CN102031236A

CN102031236A - 一种耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102031236A
Application number: CN 201010541821
Authority: CN
Inventors: 周志刚; 曹雅男; 姚斌; 张美超; 何夙旭; 刘玉春; 张宇婷; 毛玮
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Beijing Challenge Bio-technology Limited Company
Priority date: 2010-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2030-11-11
Also published as: CN102031236B

Abstract

本发明公开了一种耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96及其编码基因与应用。该酶是如下a)或b)的蛋白质：a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明公开的酶耐热，具有较强的蛋白酶抗性和较好的降解各种底物的能力，可作为一种新型的生防酶制剂。

Description

一种耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种耐热N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96及其编码基因与应用。

背景技术

群体感应(quorum sensing，QS)，也称为自诱导，最初是指细菌调节自身菌体密度的一种环境感应系统。通过扩散性信号小分子(又称为自诱导物)与转录活化蛋白的相互作用而打开与细胞群体密度有关的基因表达。这些信号分子从细菌细胞扩散到环境中，一旦达到一个临界浓度(或者说达到某一特定的群体密度)，这些信号分子就可诱导调节一系列目标基因的转录。N-酰基-高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)类化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最典型的一类信号分子。细菌细胞通过产生AHLs进行信息交流，调控某些特定生理性状的表达，如果该细菌为病原性微生物，这种QS将带来严重的后果，如对人类主要条件致病菌铜绿假单胞菌芯片分析表明，在基因组中300多个基因受QS系统调控，其中包括了与形成最重要毒力因子和胞外粘多糖生物保护膜的相关基因。因此在感染病灶中形成生物膜，表现更高的耐药性，从而使疾病易漫性化，难以治愈。现在研究的热点是如何干扰病原菌的QS系统以减弱动、植物病原细菌的致病性。因此近年来，AHLs对动、植物病原菌发病的调控作用引起国际学术界的广泛关注，亦成为以生物技术防治细菌病害的新靶点。而利用AHLs调控系统控制细菌病害的途径之一是寻找能降解信号分子的酶，以阻断细菌间的信息交流从而防止病原菌的感染。目前的N-酰基高丝氨酸内酯酶，其耐热性较差是该酶的一大不足，由此限制了其应用范围。因此，发掘耐热性更好的新酶，成为目前研究的一个努力方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株芽孢杆菌。

本发明所提供的芽孢杆菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)AI96，其保藏号为CGMCCNO.4164。

本发明的另一个目的是提供一种具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的蛋白及其编码基因。

该蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的由a)衍生的蛋白质。

所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

扩增上述任一所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述引物对中，所述引物的一条引物序列如SEQ ID NO：3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO：4所示。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为在载体pET-28a(+)的多克隆位点插入权利要求2或3所述编码基因得到的重组表达载体；

所述重组菌是通过重组表达载体导入大肠杆菌得到的，所述重组表达载体为在载体pET-28a(+)的多克隆位点插入权利要求2或3所述编码基因得到的重组表达载体。

上述任一所述蛋白在降解N-酰基高丝氨酸内酯中的应用也属于本发明的保护范围。

上述降解应用中，所述N-酰基高丝氨酸内酯为C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C14-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C12-HSL、·3-oxo-C14-HSL、3-hydroxy-C12-HSL或3-hydroxy-C14-HSL。

上述降解应用中，所述降解的温度为0℃-50℃或10℃-40℃，优选为10℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃；所述降解的pH值为6.0-9.0，优选为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5。

本发明公开了一个新的N-酰基高丝氨酸内酯酶，该酶耐热，具有较强的蛋白酶抗性和较好的降解各种底物的能力，可作为一种新型的生防酶制剂。

附图说明

图1重组AiiA-AI96的SDS-PAGE分析。

图2N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96的最适pH。

图3N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96 pH稳定性。

图4N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96作用的最适温度。

图5N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96的热稳定性。

图6N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96的蛋白酶抗性分析。

图7酶活检测时的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料来源如下：

1、菌株及载体：pEASY-T3载体购自(北京全式金生物技术有限公司)。宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，载体pET-28a(+)均购自于Invitrogen公司。检测菌株Agrobacterium tumefaciens KYC55在文献(Cho，K.，C.Fuqua，and S.C.Winans.1997.Transcriptional regulation and locations of Agrobacterium tumefaciens genes required for complete catabolism of octopine.J.Bacteriol.179：1-8.)中公开过，公众可从中国农业科学院饲料研究所获得。

2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。N-酰基高丝氨酸内酯类信号分析包括N-butyryl-L-homoserine lactone(C4-HSL)、N-hexanoyl-L-homoserine lactone(C6-HSL)、N-Octanoyl-L-homoserine lactone (C8-HSL)、N-decanoyl-L-homoserine lactone(C10-HSL)、N-dodecanoyl-L-homoserine lactone(C12-HSL)、N-tetradecanoyl-L-homoserine lactone(C14-HSL)、N-(3-Oxohexanoyl)-D-homoserine lactone(3-oxo-C6-HSL)、N-(3-Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C8-HSL)、N-3-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone(3-oxo-C12-HSL)、N-(3-Oxotetradecanoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C14-HSL)、N-(3-hydroxy)-dodecanoyl-homoserine lactone(3-hydroxy-C12-HSL)、N-(3-Hydroxytetradecanoyl)-DL-homoserine lactone(3-hydroxy-C14-HSL)均购自Sigma(St.Louis，Mo，USA)。胰蛋白酶(Trypsin)、α-糜蛋白酶(α-Chymotrypsin)、蛋白酶K(Proteinase K)、枯草杆菌蛋白酶A(Subtilisin A)、胶原蛋白酶(Collagenase)、牛血清白蛋白为Sigma(USA)产品；其它都为国产试剂。

3、培养基

LB培养基：1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl。

实施例1、菌的分离与鉴定

一、菌的分离

菌株分离自天津武清的鱼塘底泥。将底泥按1∶10(泥∶水)用无菌水重悬后，用无菌水稀释至10^-5后涂布于LB平板(涂加5μM C6-HSL和3-oxo-C6-HSL)，20℃培养5天后，将菌落挑至液体LB中20℃培养3天，10000rpm离心3min收集菌体，并重悬于1x PBS pH 8.0缓冲液，超声波破碎后12000rpm离心10min，收集上清检测酶活。检测到一株有酶活菌株，将该菌株命名为AI96。

二、鉴定

形态鉴定：在普通LB平板上20℃培养3天培养后，长出的菌落较大大、扁平，边缘呈蔓延、发丝团样、缠绕交织的根状菌落，涂片染色为革兰阳性杆菌。

16S rDNA鉴定：扩增该菌的16S rDNA，再测序，测序结果与Genbank数据库中的核苷酸序列比对，结果该菌株AI96的16S rDNA核苷酸序列与Bacillus pseudomycoides(Genbank accession No.GU826151)据有最高的相似性，为100％。

在LB培养基中30℃、250rpm摇振培养48h后，将菌液离心收集菌体，以1x PBSpH 8.0缓冲液重悬，超声波破碎后离心取上清按实施例3方法可检测到酶活。

综合以上特征，证明该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，菌株名称为AI96。该菌株已于2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4164。

实施例2、酶的制备

一、基因克隆

芽孢杆菌(Bacillus sp.)AI96基因组DNA的提取：Bacillus sp.AI96接菌至LB培养基中，30℃培养了48h。取1ml菌液，10000rpm离心3min收集菌体。使用TIANamp Bacteria DNA Kit(Tiangen，Beijing，China)提取基因组DNA，-20℃保存备用。

扩增引物：AI96-up(5′-CTGATATGAGAAGGTGGATA-3′)和AI96-down(5′-AACAGCATTATGATTTCCC-3′)。以AI96的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec，45℃30sec，72℃1min，35个循环后；72℃10min，琼脂糖电泳检测。将得到的片段连接pEASY-T3载体测序，结果该片段包含aiia-AI96全长基因，基因序列如SEQ ID NO：2所示。该基因为一个长753bp的基因片段，编码250个氨基酸和一个终止密码子。其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。将蛋白记作N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96。

二、重组表达载体及重组菌构建

根据aiia-AI96序列设计特异性引物AI96aiia-EF(5′-CCGGAATTCATGACCGTTAAAAAACTTTAC-3′)(划线部分为EcoR I酶切位点)和AI96aiia-ER(5′-ATTGCGGCCGCTTATAAAAATTCAGGAAATG-3′)(划线部分为Not I酶切位点)，以芽孢杆菌(Bacillus sp.)AI96基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物和质粒pET28a(+)分别用EcoR I和Not I进行双酶切，连接形成载体pET28a(+)/aiia-AI96，制备BL21(DH3)感受态细胞，将重组质粒pET28a(+)/aiia-AI96电击转化宿主菌E.coli BL21(DH3)。液态培养，提取质粒，测序鉴定，结果阳性重组菌中含有阳性重组质粒，阳性重组质粒为在pET28a(+)中插入了SEQ ID NO：2所示基因。

将阳性重组菌接种于3mL LB(加有50μg/mL的卡那霉素)培养液中，37℃快速振荡培养过夜。分别取100μL过夜培养液加入含50μg/mL卡那霉素的10mL LB培养液(1％接种量)中，37℃振荡培养约2-3h(OD₆₀₀达到0.6-0.8)后加入终浓度1mol/L的诱导剂IPTG，20℃180rpm震荡培养12h。培养液12,000rpm离心5min，分别收集培养基上清和沉淀，细胞沉淀用pH8.0的1x PBS缓冲液重悬，超声破碎后12,000rpm离心10min，收集上清为细胞总蛋白(CTP)。

细胞总蛋白(CTP)经一步Ni-NTA柱纯化(NEB)，将各蛋白进行电泳检测。

同时以转入空载体pET28a(+)的重组菌和转化pET-28a(+)/aiiA-AI96重组菌未诱导为对照。

结果：转化pET-28a(+)/aiiA-AI96重组菌诱导后产生的纯化蛋白为单一条带，分子量约为29kDa与预测分子量相近。结果对照总蛋白中未见目标大小的蛋白。

电泳结果如图1，M：低分子量蛋白质Marker；1：载体pET-28a(+)转化E.coliBL21诱导后的CTP；2：载体pET-28a(+)/aiiA-AI96转化E.coli BL21未诱导的CTP；3：载体pET-28a(+)/aiiA-AI96转化E.coli BL21诱导后的CTP；4：纯化的AiiA-AI96。

按上述实施例3中酶活测定方法分别检测培养基上清和CTP酶活。

结果：

转入空载体pET28a(+)的重组菌诱导后的总蛋白无酶活性，

转化pET-28a(+)/aiiA-AI96重组菌未诱导产生的总蛋白也无酶活性，

转化pET-28a(+)/aiiA-AI96重组菌诱导后产生的总蛋白具有酶活性，

转化pET-28a(+)/aiiA-AI96重组菌诱导后产生的纯化蛋白具有酶活性；

上清液没有酶活性。

说明重组酶主要在大肠杆菌胞内表达，得到的纯化蛋白是N-酰基高丝氨酸内酯酶，将其命名为AiiA-AI96。

实施例3、N-酰基高丝氨酸内酯酶活性分析

酶活性测定方法采用琼脂平板扩散法。将3-oxo-C8-HSL溶于1x PBS pH 8.0缓冲液中，使其终浓度为1mg/L。酶活反应体系：将20μL酶液，179μL的1x PBS pH 8.0缓冲液和1μL的3-oxo-C8-HSL的溶液混合，摇匀。30℃温育30min后，反应体系中加入50uL10％的SDS溶液终止反应。在用平板扩散法检测中，ATmm琼脂用手术刀切割成4x60mm的胶条，用牙签将检测菌KYC55间隔4mm点接于胶条上，将10uL的反应终止的酶反应液滴至胶条一端，30℃培养24h后计数变蓝点数，计算距离，按标准曲线公式计算3-oxo-C8-HSL消耗。对照组加酶液和缓冲液后，先加SDS溶液再加信号分子。

标准曲线制备，将3-oxo-C8-HSL溶于1x PBS pH 8.0缓冲液中，终浓度为1mg/L。分别向1x PBS pH 8.0的缓冲液中添加10、5、1、0.5、0.1和0.05μL的3-oxo-C8-HSL的溶液，用1x PBS pH 8.0的缓冲液将体系补充至200μL，摇匀。30℃温育30min后，反应体系中加入50uL 10％的SDS溶液终止反应。用牙签将检测菌KYC55间隔4mm点接于胶条上，将10uL的反应终止的反应液滴至胶条一端，30℃培养24h后计数变蓝点数，计算距离(mm)，以加入3-oxo-C8-HSL物质量为纵轴(y)，以扩散距离为横轴(x)，建立回归方程，计算3-oxo-C8-HSL消耗量。并以回归方程为基础建立酶活计算公式。标准曲线如图7所示。

酶活计算公式为：U＝6.52*(1.4163^Xck-1.4163^Xs)*50/30/10⁶(加入酶量为20μl，反应时间30min)

e＝2.718281828459045

X(距离mm)

酶活(U/mL)单位定义：在30℃、pH值8.0下每分钟分解1nmol 3-oxo-C8-HSL的酶量被定义为一个酶活单位。

实施例4、N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96的酶学性质

下述中的相对酶活＝各酶反应条件下产物的物质的量/酶活定义反应条件下产物的物质的量。

经纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。除pH值不同外，其余条件均与实施例3中所述酶活测定方法相同。所用缓冲液为pH 4.0、5.0、6.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液、pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的1xPBS缓冲液、pH 8.0、8.5、9.0的Tris-HCl缓冲液和pH 9.0、10.0、11.0、12.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96在不同pH的缓冲体系，30℃下测定的pH适性结果(图2)表明：AiiA-AI96的最适作用pH为8.0，在pH6.0-8.5保持90％以上的相对酶活性，pH低于5或高于10.0几乎丧失所有酶活。将pH为8.0的条件下测得的酶活记为100％，此时的酶活值为22.97U/mL。各pH值下的相对酶活如下：6.0(McIlvaine)(78.87％)、6.0(PBS)(98.76％)、6.5(99.24％)、7.0(99.72％)、7.5(99.82％)、8.0(PBS)(100.00％)、8.0(Tris)(99.83％)、8.5(99.93％)、9.0(Tris)(59.42％)、9.0(甘氨酸-NaOH)(59.42％)、10.0(1.41％)、11.0(0.10％)。

除事先将酶液在不同pH值条件下处理0.5h外，其余步骤均与实施例3中所述酶活测定方法相同。将酶液在不同pH值的缓冲液中于30℃下处理0.5h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，AiiA-AI96在pH范围为7.0-11.0间都很稳定，保持80％以上的酶活。将pH为8.0处理0.5h后测得的酶活记为100％。其它处理条件下的相对酶活：pH7.0 82.38％、pH8.0 100.00％、pH9.0 100.00％、pH10 100.00％、pH11 100.00％、pH12 35.16％。

最适温度的测定在pH8.0的1x PBS缓冲液体系及不同的温度(0～70℃)下进行酶促反应。除温度不同外，其余条件均与实施例3中所述酶活测定方法相同。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，AiiA-AI96的最适作用温度40℃，温度高于70℃时剩余不到2％的酶活。将温度为40℃的条件下测得的酶活记为100％。其它处理条件下的相对酶活：0℃ 83.70％、10℃ 99.76％、20℃ 99.65％、25℃ 99.52％、30℃ 99.76％、35℃ 99.93％、40℃ 100.00％、50℃ 83.85％、60℃ 25.14％。

测定AiiA-AI96在不同的温度(70，80℃)下分别保温2、5、10、15、20、30、60min时的相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。除事先将酶液在不同温度条件下处理一段时间外，其余步骤均与实施例3中所述酶活测定方法相同。在70℃下处理60min后酶活剩余约95％，80℃处理5min后酶活剩余约50％，热稳定性较好(图5)。将未经保温处理的酶活记为100％，此时的酶活值为22.97U/mL。70℃保温30min 21.90U/mL、70℃保温60min 20.17U/mL；80℃保温5min 21.80U/mL、80℃保温60min 20.76U/mL。其他剩余酶活为70℃保温2min 100.00％、70℃保温5min 100.00％、70℃保温10min 99.86％、70℃保温15min 99.27％、70℃保温20min 98.70％。

在酶活检测反应体系中分别加入终浓度为1mM和10mM的不同的金属离子及化学试剂，研究它们对酶活性的影响。在30℃、pH 8.0条件下检测剩余酶活(表1)。

表1.不同金属离子及相关化学试剂对AiiA-AI96的影响

以上实验均设3次重复，结果均一致。

实施例5、N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96蛋白酶的抗性

将蛋白酶分别用下列溶液配制成1mg/mL的溶液：用pH 7.0、0.1mol/L Tris-HCl将胰蛋白酶、α-糜蛋白酶配成1mg/mL的溶液；用pH7.50、1mol/L Tris-HCl将蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶A、胶原蛋白酶配成1mg/mL的溶液。将纯化的AiiA-AI96按10∶1(w/w)在该蛋白酶缓冲液中处理60min后，按实施例3所述方法检测酶活。结果表明，用不同蛋白酶处理后AiiA-AI96的剩余酶活基本不变。对于胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K、枯草芽孢杆菌蛋白酶A、胶原蛋白酶，有很好的抗性(图6)。将不经过处理的酶的酶活作为100％，此时的酶活值为22.97U/mL。

实验均设3次重复，结果均一致。

实施例6、N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA-AI96的底物特异性

按实施例3提供的酶活测定方法。将底物分别换成C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-hydroxy-C12-HSL、3-hydroxy-C14-HSL结果显示，除C12-HSL外，AiiA-AI96对以上信号分子均具有降解作用。

Claims

1.芽孢杆菌(Bacillus sp.)AI96，其保藏号为CGMCC NO.4164。

2.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3.权利要求2所述蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示DNA分子；

5.扩增权利要求3或4所述基因全长或其任意片段的引物对。

6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于：所述引物的一条引物序列如SEQID NO：3所示，另一条引物序列如SEQ ID NO：4所示。

7.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在载体pET-28a(+)的多克隆位点插入权利要求3或4所述编码基因得到的重组表达载体；

所述重组菌是通过重组表达载体导入大肠杆菌得到的，所述重组表达载体为在载体pET-28a(+)的多克隆位点插入权利要求3或4所述编码基因得到的重组表达载体。

9.权利要求2所述蛋白在降解N-酰基高丝氨酸内酯中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述N-酰基高丝氨酸内酯为C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C14-HSL、3-oxo-C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-oxo-C12-HSL、3-oxo-C14-HSL、3-hydroxy-C12-HSL或3-hydroxy-C14-HSL。

所述降解的温度为0℃-50℃或10℃-40℃，优选为10℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃；所述降解的pH值为6.0-9.0，优选为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或8.5。