CN101892207A - 一种低温α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和应用。本发明提供了一种来源于天牛胃肠道共生细菌Flavobacterium sp.TN17的α-半乳糖苷酶GalA17，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶的编码基因galA17。本发明的α-半乳糖苷酶具有以下性质：最适pH5.5，最适温度45℃，在30-50℃间具有＞55％的酶活；良好的pH稳定性；良好的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力；可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

Description

一种低温α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种低温α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶或蜜二糖酶(α-D-galactoside galactohydrolase，EC 3.2.1.22)是一种外切型糖苷酶，能够催化α-D-半乳糖苷类化合物中的α-D-半乳糖残基的水解。这类糖苷包括半乳糖寡糖(如蜜二糖、棉子糖和水苏糖)、分支多糖(如半乳甘露聚糖)和半乳糖脂(Margolles-Clark E，et al.Eur J Biochem，1996，240(1)：104-11.)。

目前，已通过多种纯化技术从真菌、细菌、酵母、植物和人中分离得到α-半乳糖苷酶。不同来源的α-半乳糖苷酶其理化性质存在极大的差异。植物来源的α-半乳糖苷酶根据其作用pH的不同分为酸性α-半乳糖苷酶和碱性α-半乳糖苷酶。真菌和酵母来源的α-半乳糖苷酶的作用最适pH在3.0-6.0之间，而细菌来源的α-半乳糖苷酶则比真菌有更高的最适pH(5.0-7.5)(李孝辉等，微生物学通报，2002，29：71-74.)。根据氨基酸序列相似性，α-半乳糖苷酶被划分到四个不同的糖苷水解酶家族中，即4家族，27家族，36家族和57家族。研究最多的α-半乳糖苷酶分布于27家族和36家族，真菌来源的α-半乳糖苷酶多数属于27家族，而36家族的α-半乳糖苷酶多数来源于细菌(Henrissat，et al.Biochem J，1993，293：781-788.)。

棉籽糖家族寡糖(RFOs，主要是棉籽糖和水苏糖)是食品和饲料中(特别是豆类)的抗营养因子。外源α-半乳糖苷酶的添加可以经济有效地去除这种抗营养因子。此外，食品及饲料工业中还要求添加的α-半乳糖苷酶对各种α-半乳糖苷类寡糖都要具有较高的水解能力，而以前报道的α-半乳糖苷酶不能水解多种底物，在应用上各具有其局限性。不同来源的微生物α-半乳糖苷酶根据其性质特性的不同被应用于不同的领域。

本发明得到了一个来源于天牛胃肠道共生菌Flavobacterium sp.TN17的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶具有低温特性，作用pH范围较广，良好的抗蛋白酶能力，较好的水解各种底物的能力，该酶作为一种新型的酶制剂，可广泛的应用于饲料、食品、医药等行业。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的低温α-半乳糖苷酶。

本发明的再一目的是提供编码上述低温α-半乳糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐低温α-半乳糖苷酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述低温α-半乳糖苷酶的应用。

本发明从天牛肠道分离菌(Flavobacterium sp.TN17，其保藏号为：CGMCC No.4009)中分离得到一种新的低温α-半乳糖苷酶GalA17。

根据本发明的低温α-半乳糖苷酶GalA17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

mkkhitnlrqsfgiaffvlasycspvsaqqiisvktksnalvlqvtpgkelntiylgeklandfdyvkiqgqfkqgtdysgiynaaytpsgsknllepaiavthadgntsldllyvdhktttvstgvsqteitlkdnvypievhlfiqsyydtdiieqwttikhaekgnitlnkyasanlylkgynnfylnqyhgdwakemqpeesklthgikvldtklgsranlfqpsvfmvsldkpateddgkvlfaglewsgnfrtdleldplnnlrvisginnaaaayslakntvfttpkfwytlsskgkghasrnlhdwsrnykildgkgsrltllnnweatyfnfdedklkvliadskklgvdmfllddgwfgnnfprnnddaalgdwdvnkkklpngigtlvktakdnqvkfgiwiepemvnpasdlykkhpewivkqpgrtehyfrnqlvldlsnpkvqdfvygvvdnlftenpelayikwdcnaviynayssnlkdkqnnfytdyvtglykvlerirvkyptvpmmlcsggggrvdyaamkyftefwpsdntdplervymqweysyfypaltiaahvtdwgkqpikyrtdvammgrlgfdivvkdlnekdltfaqqaiknynalsntiwqgdqyrlqnpwgndaasvmfvnksgneavvfsysvnsryeagthlpiklkglqagqnykveeinvypdkkpvvetatysgdflmqvginpnvnstntsvvlkitka

其中，该酶基因编码734个氨基酸，N端28个氨基酸为其预测的信号肽序列“mkkhitnlrqsfgiaffvlasycspvsa”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的低温α-半乳糖苷酶GalA17的理论分子量为80.0kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

qqiisvktksnalvlqvtpgkelntiylgeklandfdyvkiqgqfkqgtdysgiynaaytpsgsknllepaiavthadgntsldllyvdhktttvstgvsqteitlkdnvypievhlfiqsyydtdiieqwttikhaekgnitlnkyasanlylkgynnfylnqyhgdwakemqpeesklthgikvldtklgsranlfqpsvfmvsldkpateddgkvlfaglewsgnfrtdleldplnnlrvisginnaaaayslakntvfttpkfwytlsskgkghasrnlhdwsrnykildgkgsrltllnnweatyfnfdedklkvliadskklgvdmfllddgwfgnnfprnnddaalgdwdvnkkklpngigtlvktakdnqvkfgiwiepemvnpasdlykkhpewivkqpgrtehyfrnqlvldlsnpkvqdfvygvvdnlftenpelayikwdcnaviynayssnlkdkqnnfytdyvtglykvlerirvkyptvpmmlcsggggrvdyaamkyftefwpsdntdplervymqweysyfypaltiaahvtdwgkqpikyrtdvammgrlgfdivvkdlnekdltfaqqaiknynalsntiwqgdqyrlqnpwgndaasvmfvnksgneavvfsysvnsryeagthlpiklkglqagqnykveeinvypdkkpvvetatysgdflmqvginpnvnstntsvvlkitka

本发明的α-半乳糖苷酶GalA17的最适pH值为5.5，最适温度为45℃，在30℃-50℃间均具有55％以上的酶活力；用胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胶原蛋白酶处理60分钟，酶活性维持在90％；具有多种底物的降解能力。

本发明提供了编码上述低温α-半乳糖苷酶GalA17。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

CAACAAATTATCTCAGTAAAAACAAAAAGTAATGCGCTTGTTTTGCAAGTTACTCCCGGAAAAGAGTTGAACACTATTTACTTAGGAGAAAAATTAGCCAATGATTTTGATTATGTAAAAATACAAGGACAGTTCAAACAAGGAACAGATTATTCAGGAATTTACAATGCAGCATATACACCATCTGGTTCTAAAAACTTATTAGAACCTGCAATTGCAGTAACACACGCTGACGGAAATACTTCGCTGGATTTATTATACGTAGATCAIAAAACGACTACGGTAAGTACAGGAGTTTCTCAAACTGAAATTACCTTAAAAGACAATGTTTATCCAATTGAGGTTCATTTGTTTATTCAGTCTTACTATGATACTGATATTATAGAGCAATGGACAACGATTAAACATGCTGAAAAAGGAAATATTACTTTAAACAAATATGCTTCGGCTAATTTATATCTTAAAGGATATAACAATTTCTATTTGAATCAATATCACGGAGACTGGGCAAAAGAAATGCAGCCTGAAGAAAGCAAATTAACTCACGGAATTAAAGTGTTAGAIACTAAATTAGGTTCACGTGCGAATTTGTTTCAGCCTTCAGTATTTATGGTTTCTTTAGACAAACCAGCTACAGAAGATGACGGAAAAGTGTTATTTGCAGGTTTAGAATGGTCAGGAAATTTCCGTACAGATTTAGAATTAGATCCATTAAATAATCTTCGTGTTATTTCTGGTATTAAIAATGCAGCGGCAGCTTATTCTTTAGCTAAAAACACTGTATTTACAACTCCAAAATTTTGGTAIACTTTATCTTCTAAAGGAAAAGGACATGCAAGCCGTAACTTACACGACTGGTCAAGAAATTAIAAAATATTAGACGGAAAAGGAAGCCGTTTAACTTTGCTAAACAACTGGGAAGCTACTTATTTTAATTTTGATGAAGATAAACTAAAAGTGCTTATCGCTGAIAGTAAAAAACTTGGCGTTGATATGTTCTTATTAGATGACGGATGGTTCGGAAACAATTTTCCTCGTAACAATGACGACGCAGCTCTTGGAGACTGGGACGTAAACAAAAAGAAATTACCAAACGGAATCGGTACTTTGGTAAAAACAGCTAAAGACAATCAGGTAAAATTCGGAATCTGGATTGAGCCGGAAATGGTAAACCCAGCGAGTGATTTGTATAAAAAACATCCGGAATGGATTGTGAAACAACCGGGAAGAACGGAGCATTATTTCCGTAATCAATTGGTTTTAGATTTATCAAACCCTAAAGTTCAGGATTTTGTTTACGGAGTTGTAGACAATCTTTTTACAGAAAACCCGGAATTGGCGTATATCAAATGGGATTGTAATGCAGTAATTTACAACGCATATTCAAGCAATTTAAAAGACAAACAAAACAATTTCTATACAGATTATGTAACAGGATTGTAIAAAGTTTTAGAGCGTATTCGTGTAAAATACCCTACAGTACCTATGATGCTTTGCTCTGGTGGTGGTGGTAGAGTAGATTATGCTGCAATGAAATACTTTACAGAATTCTGGCCAAGTGAIAACACAGATCCTTTAGAAAGAGTATTATGCAATGGGAATACTCGTATTTTTACCCGGCTTTGACCATCGCAGCTCACGTAACAGATTGGGGAAAACAACCTATAAAATACCGTACAGATGTTGCCATGATGGGAAGATTAGGTTTTGATATTGTGGTAAAAGATTTAAACGAGAAAGATTTGACTTTTGCTCAACAAGCGATCAAAAATTATAATGCATTAAGCAACACAATCTGGCAAGGAGATCAATACCGTTTGCAAAATCCTTGGGGTAATGACGCGGCGTCTGTAATGTTTGTAAACAAAAGCGGAAACGAAGCAGTTGTATTTAGTTATTCTGTTAATTCAAGATACGAAGCAGGAACACATCTTCCTATAAAATTAAAAGGATTACAAGCAGGACAAAACTATAAAGTAGAAGAAATCAACGTATATCCGGATAAAAAGCCTGTGGTAGAAACTGCGACTTATTCTGGTGATTTTTTAATGCAGGTTGGTATCAACCCGAATGTAAATTCTACTAATACGAGCGTTGTTTTAAAAATTACAAAGGCCTAA

本发明通过PCR的方法分离克隆了α-半乳糖苷酶基因galA17，DNA全序列分析结果表明，α-半乳糖苷酶GalA17结构基因galA17全长2205bp。其中，信号肽的核苷酸序列为：

ATGAAAAAACACATTACCAATTTAAGGCAATCTTTTGGGATCGCATTTTTTGTGCTGGCGAGTTATTGCAGCCCGGTTTCGGCG(SEQ ID NO.5)。

将α-半乳糖苷酶基因galA17序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。该基因与Pedobacter sp.BAL39来源的潜在α-半乳糖苷酶(EDM38577)具有最高的一致性，为66.6％；与确证活性的Carnobacterium piscicola BA来源GH36α-半乳糖苷酶(AAL27305)的一致性为30.1％。说明GalA17是一种新的α-半乳糖苷酶。

本发明还提供了包含上述低温α-半乳糖苷酶基因galA17的重组载体，优选为pET-galA17。将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒pET-22b(+)上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到大肠杆菌表达质粒pET-galA17。

本发明还提供了包含上述低温α-半乳糖苷酶基因galA17的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21/galA17。

本发明还提供了一种制备低温α-半乳糖苷酶GalA17的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶GalA17。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/galA17。

本发明还提供了上述α-半乳糖苷酶GalA17的应用。

本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶最适pH在中性范围(pH5.5)，pH稳定性在中性pH内最佳，最适温度较低(45℃)且在较低温度(10℃)具有活性，热稳定性较差(＜50℃但都能在37℃稳定)。这些共同特征可能与天牛生存环境(体温随自然环境温度而变，但不低于0℃、不高于40℃)及肠道生理环境(肠道内容物pH为6.5)密切相关。多种蛋白酶抗性(胰蛋白酶、胶原蛋白酶和α-糜蛋白酶)，可以有效地水解角豆胶、瓜尔胶和豆粕，表明GalA17在食品和饲料添加剂方面具一定的应用潜力。

附图说明

图1在大肠杆菌中表达的重组α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：含有α-半乳糖苷酶基因的大肠杆菌培养上清液；2：纯化的重组α-半乳糖苷酶3：含有空载体的大肠杆菌培养上清液；

图2重组α-半乳糖苷酶的最适pH。

图3重组α-半乳糖苷酶的pH稳定性。

图4重组α-半乳糖苷酶的最适温度。

图5重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。

黄杆菌Flavobacterium sp.TN17，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4009。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：黄杆菌Flavobacterium sp.TN17，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.4009。大肠杆菌表达载体pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21(DE3)购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)产纤维素酶细菌筛选培养基：Peptone 10g，NaCl 5g，Yeast extract 0.5g，CMC 5g，刚果红0.2g，MnSO₄·5H₂O 0.02g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，ZnSO₄·7H₂O 0.01g，CuSO₄·5H₂O 0.01g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，K₂HPO₄0.5g，琼脂20g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。

(2)LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1黄杆菌Flavobacterium sp.TN17的筛选

利用刚果红法对天牛胃肠道内的共生微生物进行纤维素酶及半纤维素酶的产酶活性初筛。产酶越多或酶活越高，水解圈越大；产酶越快，水解圈出现越早。平板上一共随机挑取了100株细菌。提取该100株细菌的基因组并扩增得到了16S rDNA。经BLASTn比对后，菌株TN17属于黄杆菌属，定名为黄杆菌Flavobacterium sp.TN17。

实施例2黄杆菌Flavobacterium sp.TN17α-半乳糖苷酶编码基因galA17克隆

提取Flavobacterium sp.TN17基因组DNA：

将液体培养1d的菌体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第36家族α-半乳糖苷酶基因的保守([F/L/V]-[L/V]-[L/M/V]-D-D-G-W-F和E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E])序列设计合成了简并引物GH36F，GH36R

GH36F：5′-GACATGTTCGTGATGGACGAYGGNTGGTT-3′；

GH36R：5′-CGGACTCTGGGTTCACCATYTCNGGYTC-3′)。

以Flavobacterium sp.TN 17总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，44℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约193bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各二条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2(上游特异性引物)，dsp1，dsp2(下游特异性引物)见表1。

表1.α-半乳糖苷酶GalA17TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序，经拼接后得α-半乳糖苷酶编码基因galA17的序列如SEQ IDNO.4所示。

实施例3重组α-半乳糖苷酶的制备。

将表达载体pET22b(+)进行双酶切(BamHI+HindIII)，同时将编码α-半乳糖苷酶的基因galA17双酶切(BamHI+HindIII)，切出编码成熟α-半乳糖苷酶的基因片段与表达载体pET22b(+)连接，获得含有Flavobacterium sp.TN17α-半乳糖苷酶的基因galA17的重组质粒pET-galAl7并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/galA17。

取含有重组质粒pET-galA17的E.coli BL21(DE3)菌株和只含有pET-22b(+)空质粒的E.coli BL21(DE3)菌株，以0.1％的接种量接种于LB(含100μg/mLAmp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg/mLAmp)培养液中，快速振荡培养约2-3h(OD₆₀₀达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集培养基上清。依次利用中空纤维超滤膜和超滤膜包(分子筛原理)对该初酶液进行浓缩。以上胞外浓缩的初酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组α-半乳糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达。所表达的α-半乳糖苷酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上。

实施例4重组α-半乳糖苷酶的活性分析

酶活性测定方法采用pNPG法。将pNPG溶于0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，使其终浓度为2mmol/L。反应体系含20μL适量酶液，230μL的100mM缓冲液和250μL的2mmol/L底物。底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应5min，然后加1.5mL 1M Na₂CO₃终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP。1个酶活单位(U)定义为每分钟分解pNP类化合物产生1μmolpNP所需的酶量。

实施例5重组α-半乳糖苷酶GalA17的性质测定

1、重组α-半乳糖苷酶GalA17的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

酶的最适pH测定：将实施例4纯化的重组α-半乳糖苷酶GalA17在37℃和pH1.0-12.0的缓冲液下进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于pH1.0-12.0的缓冲液中，在37℃下处理1h以上，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M KCl-HCl(pH1.0-2.0)，McIlvaine buffer(pH2.0-8.0)，0.1M Tris-HCl(pH8.0-9.0)和0.1M glycine-NaOH(pH9.0-12.0)。以pNPGal为底物，在37℃下反应5min，测定纯化的GalA17的酶学性质。结果表明：GalA17的最适pH为5.5，在pH5.0-7.0之间，酶活＞55％(图2)；经pH5.0-9.0的缓冲液37℃处理1h后，剩余活性＞80％(图3)。

2、重组α-半乳糖苷酶GalA17的最适温度及热稳定性测定方法如下：

酶的最适温度测定：在pH5.5的缓冲液中，于0-80℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中(37℃，50℃或60℃)处理0-60min后，在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。在45℃时，GalA17的酶活最高，在30-50℃间具有＞55％的酶活(图4)；经37℃处理1h后，GalA17仍较稳定，而60℃处理5min后，GalA17完全变性(图5)。

3、重组α-半乳糖苷酶GalA17的Km值测定方法如下：

酶的动力学参数测定一级反应时间：在pH5.5及45℃下，以1M pNP类化合物作为底物，依次在酶促反应的2-30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05-1MpNP化合物作为底物，在pH5.5、45℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定Km、Vmax和kcat。在45℃pH5.5条件下，GalA17对pNPGal的K_m、V_max和k_cat分别为2.47mM、476.19μmol min^-1mg^-1和654.62s^-1。

4、不同金属离子化学试剂对GalA17酶活的影响测定方法如下：

在酶促反应体系中加入10mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃、pH5.5条件下测定酶活性。结果表明，10mM的Ag⁺、Hg²⁺和SDS可完全抑制GalA17；Fe²⁺对GalA17的抑制较强(剩余酶活～30％)，Cr³⁺对GalA17的抑制较弱(剩余酶活～75％)；Mn²⁺、β-mercaptoethanol、Zn²⁺和EDTA可使GalA17的酶活提高～0.2倍；其余金属离子和化学试剂对GalA17的影响很小。

5、α-半乳糖苷酶GalA17的抗蛋白酶能力

酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶1/10(w/w)的胰蛋白酶(pH7.0)、α-糜蛋白酶(pH7.0)或胶原蛋白酶(pH7.5)在37℃对重组酶处理1h，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以在蛋白酶对应pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。经胰蛋白酶、胶原蛋白酶和α-糜蛋白酶处理1h后，GalA17仍能分别保持98.56％、95.64％和92.79％的酶活。从以上结果可以看出：GalA17对这三种蛋白酶都有良好的抵抗能力。

5、α-半乳糖苷酶GalA17的底物特异性

在37℃PH5.5条件下，GalA17对pNPGal、水苏糖、蜜二糖、棉籽糖、豆粕、角豆胶和瓜尔胶的比活分别为92.95±4.14、51.22±0.85、2.52±0.06、0.84±0.26、0.87±0.16、0.49±0.07和0.20±0.04U mg^-1。

Claims (10)

1.一种低温α-半乳糖苷酶GalA17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的低温α-半乳糖苷酶GalA17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种低温α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，其编码权利要求1或2所述的低温α-半乳糖苷酶GalA17。

4.如权利要求3所述的低温α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4。

5.如权利要求3所述的低温α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶基因galA17的信号序列如SEQ ID NO.5所示。

6.包含权利要求3或4所述低温α-半乳糖苷酶基因galA17的重组载体。

7.包含权利要求3或4所述低温α-半乳糖苷酶基因galA17的重组菌株。

8.如权利要求7的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

9.一种黄杆菌Flavobacterium sp.TN17，其保藏号为：CGMCC No.4009。

10.权利要求1或2所述低温α-半乳糖苷酶GalA17的应用。

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