CN103275949A

CN103275949A - 一种群体感应淬灭酶olb-26及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103275949A
Application number: CN2013101985260A
Authority: CN
Inventors: 周志刚; 张美超; 杨雅麟; 徐俐; 何夙旭; 李青; 余强
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2013-09-04

Abstract

本发明公开了一种群体感应淬灭酶OLB-26及其编码基因和应用。所述蛋白质OLB-26为融合蛋白，是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有群体感应淬灭酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的融合蛋白OLB-26，具有底物特异性，可降解长链和短链的N-酰基高丝氨酸内酯，其作为淬灭酶的比活力为7.59U/mg，在pH范围为6.0-8.0间都很稳定，可保持80%以上的酶活；热稳定性较好，在50℃保温20min的相对酶活仍为100%。本发明所提供的融合蛋白OLB-26可用于制备新型生防酶制剂。

Description

一种群体感应淬灭酶OLB-26及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种群体感应淬灭酶OLB-26及其编码基因和应用。

背景技术

N-乙酰高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）是一类广泛存在于革兰氏阴性细菌中调控群体感应系统中的信号分子。这些信号分子是由病原菌本身产生，可自由穿透细菌的细胞壁和细胞膜，同时参与许多病原菌致病基因的表达调控，当信号分子浓度达到一定阈值时，就可启动病原菌致病基因的表达。群体感应淬灭酶（Quroum quenching，QQ）是一类具有降解信号分子作用的非分泌性蛋白，这类蛋白通过水解进入胞内的AHLs分子的内酯键，降低其浓度，使致病基因不能表达，从而阻止了病原菌对生物的侵染。

群体感应淬灭酶根据水解AHLs的位点不同分为乙酰基高丝氨酸内酯酶和乙酰基高丝氨酸酰基转移酶，研究表明，前者相对更适合降解短链的信号分子，后者相对更适合降解长链的信号分子。目前，尚未见同时具有这两种淬灭酶性能的蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种群体感应淬灭酶OLB-26及其编码基因和应用。

本发明所提供的OLB-26蛋白质为融合蛋白，是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有群体感应淬灭酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）或（b）中的OLB-26蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基数	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述OLB-26蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述OLB-26蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2的第7—1578位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述蛋白质的基因（即olb-26基因）也属于本发明保护的范围。

所述基因为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列2的第7—1578位核苷酸所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有群体感应淬灭酶活性蛋白的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有群体感应淬灭酶活性蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；所述大肠杆菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)；所述重组菌具体可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)OLB-26，已于2013年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7538。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明保护所述蛋白在降解N-酰基高丝氨酸内酯或制备具群体感应淬灭酶活性产品中的应用。

在上述应用中，所述N-酰基高丝氨酸内酯为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-oxo-C12-HSL和3-H-C12-HSL中的至少一种。

在上述应用中，所述降解的pH值为6.0—8.0，或6.0—6.5，或6.5—7.0，或7.0—7.5，或7.5—8.0。

在上述应用中，所述降解的温度为10—50℃，或20—40℃，或20—25℃，或25—40℃，或35—40℃，或30—35℃。

实验证明，本发明所提供的融合蛋白OLB-26，可降解长链或短链的N-酰基高丝氨酸内酯，其作为淬灭酶的比活力为7.59U/mg，在pH范围为6.0-8.0间都很稳定，可保持80%以上的酶活；热稳定性较好，在50℃保温20min的相对酶活仍为100%。本发明所提供的融合蛋白OLB-26可用于制备新型生防酶制剂。

附图说明

图1为重组菌诱导、表达和纯化过程中产物的SDS-PAGE图。

图2为融合蛋白OLB-26作为群体感应淬灭酶在不同pH下的相对酶活力。

图3为融合蛋白OLB-26经不同pH值处理后作为群体感应淬灭酶的相对酶活力。

图4为融合蛋白OLB-26作为群体感应淬灭酶在不同反应温度下的相对酶活力。

图5为融合蛋白OLB-26经50℃保温处理不同时间后作为群体感应淬灭酶的相对酶活力。

图6为融合蛋白OLB-26在经不同蛋白酶处理后作为群体感应淬灭酶的相对酶活力。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法（Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler,Gene Transferand Expression:A Laboratory Manual(1990)；Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等人编,1994）。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的培养基，如无特殊说明，溶剂均为水。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。

下述实施例中所用的胰蛋白酶(Trypsin)、α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)和蛋白酶K(Proteinase K)均为Sigma公司产品。

N-butyryl-L-homoserine lactone(N-丁酰-L-高丝氨酸内酯，C4-HSL)和N-Hexanoyl-L-homoserine lactone(N-己酰-L-高丝氨酸内酯，C6-HSL)购自Fluka公司；

N-heptanoyl-L-homoserine lactone（N-庚酰-L-高丝氨酸内酯，C7-HSL）、

N-Octanoyl-L-homoserine lactone(N-辛酰-L-高丝氨酸内酯，C8-HSL)、

N-decanoyl-L-homoserine lactone(N-癸酰-L-高丝氨酸内酯，C10-HSL)、

N-(3-oxo-hexanoyl)-L-homoserine lactone(N-3-氧-己酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C6-HSL)、

N-(3-oxo-octanoyl)-L-homoserine lactone(N-3-氧-辛酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C8-HSL)、

N-(3-oxo-decanoyl)-L-homoserine lactone（N-3-氧-癸酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C10-HSL）、

N-（3-oxo-dodecanoyl）-L-homoserine lactone(N-3-氧-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯，3-oxo-C12-HSL)、

和N-(3-hydroxy)-dodecanoyl-homoserine lactone(N-3-氢-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯，3-hydroxy-C12-HSL)均为Sigma(USA)产品。

LB液体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。

ATMM盐溶液：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：KH₂PO₄0.079mol/L，NaOH0.044mol/L，(NH₄)₂SO₄0.015mol/L，MgSO₄·7H₂O0.6mmol/L，CaCl₂0.06mmol/L，FeSO₄·7H₂O0.027mmol/L，MnSO₄·H₂O0.007mmol/L。

葡萄糖基础培养基：葡萄糖0.75g,琼脂粉3g,超纯水138g,灭菌冷却后加入ATMM盐溶液15mL，X-gal溶液(溶剂为NN-二甲基甲酰胺，溶质为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，溶质的浓度是20mg/mL)200μL。

下述实施例中如无特别说明，淬灭酶酶活力的测定方法如下：

1）将信号分子（群体感应淬灭酶的一种底物，可使指示菌根癌农杆菌KYC55落显示为蓝色）溶于无水乙醇中，使其终浓度为4.5mmol/L（母液）。

2）将20μL待测溶液、180μL缓冲液和1μL母液混合摇匀，30℃温育30min后，加入50μL10%的SDS水溶液终止反应，得到反应液；将20μL待测溶液、180μL缓冲液、1μL母液和50uL10%的SDS水溶液混合摇匀，30℃温育30min，作为对照液。

3）用琼脂平板扩散法检测反应液的淬灭酶酶活，具体如下：

制备琼脂条：将葡萄糖基础培养基倒入直径为18cm的大平板中，凝固后，按照方格纸的线条用无菌小刀将培养基切成间隔4mm的20个长方形细条（8mm×6cm）；在每个细条的前8mm处用直径为6mm的无菌打孔器压成圈环，之后每隔4mm用无菌牙签接入KYC55指示菌，再将反应液（或对照液）10μL加入到打孔的圈环中，待渗入培养基后，用封口膜封好放入30℃温箱，培养24h后观察结果，计数变蓝的点，换算成距离即扩散距离（mm），根据已制好的标准曲线计算酶活。

标准曲线制备：用无水乙醇将信号分子稀释成系列的浓度梯度，并等体积加入上述琼脂条的加样圈内，每个稀释度设定三个平行，平板置于30℃培养24h。计数变蓝的点，换算成距离，即扩散距离（mm），分析信号分子物质的量（nmol/L）与扩散距离（mm）的关系，构建标准曲线。

U=[6.52×(1.4163^Rck-1.4163^Rs)×50]/（30×10⁶）；

Rck：对照液样品的扩散距离(mm)。Rs：反应液样品的扩散距离(mm)。

酶活单位(U)的定义：在30℃，pH8.0条件下，每分钟降解1nmol信号分子所需要的酶量定义为一个酶活单位。

根癌农杆菌KYC55（Agrobacterium tumefaciens Strain KYC55）：文献：Cho,K.,C.Fuqua,and S.C.Winans.Transcriptional regulation and locations ofAgrobacterium tumefaciens genes required for complete catabolism of octopine.J.Bacteriol.1997，179:1-8.公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。

实施例1、融合蛋白OLB-26的制备

一、融合基因olb-26的制备

1、AiiO-AIO6淬灭酶基因片段的制备

①人工合成序列表的序列2自5’末端第7至810位核苷酸所示的淬灭酶基因aiiO-AIO6。

②以步骤①合成的基因为模板，用A6-F（下划线标注EcoRⅠ酶切识别序列）和L2-Raiia-AIO6(字符底纹标注Link序列)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。

A6-F：5′-CGGAATTCAAATCCCATGAAATCGAGACCAGTC-3′；

L2-Raiia-AIO6：5′-GCTACCGCCGCCACCGGCCGTGCAGTCGCGCATGAAA-3′。

PCR扩增所用的酶为LA Taq(Takara，Japan)。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

④回收PCR产物。

2、AiiA-AI96淬灭酶基因的制备

①人工合成序列表的序列2自5’末端第829至1578位核苷酸所示的淬灭酶基因aiiA-AI96。

②以步骤①合成的基因为模板，用L2-Faiia-AI96(字符底纹标注Link序列)和AI96aiia-ER（下划线标注NotⅠ酶切位点）组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物。

L2-Faiia-AI96：5′-GGTGGCGGCGGTAGCATGACCGTTAAAAAAC-3′；

AI96aiia-ER：5′-ATTGCGGCCGCTTATAAAAATTCAGGAAATG-3′。

PCR扩增所用的酶为LA Taq(Takara，Japan)。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。

④回收PCR产物。

3、融合基因olb-26的制备

同时以步骤1回收的PCR产物（aiiO-AIO6）和步骤2回收的PCR产物（aiiA-AI96）为模板，用A6-F和AI96aiia-ER组成的引物对进行重叠PCR，将得到的PCR产物中1.6kb的片段回收纯化。将该片段与pEASY-T3载体（购自北京全式金生物公司）连接后进行测序，结果表明，该片段的核苷酸序列如序列表的序列2所示。序列2的第7—1578位所示DNA编码序列1所示的融合蛋白OLB-26。序列2的第7至1578位核苷酸所示基因为融合基因olb-26，其中，第7—810位核苷酸为淬灭酶aiiO-AIO6基因，第811—828位核苷酸为连接肽基因，第829—1578位核苷酸为淬灭酶aiiA-AI96基因。

重叠PCR扩增所用的酶为LA Taq(Takara，Japan)。PCR扩增条件：95℃5min；94℃30s，60℃到50℃(前10个循环中，每循环降低1℃，剩余循环保持在55℃)30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

二、重组质粒和重组菌的获得

1、重组质粒的获得

（1）用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切融合基因olb-26，回收酶切产物。

（2）用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切质粒pET28a（购自Invitrogen公司），回收载体骨架。

（3）将步骤（1）的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，得到连接产物。

（4）将连接产物进行测序，结果表明得到了重组质粒pET28a/olb-26（在pET28a的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点间插入了序列表序列2的第7—1578位核苷酸所示的融合基因）。

2、重组菌及对照菌的获得

用重组质粒pET28a(+)/olb-26热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET28a(+)/olb-26的重组菌。

将上述重组菌中的一株命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)OLB-26，并于2013年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.7538。将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)OLB-26CGMCC No.7538简称重组菌OLB-26。

用载体pET-28a(+)热击转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，得到对照菌。

三、重组菌和对照菌的诱导、表达

1、将重组菌OLB-26接种于3mL LB液体培养基（含50μg/mL的卡那霉素）中，37℃振荡培养过夜，得到过夜培养液。

2、取100μL过夜培养液接种至20mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃振荡培养2-3h（OD₆₀₀达到0.6-0.8），然后加入终浓度1mol/L的IPTG，震荡培养（20℃、180rpm、旋转半径1.3cm）12h，得到诱导培养液。

3、将步骤2得到的诱导培养液12,000rpm离心5min（离心半径6cm），收集细胞沉淀。

4、将步骤3得到的细胞沉淀用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）重悬，超声破碎后12,000rpm离心10min（离心半径6cm），收集上清，获得目的蛋白液。

将对照菌按照步骤1—4的方法进行培养和处理，最后收集的上清液为对照蛋白液。

四、融合蛋白OLB-26的纯化和鉴定

1、将步骤三得到的目的蛋白液进行亲和层析纯化，使用层析柱（Ni-NTA Agarose，Cat.N0.30210,购于QIAGEN公司）的内径为1.4cm，长度为1cm，体积为1.5cm³，使用的洗脱缓冲液（pH均为7.6，溶剂均为水）的溶质及其浓度如下：

NTA-0：含20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-20：含20mmol/L Tris-HCl，20mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-40：含20mmol/L Tris-HCl，40mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-60：含20mmol/L Tris-HCl，60mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油；

NTA-80：含20mmol/L Tris-HCl，80mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl和10g/100mL甘油。

洗脱过程如下：

（1）将层析柱用10-20mL水平衡，每次加5mL待流净后再加，以后皆同；

（2）用洗脱缓冲液NTA-0平衡15-20mL，然后上样5mL步骤三得到的目的蛋白液；

（3）依次用5mL NTA-20、5mL NTA-40和5mL NTA-60进行洗脱，以去除杂蛋白；

（4）用5mL NTA-80洗脱目的蛋白，收集过柱后的溶液，即为纯化的OLB-26蛋白液。

将对照蛋白液按照步骤1的方法进行纯化，得到纯化的对照蛋白液。

2、SDS-PAGE鉴定

将重组菌诱导、表达和纯化过程中的产物进行SDS-PAGE（12%的分离胶、5%的浓缩胶），结果如图1所示，其中，泳道M为低分子量蛋白质Marker，泳道1-5为步骤1获得的纯化的OLB-26蛋白液，泳道6-7为步骤1获得的纯化的对照蛋白液，泳道8为步骤三获得的未经纯化的对照蛋白液，泳道9为步骤三获得的未经纯化的目的蛋白液。

结果表明，重组菌经诱导表达所获得的目的蛋白液经亲和层析纯化后得到电泳纯的单一条带，分子量约为57.7kDa（与预测分子量相近）；对照菌没有得到目标大小的蛋白。

3、酶活鉴定

将步骤1获得的纯化的OLB-26蛋白液作为待测溶液（待测溶液中蛋白含量为0.49mg/mL,检测蛋白含量的试剂盒购自上海沪宇生物有限公司，产品目录编号为6104-58-1）检测淬灭酶活性。信号分子为3-oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。

结果：步骤1获得的纯化的OLB-26蛋白液的淬灭酶活力为3.72U/mL。按照同样的方法检测步骤1获得的纯化的对照蛋白液的淬灭酶活力为0U/mL。

实施例2、融合蛋白OLB-26的作为群体感应淬灭酶的性质鉴定

一、最适pH

将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）作为待测溶液，检测35℃时不同的pH条件下的淬灭酶活性，以测定其最适pH。

酶活测定时信号分子为3-oxo-C8-HSL，分别采用以下几种缓冲液：

pH5.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液（McIlvaine）；

pH6.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；

pH6.0、0.1mol/L的PBS缓冲液（PBS）；

pH6.5、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH7.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH7.5、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH8.0、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液（Tris-HCl）；

pH9.0、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液；

pH9.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液（NaOH-Gly）；

pH10.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；

pH11.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。

将采用0.1mol/L PBS缓冲液（pH8.0）时待测溶液的酶活记为100%（酶活值为3.72U/mL），计算采用其它各种不同pH值不同缓冲液的相对酶活力（%）。

结果如图2所示，采用McIlvaine缓冲液，pH5.0时的相对酶活为0%，pH6.0时的相对酶活为87.65%。采用PBS缓冲液，pH6.0时的相对酶活为75.18%，pH6.5时的相对酶活为98.50%，pH7.0时的相对酶活为99.89%，pH7.5时的相对酶活为99.96%，pH8.0时的相对酶活为100%。采用Tris-HCl缓冲液，pH8.0时的相对酶活为48.65%，pH9.0时的相对酶活为9.31%。采用甘氨酸-NaOH缓冲液，pH9.0时的相对酶活为4.24%，pH10.0时的相对酶活为0.01%，pH11.0时的相对酶活为0%。

结果表明，融合蛋白OLB-26作为群体感应淬灭酶的最适pH为8.0，采用PBS缓冲液在pH6.5-8.0保持80％以上的相对酶活性。

二、pH稳定性

将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液用10kD超滤管超滤浓缩后分别在如下缓冲液中30℃处理1h：

pH3.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；

pH4.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；

pH5.0、0.1mol/L的McIlvaine缓冲液；

pH6.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH6.5、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH7.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH7.5、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液；

pH9.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；

pH10.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；

pH11.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液；

pH12.0、0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。

将处理后的溶液作为待测溶液（蛋白浓度为0.49mg/mL），检测35℃下淬灭酶酶活力，信号分子为3-oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液。

将pH为8.0、30℃处理1h后待测溶液的酶活记为100%，此时的酶活值为3.72U/mL，计算采用其它各种不同pH的缓冲液的相对酶活力（%）。

结果如图3所示，pH3.0时的相对酶活为75.18%、pH4.0时的相对酶活为75.18%、pH5.0时的相对酶活为75.18%、pH6.0时的相对酶活为99.85%、pH6.5时的相对酶活为99.92%、pH7.0时的相对酶活为99.96%、pH7.5时的相对酶活为100%、pH8.0时的相对酶活为100%、pH9.0时的相对酶活为99.98%、pH10.0时的相对酶活为99.73%、pH11.0时的相对酶活为98.82%。

结果表明：融合蛋白OLB-26作为群体感应淬灭酶在pH范围为6.0-11.0间都很稳定，保持80%以上的酶活。

三、最适温度

将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）作为待测溶液，检测不同温度下的淬灭酶酶活力，以测定其最适温度。

酶活测定时信号分子为3-oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液。温度分别为0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃和60℃。

将温度为35℃时待测溶液的酶活记为100%，此时的酶活值为3.72U/mL，计算采用其它不同温度的相对酶活力（%）。

结果：如图4所示。0℃时的相对酶活为0%、10℃时的相对酶活为7.74%、20℃时的相对酶活为70.39%、25℃时的相对酶活为70.53%、30℃时的相对酶活为99.96%、35℃时的相对酶活为100%、40℃时的相对酶活为70.53%、50℃时的相对酶活为9.23%、60℃时的相对酶活为0%。

结果表明：融合蛋白OLB-26作为群体感应淬灭酶的最适作用温度为35℃。

四、温度稳定性

将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）在50℃下分别保温0、2、5、10、15、20、30、60min后作为待测溶液测定35℃下淬灭酶酶活力。信号分子为3-oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液。

将经50℃保温0min的待测溶液的酶活记为100%，此时的酶活值为3.72U/mL，计算采用其它50℃保温不同时间的相对酶活力（%）。

结果如图5所示，保温2min的相对酶活为100.00%、保温5min的相对酶活为99.90%，保温10min的相对酶活为99.71%，保温15min的相对酶活为99.49%、保温20min的相对酶活为98.56%、保温30min的相对酶活为58.65%、保温60min的相对酶活为0%。

结果表明：融合蛋白OLB-26作为群体感应淬灭酶的热稳定好，经50℃保温20min的相对酶活为98.56%，保温30min后的相对酶活为58%。

五、不同的金属离子或化学试剂对酶活的影响

将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）作为待测溶液，取20μL与180μL缓冲液（pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液）和1μL母液（信号分子为3-oxo-C8-HSL的无水乙醇溶液，浓度为4.5mmol/L）混合摇匀，分别加入不同的金属离子或化学试剂（K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Li⁺、Co⁺、Cr³⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Pb⁺、EDTA、巯基乙醇或SDS；终浓度为1mmol/L或10mmol/L），35℃温育30min后，加入50uL10%SDS水溶液终止反应，得到反应液；将20μL待测溶液、180μL缓冲液和1μL母液混合摇匀，35℃温育30min后，加入50uL10%SDS水溶液终止反应，作为对照液；用琼脂平板扩散法检测反应液，计算淬灭酶酶活力。

将不加上述金属离子及化学试剂的处理的酶活记为100%，此时的酶活值为3.72U/mL，计算其它各个加入不同金属离子或化学试剂处理的相对酶活力（%），结果见表2。

表2加入金属离子及化学试剂后的相对酶活力（%）

化学试剂	1mmol/L	10mmol/L	化学试剂	1mmol/L	10mmol/L
						Na⁺	99.10	99.63	Mn²⁺	99.95	99.86

K⁺	99.77	99.77	Zn²⁺	99.95	100.00
						Ca²⁺	99.95	98.77	Pb⁺	99.86	99.82
Li⁺	98.10	98.86	SDS	0.00	0.00
						Co²⁺	99.96	99.89	Ag⁺	0.00	0.00
Cr³⁺	99.77	99.63	EDTA	99.96	99.91
						Ni⁺	99.91	99.91	β-巯基乙醇	99.82	99.89
Cu²⁺	98.45	98.49	Fe³⁺	99.89	99.89
						Mg²⁺	99.71	99.82	CK	100.00	100.00

结果表明：SDS和Ag⁺对融合蛋白OLB-26的酶活具有抑制作用，其余离子或化学试剂对酶活没有显著影响。

六、融合蛋白OLB-26作为群体感应淬灭酶对蛋白酶的抗性

用pH7.00.1mol/L Tris-HCl将胰蛋白酶配成1mg/mL的溶液（溶液A）；

用pH7.00.1mol/L Tris-HCl将α-糜蛋白酶配成1mg/mL的溶液（溶液B）；

用pH7.50.1mol/L Tris-HCl将蛋白酶K配成1mg/mL的溶液（溶液C）；

将10体积份实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）与1体积份蛋白酶溶液（溶液A、溶液B或溶液C）混合不同时间（0、10、20、30或60min）后取样，作为待测溶液检测淬灭酶酶活力。检测信号分子为3-oxo-C8-HSL，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。

将0min时刻待测溶液的酶活力作为100%，其它各个时刻待测溶液的酶活力与0min时刻待测溶液的酶活力的比值作为该体系的相对酶活力（%），结果见图6。

结果表明：用不同蛋白酶处理60min后融合蛋白OLB-26的酶活分别为99.86%(胰蛋白酶),99.56%(糜蛋白酶),50.17%(蛋白酶K)。由此可以看出融合蛋白OLB-26对多种中性蛋白酶都具有较强的抗性。

七、融合蛋白OLB-26作为淬灭酶的底物特异性

分别用C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、C10-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C10-HSL、3-oxo-C12-HSL和3-H-C12-HSL作为信号分子，将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）作为待测溶液，检测淬灭酶酶活力。缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃。

结果如下：C6-HSL作为信号分子的酶活为4.48U/mL、C7-HSL作为信号分子的酶活为13.12U/mL、C8-HSL作为信号分子的酶活为4.78U/mL、C10-HSL作为信号分子的酶活为100.41U/mL、3-oxo-C6-HSL作为信号分子的酶活为6.75U/mL、3-oxo-C8-HSL作为信号分子的酶活为4.64U/mL、3-oxo-C10-HSL作为信号分子的酶活为11.60U/mL、3-oxo-C12-HSL作为信号分子的酶活为0.44U/mL、3-H-C12-HSL作为信号分子的酶活为13.37U/mL。另外，融合蛋白OLB-26对C4-HSL（0.02U/mL）也具有一定的降解作用。

上述结果表明：融合蛋白OLB-26作为淬灭酶可降解长链的N-乙酰高丝氨酸内酯和短链的N-乙酰高丝氨酸内酯。

实施例3、融合蛋白OLB-26作为淬灭酶的动力学常数测定

1、将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）作为待测溶液，检测淬灭酶酶活力，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃，信号分子为3-oxo-C8-HSL，在反应体系中的终浓度为18μmol/L，在反应1、2、3、5、10、15、20、30min时终止酶活反应。

通过计算酶活性与反应时间的比值大小，如该酶在某个时间段内比值不变时，则在该时间段内的酶促反应为一级反应，来确定此时间内为测K_m和V_max的反应最佳时间。

根据确定的一级反应时间，测定融合蛋白OLB-26的K_m值及V_max的反应时间为10min。

2、将实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液（蛋白浓度为0.49mg/mL）作为待测溶液，检测淬灭酶酶活力，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃，信号分子为3-oxo-C8-HSL，在反应体系中的终浓度分别为180μmol/L，90μmol/L，18μmol/L，9μmol/L，5.4μmol/L，1.8μmol/L，0.9μmol/L，0.54μmol/L，0.18μmol/L，0.09μmol/L，反应时间为步骤1确定的反应时间（即10min）。

通过上述不同的底物浓度[S]测定相对应的反应速度V，求出两者的倒数，以1/V对1/[S]作图，即采用米氏方程双倒数方法（方程如下）求得K_m值及V_max：

\frac{1}{v} = \frac{K_{m}}{V_{\max}} \times \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}}

结果：融合蛋白OLB-26降解信号分子3-oxo-C8-HSL的Vmax=75.0nmol/(mg·min)，Km=0.0037mmol/L。

实施例4、融合蛋白OLB-26作为淬灭酶的的比活力测定

比活力单位的定义为：每毫克酶蛋白所含的酶活力单位。

方法：实施例1步骤四中1制备的纯化的OLB-26蛋白液作为待测溶液，检测淬灭酶酶活力，缓冲液为pH8.0、0.1mol/L的PBS缓冲液，反应温度为35℃，信号分子为3-oxo-C8-HSL；通过考马斯亮蓝法（G-250）试剂测定OLB-26蛋白液中的蛋白浓度为0.49mg/mL。酶活与蛋白浓度的比值即为融合蛋白OLB-26的比活力。

结果：以信号分子3-oxo-C8-HSL为底物计算得到融合蛋白OLB-26的比活力是7.59U/mg。