CN109097379B - 一种提高甲壳素酶表达量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高甲壳素酶表达量的方法，属于酶工程以及微生物工程技术领域。本发明的方法为先将信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ的基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因N端，然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达，以提高甲壳素酶的表达量；将利用本发明的方法得到的重组菌发酵12h，可使得发酵上清液中的甲壳素酶酶活提高至20.62U/mL(胞外酶活)，是野生型菌株发酵的将近15倍。

Description

一种提高甲壳素酶表达量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高甲壳素酶表达量的方法，属于酶工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
甲壳素酶(EC 3.2.1.14.)又称几丁质酶，能催化不溶性的甲壳素糖链β-1,4糖苷键的断裂，生成水溶性的几丁寡糖。
由于甲壳素酶既可作为生物防治剂，也可用于原生质分离、细胞化学定位以及生产单细胞蛋白，因此，其在农业、生物技术方面均有很重要的应用；由于甲壳素酶的水解产物几丁寡糖能够提高机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长、在人体肠道内活化增殖双歧杆菌、抗菌防腐、保湿，因此，其在医药、食品、化妆品等工业中也具有广阔的应用前景。
现在，已发现的能够产甲壳素酶的微生物主要包括Paenibacillusbarengoltzii、Marine Bacterium(Alteromonas sp.Strain 0-7)、Streptomycesthermoviolaceus OPC-520和Bacillus cereus等，但是，这些野生菌株的甲壳素酶产量均十分低下，仅有0.83-1.13U/mL。
目前，已经有研究通过异源表达、酶分子改造等技术手段试图提高甲壳素酶表达量，例如，在大肠杆菌或毕赤酵母中异源表达甲壳素酶基因以及通过定点突变或以随机突变的方式改造甲壳素酶的底物结合结构域和催化结构域以提高酶活，但是，在大肠杆菌中异源表达甲壳素酶基因易形成包涵体；在大肠杆菌以及毕赤酵母中异源表达甲壳素酶基因时，甲壳素酶为胞内分泌，因此，提取甲壳素酶需破壁导致酶活损失；在毕赤酵母中异源表达甲壳素酶基因操作复杂、培养周期长；以随机突变的方式改造甲壳素酶的底物结合结构域和催化结构域以提高酶活具有随机突变的不确定性，因此，会导致的筛选困难，上述技术均并不能够真正运用于工业生产。
因此，急需找到一种新的可克服表达量低、易形成包涵体、破壁导致酶活损失等缺陷且可大幅度提高甲壳素酶表达量的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种提高甲壳素酶表达量的方法。此方法为先将信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ的基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因N端，然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达，以提高甲壳素酶的表达量；将利用此方法得到的重组菌发酵12h，可使得发酵上清液中的甲壳素酶酶活提高至20.62U/mL(胞外酶活)，是野生型菌株发酵的将近15倍。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种提高甲壳素酶表达量的方法，所述方法为先将外源信号肽基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因(chisb)N端；然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达；
所述外源信号肽为信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将甲壳素酶基因的自身信号肽基因切除，得到缺失自身信号肽的甲壳素酶基因(chisb-sp)；然后将外源信号肽基因融合至缺失自身信号肽的甲壳素酶基因的N端，得到融合基因；然后将融合基因与表达载体相连接，得到重组载体；最后将重组载体转化至表达宿主中进行表达。
在本发明的一种实施方式中，所述外源信号肽来源于枯草芽孢杆菌168。
在本发明的一种实施方式中，编码所述外源信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。
在本发明的一种实施方式中，所述甲壳素酶来源于Bacillus sp.DAU101。
在本发明的一种实施方式中，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.11。
在本发明的一种实施方式中，编码所述甲壳素酶自身信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pP43NMK。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌WB600。
本发明提供了一种可高效表达甲壳素酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒以及表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因；
所述外源信号肽为NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ。
在本发明的一种实施方式中，所述融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因是通过先将甲壳素酶基因的自身信号肽基因切除，然后将外源信号肽基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因的N端得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述外源信号肽来源于枯草芽孢杆菌168。
在本发明的一种实施方式中，编码所述外源信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。
在本发明的一种实施方式中，所述甲壳素酶来源于Bacillus sp.DAU101。
在本发明的一种实施方式中，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.11。
在本发明的一种实施方式中，编码所述甲壳素酶自身信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pP43NMK。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为枯草芽孢杆菌WB600。
本发明提供了上述一种提高甲壳素酶表达量的方法或上述一种可高效表达甲壳素酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌在制备甲壳素酶方面的应用。
有益效果：
(1)本发明通过先将信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ的基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因N端，然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达，成功将甲壳素酶的表达量提高至野生型菌株发酵的将近15倍；
(2)将本发明的重组枯草芽孢杆菌重组菌发酵12h，可使得发酵上清液中的甲壳素酶酶活提高至20.62U/mL，是野生型菌株发酵的将近15倍；
(3)本发明实现了甲壳素酶在食品级安全菌株-枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，在工业生产中具有巨大的应用前景。
附图说明
图1：融合表达不同信号肽对甲壳素酶酶活的影响；
图2：融合表达不同信号肽的甲壳素酶重组菌株蛋白电泳图；
其中，M：Marker、1：pP43NMK、2：pP43NMK-YweA、3：pP43NMK-AmyE、4：pP43NMK-AprE、5：pP43NMK-Bpr、6：pP43NMK-NprB、7：pP43NMK-Epr、8：pP43NMK-LipA、9：pP43NMK-Vpr、10：pP43NMK-BglS、11：pP43NMK-YclQ。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。
TB培养基：蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油5g/L、KH2PO4 17mmol/L、K2HPO472mmol/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
甲壳素酶酶活检测方法(分光光度法)：
酶活测定条件：60℃条件下，0.1mL 1％的胶体几丁质，0.3mL磷酸氢二钠-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)和0.1mL发酵上清液，保温15min，100℃加热5min终止反应，加入1mLDNS试剂，沸水浴加热10min后迅速冷却，用去离子水定容至5mL。利用分光光度计在540nm处测定吸光值，通过GlcNAc绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。
1个单位甲壳素酶酶活定义为：在60℃反应条件下，每小时释放1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U/mL)。
实施例1：构建重组菌
具体步骤如下：
(1)以枯草芽孢杆菌168为模板，分别以NprB-F、NprB-R、AmyE-F、AmyE-R、AprE-F、AprE-R、Bpr-F、Bpr-R、BglS-F、BglS-R、Epr-F、Epr-R、LipA-F、LipA-R、Vpr-F、Vpr-R、YclQ-F、YclQ-R、YweA-F、YweA-R作为正反向引物(见表1-2)，通过PCR扩增出10条信号肽片段：NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA、YclQ；PCR反应条件为：98℃3min，30个循环(98℃30s、55℃30s、72℃30s)，72℃5min；
(2)以pP43NMK-chisb(chisb基因由无锡天霖生物有限责任公司合成，并提供该构建好的质粒)为模板，以p43-F、p43-R作为正反向引物(见表1-2)，通过全质粒PCR扩增出含有N-末端缺失自身信号肽基因的甲壳素酶基因的线性化载体片段；PCR反应条件为：98℃5min，25个循环(98℃10s、55℃15s、72℃4min30s)，72℃5min；
(3)以pP43NMK-chisb为模板，以chisb-sp-F和chisb-sp-R为正反向引物(见表1-2)，通过全质粒PCR扩增出含有N-末端缺失自身信号肽基因的甲壳素酶基因的线性化重组质粒，即pP43NMK-chisb-sp；PCR反应条件为：98℃5min，25个循环(98℃10s、55℃15s、72℃4min30s)，72℃5min；
(4)将(1)、(2)得到的扩增产物经电泳检验后，采用胶回收试剂盒进行纯化和回收；
(5)通过一步克隆试剂盒(clonExpressTM One Step Cloning Kit(VazymeBiotech Co.,Ltd.Nanjing,China))将(4)回收得到的10条信号肽片段分别与线性化载体进行融合，得到含有不同外源信号肽的重组质粒pP43NMK-NprB、pP43NMK-AmyE、pP43NMK-AprE、pP43NMK-BglS、pP43NMK-Bpr、pP43NMK-Epr、pP43NMK-LipA、pP43NMK-Vpr、pP43NMK-YweA和pP43NMK-YclQ；
(6)将(5)融合的重组质粒转化至感受态E.coli JM109，用氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后提取质粒，转化子由苏州金维智进行测序；
(7)将(6)测序正确的重组质粒，转化至枯草芽孢杆菌WB600，获得含有不同信号肽基因的高产甲壳素酶重组菌；
(8)将(3)得到的扩增产物经电泳检验后，采用胶回收试剂盒进行纯化和回收；
(9)将(8)回收得到的重组质粒转化至感受态E.coli JM109，用氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落，37℃摇床过夜培养后提取质粒，转化子由苏州金维智进行测序；
(10)将(9)测序正确的重组质粒，转化至枯草芽孢杆菌WB600，得到含有切除甲壳素酶基因自身信号肽的甲壳素酶基因重组菌株；
其中，PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，primeSTARMAX DNA聚合酶25μL，灭菌ddH2O 22μL。
表1引物序列
Figure BDA0001798938040000051
表2引物序列
Figure BDA0001798938040000052
Figure BDA0001798938040000061
实施例2：高产甲壳素酶重组菌的验证
具体步骤如下：
将实施例1中测序正确的含有不同外源信号肽的质粒重组质粒pP43NMK-NprB、pP43NMK-AmyE、pP43NMK-AprE、pP43NMK-BglS、pP43NMK-Bpr、pP43NMK-Epr、pP43NMK-LipA、pP43NMK-Vpr、pP43NMK-YweA和pP43NMK-YclQ分别转化枯草芽孢杆菌WB600，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养8h，转接到TB培养基中，接种量为2％，培养12h，收集发酵液上清，检测发酵上清酶活；同时采用超声破碎的方法对细胞进行破壁后，检测胞内酶活。
结果如图1所示(以空质粒pP43NMK、重组质粒pP43NMK-chisb、重组质粒pP43NMK-chisb-sp为对照)。
实验结果表明：含有重组质粒pP43NMK-chisb-sp的重组菌株胞外无酶活，而含有重组质粒pP43NMK-chisb的重组菌株显示出很低的胞外酶活，仅有1.38U/mL，且这两个两个重组菌株的胞内酶活都为0.72U/mL；而融合了不同信号肽的重组菌株与出发菌株相比，除YclQ信号肽，胞外酶活力均有显著提高，融合了信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA的重组菌胞外酶活力分别为20.62、7.33、3.03、15.42、2.27、16.93、18.7、18.45、14.44U/mL，其中融合表达了信号肽NprB的重组菌pP43NMK-NprB的甲壳素酶活力较其他菌株提高近15倍；而融合YclQ信号肽的重组菌株胞外未检测到酶活，胞内酶活为3.87U/mL，是所有重组菌株中胞内酶活最高的。
实施例3：融合表达不同信号肽的甲壳素酶生产菌株蛋白电泳验证
取实施例2中的发酵上清，分别对含有不同信号肽的重组菌株进行蛋白样品处理，体系：30μL发酵上清，10μL 4×蛋白上样缓冲液，99℃，10min，然后进行蛋白电泳。通过染色、脱色等过程，结果如图2所示。
结果显示：融合了不同信号肽的重组菌其条带都明显加粗，表明甲壳素酶的产量明显增加，同时发现，融合YclQ信号肽的重组菌株pP43NMK-YclQ没有蛋白条带显示，表明其没有将甲壳素酶分泌到胞外的能力。而融合NprB信号肽的重组菌株pP43NMK-NprB蛋白条带最粗。综上，融合信号肽可以有效促进甲壳素酶的分泌。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种提高甲壳素酶表达量的方法
<160> 36
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
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cctgctgata acggtgagta tcagaagtgt ggtccagtaa aagagggtac ctgggaaaaa 1080
ggagtgttcg atttttctga tttggagaag aactatatca acaaaaatgg ctataagcgc 1140
tactggaacg atcgggcaaa ggttccgttc ttatataacg ctgagaacgg gaactttatt 1200
acctatgacg atgaggaaag ctatggctac aagacggact tgatccaatc aaacggactg 1260
tccggggcga tgttttggga tttctcagga gatagcaacc agaccttact taacaaatta 1320
gccgctgatt tgggatttgc tccgggcggt ggtaatcctg aaccgccagc aagtgcacct 1380
gggaatctcc gtgtcacaga gaagacagcc acttctatca gtcttgtttg ggacgctcca 1440
agtgatgggg ctaacatagc cgagtacgta ttatcttacg agggtggagc tgtgagcgtt 1500
aaggacacat cagctacaat aggtcagctg aaacctaata caacgtactc ttttactgtc 1560
tcagccaaag atgctgatgg gaagctgcac acggggccga cgatcgaagc caccactaac 1620
tcagatcaga cctgtggcta taatgaatgg aaggatactg cagtttacac cgggggtgat 1680
agagttgtct ttaacggaaa agtgtacgaa gccaagtggt ggacaaaggg agaacagcct 1740
gaccaggctg gcgagtcagg cgtttggaag ttaataggcg actgcaagta a 1791
<210> 12
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgaagaagg ttttctcaaa caagaagttt ttagttttct cttttatttt cgcaatgatt 60
cttagtctta gtttcttcaa cggcgaatca gctaaagcc 99
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggtaagagag gaatgtacac atgcgcaact tgaccaagac a 41
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttataagact tgtcggaact agctgaggca tgtgttacaa aaac 44
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggtaagagag gaatgtacac atgtttgcaa aacgattcaa aacctc 46
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cttataagac ttgtcggaac tagcactcgc agccgccgg 39
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggtaagagag gaatgtacac gtgagaagca aaaaattgtg gatcag 46
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cttataagac ttgtcggaac tagcactcgc agccgccgg 39
<210> 19
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggtaagagag gaatgtacac atgaggaaaa aaacgaaaaa cagactc 47
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cttataagac ttgtcggaac ttgccccggc tgctcccg 38
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggtaagagag gaatgtacac atgccttatc tgaaacgagt gttg 44
<210> 22
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cttataagac ttgtcggaac tagctgaggc agtagcagtg actg 44
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggtaagagag gaatgtacac atgaaaaaca tgtcttgcaa acttgt 46
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cttataagac ttgtcggaac tcgcatgagc gagagggcct at 42
<210> 25
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ggtaagagag gaatgtacac atgaaatttg taaaaagaag gatcattgc 49
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cttataagac ttgtcggaac tggcttttgc tgacggctg 39
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ggtaagagag gaatgtacac atgaaaaagg ggatcattcg c 41
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cttataagac ttgtcggaac ttgcctgaac gcccgtaatg 40
<210> 29
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ggtaagagag gaatgtacac atgaaaaagt tcgcgttact attca 45
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cttataagac ttgtcggaac tacctttgct gcttgtgctt tg 42
<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ggtaagagag gaatgtacac atgctaaaaa gaacttcatt cgtatctt 48
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cttataagac ttgtcggaac ttgcatgagc ttggcccga 39
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
agttccgaca agtcttataa gataatagg 29
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtgtacattc ctctcttacc tataatggt 29
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
agttccgaca agtcttataa gataataggt tattacc 37
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
atcttataag acttgtcgga actagctgag gcatgtgtta caaaaaccat 50

Claims (21)

1.一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，所述方法为先将外源信号肽基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因(chisb)N端；然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达；
所述外源信号肽为信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ；
所述表达宿主为枯草芽孢杆菌。
2.如权利要求1所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，所述方法为先将甲壳素酶基因的自身信号肽基因切除，得到缺失自身信号肽的甲壳素酶基因(chisb-sp)；然后将外源信号肽基因融合至缺失自身信号肽的甲壳素酶基因的N端，得到融合基因；然后将融合基因与表达载体相连接，得到重组载体；最后将重组载体转化至表达宿主中进行表达。
3.如权利要求1所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述外源信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。
4.如权利要求2所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述外源信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。
5.如权利要求1所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，所述甲壳素酶来源于Bacillus sp.DAU101。
6.如权利要求2所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，所述甲壳素酶来源于Bacillus sp.DAU101。
7.如权利要求3所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，所述甲壳素酶来源于Bacillus sp.DAU101。
8.如权利要求4所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，所述甲壳素酶来源于Bacillus sp.DAU101。
9.如权利要求1所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
10.如权利要求2所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
11.如权利要求3所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
12.如权利要求4所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
13.如权利要求5所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
14.如权利要求6所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
15.如权利要求7所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
16.如权利要求8所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11。
17.如权利要求1-16任一所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法，其特征在于，编码所述甲壳素酶自身信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。
18.一种可高效表达甲壳素酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌包含重组质粒以及表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因；
所述外源信号肽为NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ。
19.如权利要求18所述的一种可高效表达甲壳素酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因是通过先将甲壳素酶基因的自身信号肽基因切除，然后将外源信号肽基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因的N端得到的。
20.如权利要求18或19所述的一种可高效表达甲壳素酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，编码所述外源信号肽的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10。
21.权利要求1-17任一所述的一种提高甲壳素酶表达量的方法或权利要求18-20任一所述的一种可高效表达甲壳素酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌在制备甲壳素酶方面的应用。
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