CN110684692B - 一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780，其保藏编号为CCTCC NO：M2019784；本发明还提供了该株嗜麦芽糖窄食单胞菌780的应用；利用该菌株生产的低温蛋白酶可用于环境污染物5‑烯醇式丙酮酸莽草酸‑3‑磷酸合成酶的降解，表明该菌株具有改善土壤、保护环境等方面的潜力。该嗜麦芽糖窄食单胞菌780所产生的蛋白酶的最适温度为65℃，其在18℃时能达到最适温度下活力的40％，4℃时蛋白酶能保持在最适温度下活力的20％左右。由于环境中污染物CP4‑EPSPS的存在条件较广，嗜麦芽糖窄食单胞菌780所诱导生产的低温蛋白酶适用于不同环境条件下降解EPSPS，在环境治理中具有很好的应用前景。

Description

一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780及其应用
技术领域
本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780及其筛选方法与应用。
背景技术
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，是酶学研究中较早也是最深入的酶之一。蛋白酶按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的单元。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶主要是内肽酶。本世纪初，已经报导的微生物蛋白酶估计超过900种，蛋白酶与人类密切相关，涉及到生活的各个方面，在全球酶制剂市场中蛋白酶的销售额达60％。
烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(简称为EPSPS)在不同的生物体内广泛存在，该蛋白可以分解农药草甘膦。草甘膦是一种在家庭、农业以及基础设施建设中都广泛应用的除草剂，杂草对其抗性相对较差使其得以广泛使用，至2005年全世界销售草甘膦总值已达到20亿美元。EPSPS蛋白的抗除草剂作用在于其可以与草甘膦结合，消除了草甘膦对植物氮代谢的影响。有报道显示根癌农杆菌(agrobacterium sp.)cp4菌株中的EPSPS(简称为CP4-EPSPS)具有对高浓度草甘膦的优异抗性，因此该基因被应用于开发抗草甘膦的转基因作物，为农业产值增加提供了保障。在2016年的统计中，有26个国家种植转基因作物，发展中国家超过一半，发达国家也将近50％。在如此大面积推广转基因作物的前提下，推广转基因作物产生的各种安全问题也受到关注，研究表明CP4-EPSPS在环境中具有很高的稳定性，造成潜在的土壤污染危险，因此如何高效、低成本的去除环境，例如耕种转基因作物的土地，转基因食品加工废水等中的CP4-EPSPS成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780及其筛选方法与应用，该嗜麦芽糖窄食单胞菌780为本发明人从极地分离得到，利用该菌的培养上清可对大肠杆菌中重组表达的CP4-EPSPS蛋白进行降解。
本发明的目的之一在于提供了一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780，本发明人从中国典型物培养中心获得一批来自于极地的菌株，从中筛选到具有较强蛋白酶活性的菌株。对该菌株进行了纯化和菌种鉴定，经鉴定与是Stenotrophomonas maltophilia具有极高相似性(99.93％)，命名为嗜麦芽糖窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia 780)，其保藏编号为CCTCCNO：M2019784。
本发明的目的之二在于提供所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780在降解EPSPS蛋白中的应用。
具体地，将所述嗜麦芽糖窄食单胞菌780进行培养后的上清，或在所述上清中提取获得的低温蛋白酶，用于降解EPSPS蛋白。
采用摇瓶培养，结果显示Mucilaginibacter spp.780的培养上清可以明显降解CP4-EPSPS蛋白。研究表明，使用添加牛奶的1/2R2A作为培养基时，该菌株培养上清中蛋白酶的酶活随培养时间逐步提高。利用该菌的培养上清对大肠杆菌中重组表达的CP4-EPSPS蛋白进行降解，取400μl CP4-EPSPS蛋白(2mg/ml)与20μl Stenotrophomonas maltophilia780培养上清在18℃反应，分别于0、10、30、60min时间梯度取样检测，SDS-PAGE结果显示该蛋白酶粗酶液在1h时可以完全降解重组CP4-EPSPS蛋白，表明此在低温下诱导的具有较高活力的蛋白酶在EPSPS降解中具有很高的应用价值。
本发明的目的之三在于提供利用所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780制备低温蛋白酶的方法，包括如下步骤：
步骤1、将所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780接种于种子培养基培养一段时间；
步骤2、转入含牛奶的发酵培养基中继续培养；
步骤3、离心，收集上清，即可获得含有低温蛋白酶的细胞裂解液，经纯化即得低温蛋白酶。
所述步骤1中于种子培养基的培养条件为：温度16～20℃，转速200～240rpm，培养时间2～3天。
优选地，所述步骤1中所述的种子培养基为改良的R2A培养基：酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，溶于1000ml蒸馏水，调节pH至7.2。
优选地，所述步骤2中培养条件为：温度16～20℃，转速200～240rpm，培养时间2～3天；接入的菌种与所述含牛奶的发酵培养基的质量体积比为1：8～12；所述含牛奶的发酵培养基为在种子培养基中加入牛奶，所述加入的牛奶质量为所述种子培养基质量的0.5％～3％。
本发明的目的之四在于提供所述方法制备得到的低温蛋白酶。所述低温蛋白酶的最适反应温度为65℃，在18℃能保持其在最适温度条件下40％以上的酶活力，而在0℃条件下能保持18～22％的酶活力。所述低温蛋白酶可降解EPSPS蛋白。
本发明的目的之五在于提供所述的低温蛋白酶在降解EPSPS蛋白中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780，利用该菌株生产的低温蛋白酶可用于环境污染物5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的降解，表明该菌株具有改善土壤、保护环境等方面的潜力。该嗜麦芽糖窄食单胞菌780所产生的蛋白酶的最适温度为65℃，其在18℃时能达到最适温度下活力的40％，4℃时蛋白酶能保持在最适温度下活力的20％左右。由于环境中污染物CP4-EPSPS的存在条件较广，因此本发明的嗜麦芽糖窄食单胞菌780所诱导生产的低温蛋白酶适用于不同环境条件下降解EPSPS，在环境治理中具有很好的应用前景。
本发明的菌株保藏日期为2019年10月9日，保藏编号为CCTCCNO：M2019784，分类命名为嗜麦芽糖窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia780)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
附图说明
图1为不同培养时间下嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达的低温蛋白酶的表达情况；
其中M为Marker条带；
1泳道为1％的牛奶诱导培养基诱导培养0h；
2泳道为1％的牛奶诱导培养基诱导培养12h；
3泳道为1％的牛奶诱导培养基诱导培养24h；
4泳道为1％的牛奶诱导培养基诱导培养36h；
5泳道为1％的牛奶诱导培养基诱导培养48h；
6泳道为1％的牛奶诱导培养基诱导培养72h；
图2为本发明提供的嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达的低温蛋白酶在不同温度下的酶活测定结果；
图3为本发明提供的嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达上清液降解EPSPS情况；其中M为Marker条带；1泳道为嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达上清液与CP4-EPSPS蛋白在0min时EPSPS的表达量，2泳道为对诱导表达上清中的蛋白酶进行灭活处理(进行100℃，30min高温灭活处理)后与CP4-EPSPS蛋白在0min时EPSPS的表达量；3泳道为嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达上清液与CP4-EPSPS蛋白在10min时EPSPS的表达量；4泳道为为对诱导表达上清中的蛋白酶进行灭活处理后与CP4-EPSPS蛋白在10min时EPSPS的表达量；5泳道为嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达上清液与CP4-EPSPS蛋白在30min时EPSPS的表达量；6泳道为为对诱导表达上清中的蛋白酶进行灭活处理后与CP4-EPSPS蛋白在30min时EPSPS的表达量；7泳道为嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达上清液与CP4-EPSPS蛋白在60min时EPSPS的表达量；8泳道为为对诱导表达上清中的蛋白酶进行灭活处理后与CP4-EPSPS蛋白在60min时EPSPS的表达量；
图4为对转基因大豆研磨物中CP4-EPSPS的降解实验结果；
其中(A)图均为阳性结果；其中(A)图中1为灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝4：1组；2为灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝2：1组；3为灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝1：1组；4为灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝0：1组；
(B)图均为阴性结果；其中(A)图中1’为蛋白酶：大豆研磨物上清＝4：1组；2’为蛋白酶：大豆研磨物上清＝2：1组；3’为蛋白酶：大豆研磨物上清＝1：1组；4’为蛋白酶：大豆研磨物上清＝0：1组。
具体实施方式
实施例1菌株的筛选与鉴定
1、菌株的筛选
将从中国典型物培养中心获得的一批来自于极地的菌株分别于1/2R2A固体培养基上划线，18℃培养出单菌落。挑单菌落于添加1.5％的牛奶的1/2R2A固体培养基上，18℃培养2-3天，观察培养平板上面牛奶水解圈的大小。因为780、709的牛奶水解圈较大较明显，选择780、709作为目标菌株用来降解CP4-EPSPS，780降解CP4-EPSPS的效果更为明显。
2、嗜麦芽糖窄食单胞菌780的鉴定
该嗜麦芽糖窄食单胞菌780的菌落形态特征如下：菌落颜色呈白色、形态呈圆形、表面光滑湿润、突起于琼脂表面。
该嗜麦芽糖窄食单胞菌780的16S rDNA基因的序列如序列表SEQ ID NO.1所示。所述的菌株Stenotrophomonas maltophilia 780的16S rDNA全长为1412bp，该序列提交至细菌鉴定与分类专业网站EzTaxon网站进行BLAST比对，发现与之序列相似度最高与之相似性最高的是Stenotrophomonas maltophilia序列一致性达到99.93％)，因此将该菌株命名为嗜麦芽糖窄食单胞菌780。
实施例2嗜麦芽糖窄食单胞菌780的培养与低温蛋白酶的表达
一、嗜麦芽糖窄食单胞菌780的培养
菌株Stenotrophomonas maltophilia 780的培养基为改良的R2A培养基(每升蒸馏水含酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，调节pH至7.2)，培养条件为220rpm，18℃培养2-3d。
二、嗜麦芽糖窄食单胞菌780的接种及诱导表达
将斜面保藏的Stenotrophomonas maltophilia 780菌株接种与种子培养基进行活化(每升蒸馏水含酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，调节pH至7.2)，25℃培养2-3d，随后，按照1：8-10的比例接种于诱导表达培养基(在种子培养基中加入0.5％-3％的牛奶)，18℃，220rpm下继续培养3-5d左右。离心收集上清液，即可得到表达的蛋白酶。
图1为不同培养时间下嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达的低温蛋白酶的表达情况。由图1可知，一定时间内(0～36h)，随着时间的增加，目的菌株产低温蛋白酶的表达量逐渐提升；在36～72h后的菌株产低温蛋白酶的表达量逐渐降低。
三、嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达上清所含的蛋白酶酶活最适温度的测定
采用紫外分光光度法测定蛋白酶酶活，其原理为蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光由吸收，可用紫外分光光度计法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位定义为：酶1mL粗酶液，在一定温度和pH条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，(以U/mL)表示。
将菌株Stenotrophomonas maltophilia 780诱导表达上清进行一定浓缩后，每个反应取一定量分别将蛋白酶在0℃、4℃、18℃、25℃、37℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等不同温度下按上述原理测定蛋白酶酶活。不同温度下的酶活如图2所示，由图2可知此蛋白酶最适温度在65℃，酶活在55℃-75℃范围较高。然后，将蛋白酶在上述温度梯度下处理30分钟，再于最适温度下测定剩余相对酶活，结果显示在18℃处理30min后能达到最适温度下活力的60％，4℃处理蛋白酶能保持在最适温度下活力的80％。
实施例3嗜麦芽糖窄食单胞菌780诱导表达上清液降解EPSPS
1、将实施例2表达纯化浓缩后得到的EPSPS蛋白及稀释至2mg/mL，取400μL稀释后的CP4-EPSPS蛋白与20μL菌株Stenotrophomonas maltophilia 780蛋白酶粗酶液在18℃、0-60min的时间梯度下反应，SDS-PAGE检测结果(图3)显示该蛋白酶粗酶液在1h内可以完全降解CP4-EPSPS蛋白。
2、对转基因大豆研磨物中CP4-EPSPS的降解实验
(1)将不同比例的灭活蛋白酶与大豆研磨物上清混合(具体分组如下)，用CP4EPSPS快速检测试纸条检测，结果如图4(A)所示；分组为
组1：灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝4：1；
组2：灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝2：1；
组3：灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝1：1；
组4：灭活蛋白酶：大豆研磨物上清＝0：1；
图4(A)的试纸条结果显示均为阳性，表明灭活的酶对CP4-EPSPS蛋白没有降解能力。
(2)将不同比例的蛋白酶与大豆研磨物上清混合(具体分组如下)，用CP4 EPSPS快速检测试纸条检测，结果如图4(B)所示；分组为
组1’：蛋白酶：大豆研磨物上清＝4：1；
组2’：蛋白酶：大豆研磨物上清＝2：1；
组3’：蛋白酶：大豆研磨物上清＝1：1；
组4’：蛋白酶：大豆研磨物上清＝0：1；
图4(B)的试纸条结果显示均为阴性，表明一定浓度的嗜麦芽糖窄食单胞菌780表达的低温蛋白酶对CP4-EPSPS蛋白有降解能力。
(3)利用嗜麦芽糖窄食单胞菌780摇瓶培养上清对转基因大豆浸出物进行处理，24h内，用CP4 EPSPS快速检测试纸条(中国农业科学院油料作物研究所，基因工程与转基因安全评价研究室)检测呈阴性，表明24h该低温蛋白酶在24h内可以完全降解CP4-EPSPS蛋白。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一株嗜麦芽糖窄食单胞菌780及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1412
<212> DNA
<213> 嗜麦芽糖窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)
<400> 1
tgcagtcgaa cggcagcaca gtaagagctt gctcttacgg gtggcgagtg gcggacgggt 60
gaggaataca tcggaatcta ctttttcgtg ggggataacg tagggaaact tacgctaata 120
ccgcatacga cctacgggtg aaagcagggg atcttcggac cttgcgcgat tgaatgagcc 180
gatgtcggat tagctagttg gcggggtaaa ggcccaccaa ggcgacgatc cgtagctggt 240
ctgagaggat gatcagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 300
cagtggggaa tattggacaa tgggcgcaag cctgatccag ccataccgcg tgggtgaaga 360
aggccttcgg gttgtaaagc ccttttgttg ggaaagaaat ccagctggtt aatacccggt 420
tgggatgacg gtacccaaag aataagcacc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgaagggtg caagcgttac tcggaattac tgggcgtaaa gcgtgcgtag gtggtcgttt 540
aagtctgttg tgaaagccct gggctcaacc tgggaactgc agtggaaact ggacgactag 600
agtgtggtag agggtagcgg aattcctggt gtagcagtga aatgcgtaga gatcaggagg 660
aacatccatg gcgaaggcag ctacctggac caacactgac actgaggcac gaaagcgtgg 720
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgcccta aacgatgcga actggatgtt 780
gggtgcaatt tggcacgcag tatcgaagct aacgcgttaa gttcgccgcc tggggagtac 840
ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagtatgtg 900
gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgtcgag aactttccag 960
agatggattg gtgccttcgg gaactcgaac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttgccagca 1080
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gggctgcaag ccggcgacgg taagccaatc ccagaaaccc tatctcagtc cggattggag 1260
tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg 1320
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt tgttgcacca 1380
gaagcaggta gcttaacctt cgggagggcg ct 1412

Claims (9)

1.一株嗜麦芽糖窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）780，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2019784。
2.权利要求1所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780在降解EPSPS蛋白中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述嗜麦芽糖窄食单胞菌780进行培养后的上清，或在所述上清中提取获得的低温蛋白酶，用于降解EPSPS蛋白。
4.一种利用权利要求1所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780制备低温蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780接种于种子培养基培养一段时间；
步骤2、转入含牛奶的发酵培养基中继续培养；
步骤3、离心，收集上清，即可获得含有低温蛋白酶的细胞裂解液，经纯化即得低温蛋白酶。
5.如权利要求4所述的利用权利要求1所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780制备低温蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤1中于种子培养基的培养条件为：温度16～20℃，转速200～240 rpm，培养时间2～3天。
6.如权利要求4所述的利用权利要求1所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780制备低温蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤1中所述的种子培养基为改良的R2A培养基：酵母粉5g，蛋白胨5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，溶于1000ml蒸馏水，调节pH至7.2。
7.如权利要求4所述的利用权利要求1所述的嗜麦芽糖窄食单胞菌780制备低温蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤2中培养条件为：温度16～20℃，转速200～240 rpm，培养时间2～3天；接入的菌种与所述含牛奶的发酵培养基的质量体积比为1：8～12；所述含牛奶的发酵培养基为在种子培养基中加入牛奶，所述加入的牛奶质量为所述种子培养基质量的0.5％～3％。
8.一种权利要求4-7任一所述方法制备得到的低温蛋白酶。
9.权利要求8所述的低温蛋白酶在降解EPSPS蛋白中的应用。
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