食中毒の原因となるリステリア、モノサイトゲネ
ス、クロストリジウム・ベイジェリンキ及び醤油や味噌
の製造過程で有害なバチルス・ズブチリスを含むグラム
陽性菌に対しても生育阻害効果があることが判明した。
また、エンテロシンＳＥ−Ｋ４は、ｐＨ２〜１１という
広い範囲で抗菌活性は安定で、特にｐＨ６付近において
強い抗菌活性を有しており、１００℃で１０分間加熱し
た後も約５０％の活性を維持することから、熱安定性に
優れている。

【００１４】以上のように、エンテロシンＳＥ−Ｋ４
は、乳酸菌に由来し安全性が高く、食中毒菌に対しても
抗菌作用があり、比較的耐熱性も高いことから、食品保
存料として食品産業への応用が期待できる。

【００１５】

【実施例】以下に、本発明を実施例により説明するが、
本発明はこれらによって限定されるものではない。 実施例１ タイ国の発酵食品及びサイレージから採取した試料をLa
ctobacilli MRS培地（組成：前記の通り、ディフコ社
製）を用いて培養し、必要に応じて数回の継代培養を行
った後、Lactobacilli MRS寒天培地（組成：上記の培地
組成に寒天２％を添加したもの）に塗抹培養し、生じた
コロニーから乳酸菌を採取した。

【００１６】次に、このようにして分離した乳酸菌か
ら、エンテロコッカス・ファセウムに対する抗菌活性を
指標としてペーパーディスク検定法（Hoover, D.G. & H
arlander, S.K., In Bacteriocins of lactic acid bac
teria, Academic Press 社刊、23-39 、1993) によって
抗菌性物質生産能を有する乳酸菌を選択した。選択した
乳酸菌の菌学的性質を調べたところ、１６Ｓ ｒＤＮＡ
の塩基配列の相同性の解析（Mori, K. et al.:Int. J.
Syst. Bacteriol., 47巻、54-57 、1997) によりエンテ
ロコッカス・フェカリスＮＣＤＯ５８１株と９９．５％
の相同性を示したこと、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法（Ezaki, T. et al.: J. Clin. Microbiol.,
26 巻、1708-1713 、1988) によりエンテロコッカス・
フェカリスＮＣＤＯ５８１株と７０％以上のハイブリッ
ドを形成し、他の菌株とは７０％以下のハイブリッドし
か形成しないこと、糖質の発酵性がエンテロコッカス・
フェカリスＮＣＤＯ５８１株の発酵性（バイオメリエッ
クス社のAPI 好くリップを使用) と一致したこと等の性
質から、本菌はエンテロコッカス・フェカリスに属する
菌株であることが分かった。

【００１７】しかし、１６Ｓ ｒＤＮＡにおいて１００
％のホモロジーを示さず、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイ
ゼーション法においても１００％のハイブリッドを形成
しなかったことから、公知菌とは明らかに異なる新規な
菌株と認め、本菌をエンテロコッカス・フェカリスＫ−
４株と命名した。本菌の同定に関する知見を第１表に示
す。

【００１８】

【表１】第 １ 表

【００１９】実施例２ 実施例１において単離したエンテロコッカス・フェカリ
スＫ−４株（ＦＥＲＭＢＰ−７１６２）をLactobacilli
MRS培地（組成：前記の通り、ディフコ社製）に接種
し、３７〜４５℃で所定時間培養し、本菌の生育状態並
びに抗菌性ペプチドの生産性について調べた。結果を図
１、２に示す。図１は培養温度を変化させた場合の本菌
の増殖量をＯＤ₆₀₀ で測定した結果を示しており、生育
量は温度による影響を受けないことが分かる。また、図
２は抗菌性ペプチドの活性をエンテロコッカス・ファセ
ウムに対する抗菌活性を指標としたアガーウェル法によ
って調べた結果である。図から明らかなように、培養温
度が高いときに抗菌活性が強く、４３〜４５℃で培養し
たときに最大の生産量が得られることを示している。培
養時間は、８〜１２時間程度が適当であることも分かっ
た。図中、○は３７℃、△は４０℃、▲は４３℃、●は
４５℃での結果を表している。

【００２０】実施例３ エンテロコッカス・フェカリスＫ−４株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７１６２）を、ＴＧＥ培地（１Ｌあたり牛肉抽出物
（ディフコ社製）６ｇ、トリプトン（ディフコ社製）１
０ｇ、ブドウ糖（和光純薬社製）２ｇ含有）３Ｌに接種
し、４３℃で１０時間培養し、大量の本菌を得た。得ら
れた培養物にＰＭＳＦを最終濃度が１ｍＭとなるように
添加した後、培養液のｐＨを６に調整し、さらに培養液
を４℃まで冷却し、３０分間攪拌して生成した抗菌性物
質を菌体に吸着させた。次に、遠心分離（１００００×
ｇ、２０分間）を行って上清を除去し、抗菌性物質を吸
着した菌体を沈殿物として回収した。この沈殿物を５０
ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）で洗浄した。

【００２１】次に、洗浄した菌体を１Ｍの食塩と０．１
％の界面活性剤（商品名：Brij‐35、半井社製）を含む
５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ２）５０ｍＬに懸濁し、
４℃に冷却して１時間攪拌した。このようにして、菌体
から抗菌性物質を抽出した後、遠心分離（２００００×
ｇ、２５分間）を行い、該物質を含む上清を回収した。
回収した上清を、Sep-Pak C18 カラム（アマシャム社
製）で濃縮した後、Sephasil Peptide C185 μST（ファ
ルマシア社製）を用いた逆相カラムクロマトグラフィー
で活性画分を分画した。さらに、該活性画分をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド濃度１５％）で電気泳動
し、分子量約５ｋＤａの単一のバンドを得た。図４Ａ、
Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真である。

【００２２】図４から明らかなように、銀染色（Ａ）及
び活性染色（Ｂ）のいずれの場合においても、分子量約
５ｋＤａの単一バンドが検出された。この単一のバンド
のアミノ酸配列を決定し、既知のバクテリオシンとのホ
モロジーを比較した結果、抗菌性ペプチドは新規な構造
を有することが判明し、これをエンテロシンＳＥ−Ｋ４
と命名した。また、この抗菌性ペプチドの有する保存ア
ミノ酸配列から、この抗菌性ペプチドはKlaenhammer の
示したバクテリオシンの分類（Klaenhammer,T.R.: FEMS
Microbiol. Rev., 12巻、39-86 、1993) における低分
子量・耐熱性クラス（クラスIIa ）に属することも判明
した。さらに、アミノ酸シーケンサー（ヒューレットパ
ッカード社製）を用いて、精製した抗菌性ペプチドのア
ミノ酸配列を決定した（配列表の配列番号１参照）。ま
た、抗菌性ペプチドの各精製段階でのタンパク質濃度、
抗菌活性等の測定結果を第２表に示す。

【００２３】

【表２】第 ２ 表 (*) 逆相クロマトグラフィー後

【００２４】実施例４ エンテロシンＳＥ−Ｋ４を各種ｐＨの緩衝液に溶解し、
３７℃で３０分間保温した後、ｐＨを６．０に戻し、ｐ
Ｈ安定性を調べた。結果を図５に示す。図から明らかな
ように、この抗菌性物質は、ｐＨ６のとき最大の活性を
示し、ｐＨ３〜１１のときは６０％以上の活性を保って
いる。このように、エンテロシンＳＥ−Ｋ４は、広いｐ
Ｈ範囲で安定性を有することが明らかとなった。

【００２５】実施例５ 精製したエンテロシンＳＥ−Ｋ４の温度安定性を調べる
ため、この抗菌性物質をＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に
溶解し、これを１００℃に加熱した後の残存抗菌活性を
測定した。図６は、その結果を示しており、１００℃で
１０分間加熱した後も、約５０％の抗菌活性を維持して
いることが分かった。

【００２６】実施例６ エンテロシンＳＥ−Ｋ４の各種微生物に対する抗菌効果
を寒天スポット法（Van Reenen, C.A. et al.: J. App
l. Microbiol., 65巻、1131-1137 、1998) により調べ
た。すなわち、被検菌に適した培地と培養条件を選定
し、被検菌を含む寒天培地に、１０〜１０³ ＡＵの活性
を有する精製エンテロシンＳＥ−Ｋ４を直接スポットし
た。７ｍｍ以上の阻害斑を形成した場合に、感受性と評
価した。測定結果と被検菌の培養条件を第３表に示す。
なお、試験に用いた培地の組成は以下の通りである。

【００２７】ＬＢ培地：酵母エキス０．５％、トリプト
ン１％、食塩１％（ディフコ社製） ＴＹＡ培地：ブドウ糖４％、リン酸一カリウム０．０５
％、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％、硫酸鉄７水
和物０．００１％、酢酸アンモニウム０．３％、酵母エ
キス０．２％、トリプトン０．６％ ＭＲＳ培地：プロテオースペプトン１％、牛肉エキス１
％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖２％、Tween 80
０．１％、クエン酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネ
シウム０．０１％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸
二カリウム０．２％、寒天２％（ディフコ社製） Ｍ１７培地：トリプトン０．５％、ソイトン０．５％、
肉消化物０．５％、酵母消化物０．２５％、アスコルビ
ン酸０．０５％、硫酸マグネシウム０．０２５％、β−
グリセロリン酸二ナトリウム１．９％、乳糖０．５％
（ディフコ社製） ＬＳＡ培地：コロンビア血液基礎培地３．９％、エスク
リン０．１％、クエン酸アンモニウム鉄０．０５％、塩
化リチウム０．１５％（オキソイド社製） ＮＢ培地：牛肉エキス０．３％、ペプトン０．５％（デ
ィフコ社製）

【００２８】

【表３】第 ３ 表

【００２９】表から明らかなように、食中毒等の原因と
なるリステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム
・ベイジェリンキ及び醤油、味噌の製造過程で有害であ
るバチルス・ズブチリスを含むグラム陽性細菌に対して
エンテロシンＳＥ−Ｋ４は生育阻害効果があることが明
らかとなった。バチルス・ズブチリスについてのみ温度
による感受性の違いが見られた。さらに、表から明らか
なように、乳酸発酵に有用なラクトバチルス属を除く、
他のグラム陽性細菌に対して効果があった。

【００３０】

【発明の効果】本発明のエンテロシンＳＥ−Ｋ４は、耐
熱性に優れた抗菌性ペプチドであり、食中毒菌をはじめ
様々な細菌に対して抗菌スペクトルを示す。そのため、
この抗菌性物質を食品等に添加することによって、雑菌
等の生育を阻害し、食品の腐敗や品質の低下を有効に防
止することができる。また、この抗菌性物質は、乳酸菌
に由来しており、しかも人体内で容易に分解されるた
め、従来の化学合成された食品保存料と比べ、大量に摂
取しても安全性の上で心配がなく、健康面から好ましい
ものである。本発明の抗菌性物質は、今回単離された乳
酸菌を用いて発酵法により効率よく製造することができ
る。

【００３１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 農林水産省食品総合研究所長 鈴木 建夫 <120> 新規バクテリオシン及びその製造方法 <130> P121123K <160> 1 <210> 1 <211> 45 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 1 Ala Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Cys Asn Lys Gln Lys Cys Trp 5 10 15 Val Asp Trp Ser Arg Ala Arg Ser Glu lle lle Asp Arg Gly Val Lys 20 25 30 Ala Tyr Val Asn Gly Phe Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly 35 40 45

【図面の簡単な説明】

【図１】 エンテロコッカス・フェカリスＫ−４株の増
殖に及ぼす培養温度の影響を示すグラフである。

【図２】 エンテロシンＳＥ−Ｋ４の生産量に及ぼす培
養温度の影響を示すグラフである。

【図３】 エンテロシンＳＥ−Ｋ４の精製手順の流れ図
である。

【図４】 エンテロシンＳＥ−Ｋ４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動写真で、Ａは銀染色法の、Ｂは活性染色法の結
果を示す。

【図５】 エンテロシンＳＥ−Ｋ４のｐＨ安定性を示す
グラフである。

【図６】 エンテロシンＳＥ−Ｋ４の熱安定性を示すグ
ラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 大桃 定洋 茨城県稲敷郡阿見町荒川沖953番地502号 (72)発明者 緒方 靖哉 福岡県福岡市美和台２丁目18番４号 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/315 A23L 3/3526 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有する新規バクテリオシ
   ン、エンテロシンＳＥ−Ｋ４。 （ａ）分子量：約５ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
   ド電気泳動法による） （ｂ）エンテロコッカス・ファセウムに対し抗菌活性を
   有する （ｃ）耐熱性を有する （ｄ）食中毒菌に対し抗菌作用がある （ｅ）Ｎ末端アミノ酸配列：配列表の配列番号１記載の
   配列を有する
2. 【請求項２】 エンテロコッカス・フェカリスＫ−４株
   （ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６２）を培養し、培養物から請
   求項１記載の新規バクテリオシン、エンテロシンＳＥ−
   Ｋ４を採取することを特徴とする新規バクテリオシン、
   エンテロシンＳＥ−Ｋ４の製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１記載の新規バクテリオシン、エ
   ンテロシンＳＥ−Ｋ４の生産能を有するエンテロコッカ
   ス・フェカリスＫ−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１６
   ２）。