JP2011529336A - ポリペプチドを産生及び分泌させるための構築物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの親水性ドメインと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
キャリアドメインと対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、及び
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、
をこの特定の順番で含むポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を提供する。
少なくとも1つの好適なシグナルペプチド、
セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュールと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、及び
キャリアドメインと対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、
を(より具体的にはこの順番で)含む、ポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を提供する。
本明細書で使用されるように、単数形(singular forms "a",
"an", and "the")は文脈が別途はっきりと示していなければ、単数及び複数の指示対象(referents)両方を包含する。例えば、「細胞(a cell)」は1つ又は2つ以上の細胞を表す。
"comprises")」及び「から構成される(comprised of)」という用語は、「を含む("including","includes")」又は「を含有する("containing","contains")」と同じ意味であり、また包括的であるか又は制約がなく、付加的な列挙されていない成員、要素又は方法工程も排除されない。
第1の態様において、本発明は、宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞による対象となるポリペプチドの産生及び分泌を容易にするための融合タンパク質をコードするポリ核酸、並びにそれらの様々な使用に関する。具体的には、本明細書に規定のような融合タンパク質をコードするポリ核酸により、宿主細胞によるポリペプチドの効率的な産生及びその細胞外送達が可能になることが分かっている。
セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュール又は親水性モジュールと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、及び
キャリアドメインと対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、
を含むポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を提供する。
好適な分泌シグナルペプチド、
セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュール又は親水性モジュールと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、及び
キャリアドメインと対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、
を含むポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を提供する。
i)少なくとも1つの好適な分泌シグナルペプチド、
ii)セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)、
iii)上記CBM(i)と融合する、セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュール又は親水性モジュール、
iv)少なくとも1つの対象となるポリペプチド、及び
v)Xモジュール又は親水性モジュール(ii)と対象となるポリペプチド(iii)とを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、
を含むポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を提供する。
好適な分泌シグナルペプチド、
セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュール又は親水性モジュールと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、及び
キャリアドメインと対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、
を含むポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を提供する。
i)セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)、
ii)上記CBM(i)と融合する、セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュール又は親水性モジュール、
iii)少なくとも1つのシグナルペプチド、例えば細菌足場タンパク質由来のシグナルペプチド、
iv)少なくとも1つの対象となるポリペプチド、及び
v)Xモジュール又は親水性モジュール(ii)と対象となるポリペプチド(iii)とを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、
を含むポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を提供する。
別の態様において、本発明は本発明によるポリ核酸によってコードされた融合タンパク質に関する。
好ましくはセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの親水性ドメインと融合した、セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、及び
少なくとも1つの対象となるポリペプチドを含む機能的ドメイン、
を含む、ポリペプチド配列から成る。
好適なシグナルペプチド配列、
好ましくはセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの親水性ドメインと融合した、セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、及び
少なくとも1つの対象となるポリペプチドを含む機能的ドメイン、
を含む、ポリペプチド配列から成る。
キャリアドメインにおける、又は本発明による融合タンパク質における第1のモジュールは炭水化物結合モジュールを含む。
本発明による融合タンパク質の別のモジュールは、少なくとも1つのXモジュール、より具体的には親水性モジュール、好ましくはセルロソーム足場タンパク質の親水性モジュールを含む。
特定の実施形態において、本発明による対象となるポリペプチドの分泌を確実にする、キャリアドメインを含む融合タンパク質は分泌シグナル配列をコードする配列をさらに含む。本発明のこれらの実施形態による構築物では、この分泌シグナル配列は、シグナル配列及び対象となるポリペプチドが操作可能に連結する、より具体的には共有結合的に連結するように、構築物の他の配列の1つ、すなわちCBMドメインをコードする配列、Xモジュール、又は対象となるポリペプチドをコードする配列のいずれかと連結する。これに関して、「操作可能に連結した」は、発現の際にシグナルペプチドがこのようにこの配列と連結したポリペプチドの分泌を容易にするように、シグナル配列をコードする配列及び分泌されるポリペプチドをコードする配列がフレーム内又はフェーズ内で接続されることを示す。
本発明の融合タンパク質又は本発明によるその機能的ドメインは、構築物によって産生及び分泌される対象となるタンパク質、並びに本明細書で与えられるような方法をさらに含む。本明細書で規定のような好ましくは細菌の宿主によって産生及び分泌されるタンパク質は任意の対象となるタンパク質であり得る。好ましい実施形態では、このタンパク質は、異種、すなわち宿主とは種が異なる(heterologous)タンパク質である。代替的に、タンパク質は同種である。
Cel48F、Cel9G、Cel9R、Cel9P、Cel9E、Cel9H、Cel9J、Cel9M、Cel8C、Cel5N及びCel5Aを含む群から選択されるクロストリジウム・セルロリティカムのセルラーゼ、
Cel9D、Cel9J、CBH9A、Cel9H、Cel9K、Cel5E、Cel48S、Cel9F、Cel9N、Cel9Q、Cel5O、Cel5B、Cel5G、Cel8A、Cel5C及びCel9Iを含む群から選択されるクロストリジウム・サーモセラム(C. thermocellum)のセルラーゼ、
Cel48A、Cel9G、Cel9R、Cel9P、Cel9E、Cel9H、Cel9J、Cel9M及びCel5Aを含む群から選択されるクロストリジウム・アセトブチリカムのセルラーゼ、
Cel9A、Cel9B、Cel5J、Cel5I、Cel5F、Cel5H、Cel5D、Cel5B、Cel9G、Cel5E、Cel5A、Cel5C及びCel6Aを含む群から選択されるサッカロファゴス・デグラダンス2−40株のセルラーゼ、
Acla等のシュードモナス(Pseudomonas)種ND137由来の推定セルラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本発明による融合タンパク質は通常、タンパク質のキャリアドメインと、対象となる機能的ドメイン又はポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカーから成る、別のモジュールを含む。
本発明のさらなる態様によれば、宿主細胞、好ましくは細菌細胞への導入、及び/又は本発明による融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の発現、及び/又は維持を容易にするために発現構築物が与えられる。発現構築物を商業的に利用可能であり得るプラスミド又はベクターに挿入してもよい。
一態様によれば、本発明は、本明細書で規定のようなポリ核酸又はベクターを含む宿主細胞に関する。
別の態様において、本願は、宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞により、生物学的に活性のある形態で少なくとも1つの対象となる異種ポリペプチド又は同種ポリペプチドを産生及び分泌させる方法であって、本発明によるポリ核酸又はベクターを、コードされた融合タンパク質の発現を引き起こすのに効果的な条件下で上記宿主細胞に導入することを含み、コードされた融合タンパク質を、宿主細胞によって上記宿主細胞の環境に分泌させる、方法に関する。
一実施形態において、対象となるポリペプチドは本明細書で規定のような酵素である。このような実施形態では、本発明は、本発明による融合タンパク質の様々な非治療的使用に関する。
本発明のさらなる態様は、本発明によるキャリア構築物及びキャリア構築物を含む宿主細胞の治療的適用に関する。
本実施例は、本発明に従う、クロストリジウム・アセトブチリカムによる対象となるポリペプチド、特にセルラーゼの分泌を示している。様々な構築物を作製し、これらの中で最も関連のあるものを図1で概略的に示す。
これは、本発明に従う、クロストリジウム・アセトブチリカムによる対象となるポリペプチド、特にセルラーゼの分泌を示す別の例である。様々な構築物を作製し、図1(下部パネル)に概略的に示す、ここでは異なる足場タンパク質から得られたモジュールを使用した。
これは、本発明に従う、クロストリジウム・アセトブチリカムによる対象となるポリペプチド、特にサッカロファゴス・デグラダンス由来のセルラーゼの分泌を示す別の例である。様々な構築物を作製し、図2に概略的に示す、ここでは異なる足場タンパク質から得られたモジュールを使用した。
分子生物学技法を使用して、実施例2及び実施例3に記載の異なるタンパク質構築物をコードするDNAを増幅し、大腸菌発現ベクターにクローニングした(pET22b(+)、Novagen)。得られたベクターを、大腸菌株BL21(DE3)(Novagen)を形質転換するのに使用した。全ての場合で、6つのHisコドンを組換えタンパク質のC末端でグラフト化し(grafted)、ニッケル樹脂(Ni−NTA、Qiagen)上でのそれらの精製を容易にした。
これは、本発明に従う、クロストリジウム・アセトブチリカムによる対象となるポリペプチド、特にラット由来の治療用タンパク質インターロイキン2の分泌を示す別の例である。様々な構築物を作製するが、ここでは異なる足場タンパク質から得られたモジュールを使用する。
Claims (18)
- 少なくとも1つのシグナルペプチド、
セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュールと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、及び
該キャリアドメインと該対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、
をこの順番で含むポリペプチド配列から成る、融合タンパク質をコードするポリ核酸を含む組換え微生物であって、前記対象となるポリペプチドを分泌する、組換え微生物。 - クロストリジウム綱由来である、請求項1に記載の組換え微生物。
- 前記ポリペプチド配列が2つ以上のXモジュールを含む、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
- 前記セルロソーム足場タンパク質の前記シグナルペプチドが、クロストリジウム・セルロリティカムのCipC足場タンパク質のシグナルペプチド、又はクロストリジウム・アセトブチリカムのCipA足場タンパク質のシグナルペプチドである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記少なくとも1つの炭水化物結合モジュールが3a型の炭水化物結合モジュール(CBM3a)である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記少なくとも1つのXモジュールがクロストリジウム・セルロリティカムのCipC足場タンパク質のX2モジュール、又はクロストリジウム・アセトブチリカムのCipA足場タンパク質のX2モジュールである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記少なくとも1つの対象となるポリペプチドが細胞壁分解酵素である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記少なくとも1つの対象となるポリペプチドがセルラーゼである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記酵素がクロストリジウム・セルロリティカムのセルラーゼである、請求項8に記載の組換え微生物。
- 前記酵素がCel48F又はCel9Gである、請求項8に記載の組換え微生物。
- 前記酵素がサッカロファゴス・デグラダンス2−40株のセルラーゼCel5Hである、請求項8に記載の組換え微生物。
- 前記少なくとも1つの対象となるポリペプチドが治療用酵素、サイトカイン及び抗体を含む群から選択される治療用タンパク質である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記治療用タンパク質がIL−2である、請求項12に記載の組換え微生物。
- 前記微生物がクロストリジウム・アセトブチリカム及びクロストリジウム・ベイジェリンキを含む群から選択されるクロストリジウム株由来である、請求項2に記載の組換え微生物。
- 組換え微生物によって、少なくとも1つの対象となる異種ポリペプチド又は同種ポリペプチドを産生及び分泌させる方法であって、
セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュールと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、
該キャリアドメインと該対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、及び
少なくとも1つのシグナルペプチド、
を含むポリペプチド配列から成る融合タンパク質をコードするポリ核酸を、コードされた融合タンパク質の発現を引き起こすのに効果的な条件下で前記微生物に導入することを含み、該コードされた融合タンパク質を該組換え微生物によって前記組換え微生物の環境に分泌させる、方法。 - 前記組換え微生物がクロストリジウム綱の微生物である、請求項15に記載の方法。
- セルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つのXモジュールと融合したセルロソーム足場タンパク質の少なくとも1つの炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキャリアドメイン、
少なくとも1つの対象となるポリペプチド、
該キャリアドメインと該対象となるポリペプチドとを連結するための少なくとも1つのペプチドリンカー、及び
少なくとも1つのシグナルペプチド、
を含むポリペプチド配列から成る融合タンパク質をコードするポリ核酸。 - 前記ポリペプチド配列が2つ以上のXモジュールを含む、請求項17に記載のポリ核酸。
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