WO2015147318A1 - アルコールの製造方法 - Google Patents

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cbpa
clostridium
transformant
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三宅　英雄
浩 田丸
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国立大学法人三重大学
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    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a cellulosome expression plasmid, a microorganism transformed with the plasmid, and a method for producing alcohol using the microorganism. More specifically, the present invention relates to a plasmid for expressing cellulosome capable of directly saccharifying cellulosic biomass. The present invention also relates to a method for producing an alcohol such as butanol by obtaining a transformant of a microorganism capable of alcohol fermentation using the plasmid.
  • CBP Consolidated Bio-Processing
  • Clostridium cellulovorans an anaerobic mesophilic bacterium, was reported as a microorganism capable of directly degrading soft biomass such as rice straw (Non-patent Document 2). Thereafter, it was confirmed that Clostridium cellulovorans produces a superprotein complex called “cellulosome” (Non-patent Document 3).
  • Cellulosome is a superprotein complex in which an enzyme such as cellulase or hemicellulase is loaded on a cellulosome skeleton protein, and soft biomass is efficiently decomposed by combining enzymes according to the substrate (Non-patent Document 4).
  • the present inventors have decoded the entire gene information of Clostridium cellulovorans by genome-wide analysis (Non-patent Document 5), and based on this result, cellulosome skeletal protein that is the basis of cellulosome, cellulase that can interact with cellulosome skeleton protein Completed identification and classification of enzymes and proteins, such as hemicellulase, and non-cellulosome, a secreted carbohydrate-related enzyme. Information on cellulosomes and noncellulosomes according to the substrate is also obtained from the results of proteome analysis (Non-Patent Documents 6 to 8).
  • CbpA Cellulose binding protein (hereinafter sometimes simply referred to as CbpA)
  • CBM Cellulose binding protein
  • SSH surface homology domains
  • 9 cohesin domains that bind to the dockrin domain of the enzyme that makes up the cellulosome.
  • CBM Cellulose binding protein
  • SSH surface homology domains
  • Clostridium cellulovorans which form cellulosomes to decompose lignocellulose, and produce alcohols such as butanol and ethanol, and organic solvents such as acetone.
  • Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii are known as butanol producing bacteria, and acetone / butanol / ethanol (ABE) fermentation by these microorganisms is practically used after ethanol fermentation using yeast.
  • Non-Patent Document 10 Acetone and butanol production by ABE fermentation has declined as cheap synthetic alcohols have become popular by chemical synthesis, but in recent years, due to problems such as soaring fossil fuels and global warming, it has attracted worldwide attention again in recent years.
  • Patent Document 1 discloses that a microorganism belonging to the genus Clostridium such as Clostridium acetobutylicum or Clostridium begerinki is used as a substrate in order to obtain butanol efficiently. Disclosed is a method for culturing in a medium. Patent Document 2 discloses that n-butanol is biologically produced in high yield by culturing a microorganism belonging to the genus Clostridium in which a gene such as a gene encoding phosphotransbutylylase involved in butyric acid formation has been deleted. A method of manufacturing is disclosed.
  • Patent Document 3 is not directly involved in alcohol production, but as a recombinant microorganism containing a polynucleic acid encoding a fusion protein such as a cellulosic scaffold protein, a microorganism belonging to the genus Clostridium is obtained, and a heterologous cellulase is obtained. A method for secretion is disclosed.
  • Patent Document 4 discloses a method for recovering organic components such as 1-butanol and 2-butanol obtained by culturing microorganisms belonging to the genus Clostridium at a high concentration through a specific step. ing.
  • Patent Document 5 discloses a gene encoding a cellulosome-constituting protein derived from Clostridium cellulolyticum (Cel5A gene or Cel9M gene), a gene encoding pyruvate decarboxylase (PDC), alcohol dehydrogenase (ADH1), or the like. It discloses a method of producing ethanol using glucose or cellulose as a substrate by obtaining an incorporated Clostridium acetobutylicum and culturing the same. This method also relates to a method for producing alcohol using a Clostridium microorganism transformed with a cellulosome expression plasmid.
  • Patent No. 4665066 Japanese translation of PCT publication 2010-508017 Special table 2011-529336 gazette Special table 2013-513394 gazette International Publication No. 2010/063766 Pamphlet
  • This invention makes it a subject to provide a more useful method with respect to the prior art in biofuel manufacture.
  • the present inventor constructed a cellulosome expression plasmid, obtained a microorganism transformed with the plasmid, and cultured it to further improve the conventional technology.
  • the inventors have found that a useful method for producing alcohol can be provided, and have completed the present invention.
  • the plasmid constructed according to the present invention is a plasmid for expressing cellulosome capable of directly saccharifying cellulosic biomass.
  • the microorganism can be cultured. It is possible to improve the production efficiency of alcohol such as ethanol and butanol.
  • the present invention relates to an alcohol production method shown in the following (1) to (9).
  • a method for producing alcohol from a substrate comprising a step of culturing the transformant according to any one of (4) to (6) above.
  • the method for producing an alcohol according to the above (7), wherein the substrate is cellulosic biomass.
  • the method for producing alcohol according to (8) above, wherein the cellulosic biomass is locust bean gum, rice straw, bagasse, corn stover, switchgrass, poplar, or plant residue.
  • Example 1 It is the figure which showed the gene expression level of the cellulosome related gene and the non-cellulosome related gene (Example 1). It is the figure which showed the promoter region and signal peptide region in the base sequence of a cbpA gene (Example 1). (Example 1) which showed the map of pMTL500E-cbpA-ManA. In the transformant, it is the figure which confirmed the presence or absence of insertion of the introduced gene (Example 2). It is the figure which confirmed the enzyme activity of the transformant (Example 2). (Example 3) which is the figure after the culture
  • LBG locust bean gum
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of LBG degradation by CbpA-ManA transformant Clostridium Beigelinki (Example 3).
  • the “cellulosome expression plasmid” of the present invention refers to a plasmid that can impart cellulosome and give cellulosome expression ability to the microorganism by introduction into the microorganism.
  • the “cellulosome expression plasmid” of the present invention only needs to contain a gene capable of constructing a cellulosome. Examples of such a gene include a cellulosome-related gene such as a gene encoding a cellulosome skeleton protein and a gene encoding an enzyme such as cellulase or hemicellulase that interacts with the cellulosome skeleton protein. These cellulosome-related genes may be any conventionally known genes.
  • Examples of the gene contained in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention include cbpA gene and hbpA gene encoding cellulosome skeletal protein.
  • Examples of the cbpA gene include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. If the cbpA gene can act in the same manner as the cbpA gene, it has 85% or more identity to the nucleotide sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1.
  • a base sequence having 90% or higher identity or a base sequence having 95% or higher identity can also be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • the “cellulosome expression plasmid” of the present invention does not have to include the entire base sequence shown as the cbpA gene, and may contain at least the promoter region of the cbpA gene shown in SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing. Further, if it can act in the same manner as the promoter region of the cbpA gene, a base sequence having 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a base sequence having 90% or more identity, Those represented by a base sequence having 95% or more identity can also be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • the “cellulosome expression plasmid” of the present invention preferably contains a region encoding the signal peptide of the cbpA gene shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing in addition to the promoter region of the cbpA gene. Further, if it can act in the same manner as the signal peptide of the cbpA gene, a nucleotide sequence having 85% or more identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, a nucleotide sequence having 90% or more identity, Those represented by a base sequence having 95% or more identity can also be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • the “cellulosome expression plasmid” of the present invention further includes a cbpA gene coding region shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. preferable. If it can act in the same manner as the coding region of the cbpA gene, a nucleotide sequence having 85% or more identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing, a nucleotide sequence having 90% or more identity, or 95% What is shown by the base sequence which has the above identity can also be contained in the "cellulosome expression plasmid" of this invention.
  • Examples of the hbpA gene encoding the cellulosome skeleton protein include the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing. Further, if it can act in the same manner as the hbpA gene, a base sequence having 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, a base sequence having 90% or more identity, or 95% or more Those represented by nucleotide sequences having the same identity can be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • examples of the gene included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention include, for example, exgS gene, engH gene, engK gene, engL gene, engM gene, etc. encoding enzymes such as cellulase and hemicellulase that interact with cellulosome skeletal proteins. Is mentioned. Further, the “cellulosome expression plasmid” of the present invention may contain a manA gene, a manB gene and the like encoding other enzymes such as mannanase. As this exgS gene, the base sequence shown by sequence number 5 of a sequence table is mentioned.
  • a base sequence having 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing a base sequence having 90% or more identity, or 95% or more Those represented by nucleotide sequences having the same identity can be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • Examples of the engH gene include the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • a base sequence having 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing a base sequence having 90% or more identity, or 95% or more Those represented by nucleotide sequences having the same identity can be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • examples of the engK gene include the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing. Moreover, if it can act similarly to the engK gene, a base sequence having 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, a base sequence having 90% or more identity, or 95% or more Those represented by nucleotide sequences having the same identity can be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention. Examples of the engL gene include the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • a base sequence having 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing a base sequence having 90% or more identity, or 95% or more Those represented by nucleotide sequences having the same identity can be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • manA gene as a gene encoding mannanase.
  • examples of the manA gene include the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing. Further, if it can act in the same manner as the manA gene, a base sequence having 85% or more identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing, a base sequence having 90% or more identity, or 95% or more Those represented by nucleotide sequences having the same identity can be included in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention.
  • the “cellulosome expression plasmid” of the present invention is a gene encoding these cellulosome skeletal proteins, a gene encoding an enzyme such as cellulase or hemicellulase that interacts with the cellulosome skeletal proteins, and the like, as long as cellulosome can be constructed. Two or more genes encoding these enzymes can be included in combination.
  • the “cellulosome expression plasmid” of the present invention is constructed by incorporating the promoter region of the cbpA gene or the promoter region of the cbpA gene and the region encoding the signal peptide of the cbpA gene into a vector for expressing the cellulosome in a microorganism. Can do.
  • a gene encoding a cellulosome backbone protein a gene encoding an enzyme such as cellulase or hemicellulase that interacts with the cellulosome backbone protein, or a gene encoding another enzyme. They may be combined and incorporated.
  • the vector used in the “cellulosome expression plasmid” of the present invention may be any conventionally known vector, for example, E. coli known as a host-vector system for butanol-producing bacteria. coli-C.
  • An acetobutylicum shuttle vector (reference documents 1 and 2), a pMTL500E vector (reference document 3), a pMTL80000 vector (reference document 4), and the like can be used.
  • Reference 1 Tummala, S. B., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (1999) Development and characterization of a gene expression reporter system for Clostridium acetobutylicum ATCC 824.
  • AMB Express 2 45 Reference 3: Oultram, JD, Loughlin, M., Swinfield, TJ., Brehm, JK, Thompson, DE, Minton, NP (1988) Introduction of plasmids into whole cells of Clostridium acetobutylicum by electroporation. FEMS Microbiol. Letters 56: 83-88
  • the pMTL500E vector is combined with the promoter region of the cbpA gene, the region encoding the signal peptide of the cbpA gene and the coding region of the cbpA gene, and further combined with the hbpA gene, exgS gene, engH
  • Examples include pMTL500E-cbpA-ManA in which a gene, an engK gene, an engL gene, and a manA gene are combined.
  • the integration method of these genes into a vector may be any conventionally known method.
  • the “transformant” of the present invention refers to a microorganism that has been given cellulosome by introducing the “cellulosome expression plasmid” of the present invention into the microorganism.
  • the microorganism that imparts cellulosome may be any conventionally known microorganism, but is preferably a microorganism that is capable of producing alcohols such as ethanol and butanol and is useful for the production of biomass fuel. Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Clostridium useful for the production of biomass fuel, and examples of microorganisms belonging to the genus Clostridium include Clostridium Begelinki and Clostridium acetobutylicum. Yeast may be used as a “transformant”.
  • the “method for producing alcohol” of the present invention refers to a method for producing ethanol and / or butanol from a substrate by including a step of culturing the “transformant” of the present invention in a medium containing the substrate.
  • a substrate is cellulosic biomass.
  • the cellulosic biomass of the present invention include locust bean gum, rice straw, bacchus, corn stover, switchgrass, poplar or plant residue.
  • Example 1 Construction of plasmid Examination of promoters by RNA-Seq analysis 1) In a medium (see Non-Patent Document 2) using six types of sugars, carbon, cellobiose, carboxymethylcellulose (CMC), xylan, locust bean gum (LBG), and pectin as carbon sources Clostridial cellulovorans were cultured, and total RNA was extracted in the middle of the logarithmic growth phase. Thereafter, preparation of mRNA-Seq library and normalization by DSN treatment to reduce the amount of rRNA were carried out, and then subjected to HiSeq 2000 (Illumina) which is a next-generation sequencer.
  • HiSeq 2000 Illumina
  • the read sequence obtained from the sequence was mapped to the genome sequence, and the expression level of each gene was determined by calculating the unit (RPKM) normalized by the length of the gene and the read amount (Reference Document 5).
  • Reference 5 Mortazavi, A ,. Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods., 5, 621-628
  • FIG. 1 shows the expression levels of all cellulosome-related genes and non-cellulosome-related genes.
  • cellulosome-related genes having a gene expression level [log2 (RPKM)] of 3.5 or more are collectively shown in (B), and similar non-cellulosome-related genes are shown in (C).
  • genes with high expression are shown in red, genes with low expression in green, and intermediate genes in black.
  • genes included in the cbpA gene cluster (cbpA, exgS, engH, engK, hbpA, engL, manA, engM) and manGH26A (manA), manGH26B (manB)
  • the gene expression level [log2 (RPKM)] showed a high expression level of 3.5 or more. Therefore, based on this result, the promoter of the cbpA gene located upstream of the cbpA gene cluster was selected for the construction of the plasmid of the present invention that imparts cellulosomes to Clostridium begerinki.
  • the signal peptide was also used for expression on the surface of the fungus body or secretion.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of this cbpA gene.
  • FIG. 2 the promoter region in the base sequence of this cbpA gene (FIG. 2: bold, single underlined portion (SEQ ID NO: 2)), signal peptide Regions (FIG. 2: italics, double underlined portion (SEQ ID NO: 3)) are shown respectively.
  • SEQ ID NO: 4 shows the base sequence of the coding region of the cbpA gene
  • SEQ ID NO: 5 shows the base sequence of the exgS gene
  • SEQ ID NO: 6 shows the base sequence of the engH gene
  • SEQ ID NO: 7 shows the base sequence of the engK gene.
  • the base sequence of the hbpA gene is shown in SEQ ID NO: 8
  • the base sequence of the engL gene is shown in SEQ ID NO: 9
  • the base sequence of the manA gene is shown in SEQ ID NO: 10.
  • exgS, engH, engK, and engL are cellulase genes
  • hbpA is a cellulosome skeletal protein gene
  • manA is a mannanase gene (see Non-Patent Document 9).
  • cellulosome expression plasmid 1 From the results, cellulosomes were constructed using genes from the cbpA gene to the manA gene of the cbpA gene cluster. The region from the cbpA gene to the manA gene (SEQ ID NO: 11) was amplified by PCR using the primers shown in Table 1 and inserted into the pMTL500E vector. A region from the cbpA gene to the manA gene was amplified by PCR using the primers shown in Table 1 (SEQ ID NOs: 12 and 13) as the template DNA of Clostridium cellulovorans. Each primer in Table 1 contained a base sequence (Table 1, underlined) that would be a homologous sequence with the plasmid in order to insert the amplified fragment into the plasmid.
  • FIG. 3 shows a map of pMTL500E-cbpA-ManA.
  • each part in FIG. 3 shows the following each.
  • ApR, emR Antibiotic resistance gene hatched portion: promoter region cbpA, hbpA: cellulosome skeletal protein gene exgS, engH, engK, engL: cellulase gene manA: mannanase gene
  • Example 2 Preparation of transformant 1 pMTL500E-CbpA-ManA was introduced by electroporation to transform Clostridium Begelinki.
  • CbpA-ManA transformant Clostridium Begelinki may hereinafter be simply referred to as CbpA-ManA transformant.
  • each part in FIG. 4 shows the following each.
  • M 1 kb Extended DNA Ladder (Bio Labs)
  • pMTL500E-CbpA-ManA 2 Colony template PCR of CbpA-ManA transformants
  • 3 Wild-type Clostridium beigerinki colony template PCR
  • CbpA-ManA transformant Clostridium beigerinki was evaluated by activity staining with Congo red. Since LBG is insoluble, a medium having the composition shown in Table 3 was prepared using glucomannan, which is the same mannan as LBG and is soluble as a carbon source. After sterilization and before gelation, erythromycin was added at 20 ⁇ g / mL in an anaerobic chamber and dispensed into a petri dish. A culture solution of a CbpA-ManA transformant and a pMTL500E transformant transformed with an empty vector as a control was inoculated into the petri dish with a platinum loop and statically cultured at 37 ° C. for 2 days.
  • Example 3 Production of alcohol CbpA-ManA transformant Clostridium Begelinki was cultured in a medium containing LBG, and the reaction product was detected. That is, 40 mL of a medium containing LBG as a carbon source was prepared in vials capable of sealing 100 mL with the composition shown in Table 4. In the anaerobic chamber, erythromycin was added to the medium at 10 ⁇ g / mL, and then the CbpA-ManA transformant and the pMTL500E transformant transformed with the empty vector were inoculated. A medium free of erythromycin was also prepared, and wild type Clostridium vengerinki was also inoculated into it. They were all incubated at 37 ° C. for 3 days.
  • the medium was reacted at 37 ° C. for 1 day.
  • FIG. 8 shows the results of TLC.
  • Reference numeral 1 in FIG. 8 is a marker on which each sugar is spotted, and shows spots of mannose, mannobiose, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, and mannohexaose from the top.
  • 4 of FIG. 8 shows the spot of LBG which is a substrate.
  • FIG. 8-2 shows the result of reaction with a substrate using a culture medium (culture supernatant) of a CbpA-ManA transformant as a sample and decomposed at a position corresponding to mannohexaose (hexasaccharide). The product was confirmed, and the spot color of the substrate LBG was light.
  • FIG. 8 3 shows the result of reacting the culture supernatant of wild-type Clostridium beigerinki with the substrate, but the degradation product of LBG was not confirmed, and the decrease in the spot of the substrate LBG was reduced. Also not confirmed.
  • Examples 1 to 3 a cellulosome expression plasmid was constructed, a transformant into which the plasmid was introduced was obtained, and butanol could be produced from locust bean gum, which is a cellulosic biomass.
  • locust bean gum which is a cellulosic biomass
  • butanol can be produced from cellulosic biomass in one tank, and the time and cost conventionally required for biofuel production can be greatly reduced.
  • the cellulosic expression plasmid constructed according to the present invention can be widely distributed in order to obtain a transformant of a microorganism that produces alcohol. Since the transformant obtained by introducing this plasmid can directly produce alcohol or the like from cellulosic biomass by culturing, it is possible to efficiently produce biofuel.

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Abstract

バイオ燃料の製造において、従来の技術に対してさらに有用な方法を提供することを課題とする。セルロソーム発現プラスミドを構築し、該プラスミドにより形質転換された微生物を得て、これを培養することにより、従来の技術に対してさらに有用なアルコールの製造方法を提供する。

Description

アルコールの製造方法
　本発明はセルロソーム発現プラスミド、該プラスミドにより形質転換された微生物、および該微生物によるアルコールの製造方法に関する。さらに詳しくは、セルロース系バイオマスを直接糖化可能なセルロソームを発現するためのプラスミドに関する。また、該プラスミドによって、アルコール発酵が可能な微生物の形質転換体を得て、ブタノール等のアルコールを製造する方法に関する。
　近年、稲わら、バッカス、植物残渣等のセルロース系バイオマスからエタノール、ブタノール等のアルコールをバイオ燃料として製造する様々な技術が開発されている。しかし、これらのバイオ燃料の製造はコストが高いという問題がある。そこで、次世代のバイオ燃料生産をはじめとしたバイオリファイナリーにおいて、「前処理、糖化、発酵」の工程を統合（Ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ　Ｂｉｏ－Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＣＢＰ（以下、単にＣＢＰと示す場合がある））する技術開発が求められている。ＣＢＰによる技術革新により、さらにバイオ燃料製造のコストダウンが可能であり、最大で４１％のコストダウンが見込めるとされている（非特許文献１）。
　この前処理、糖化に関して、稲わらなどのソフトバイオマスを直接分解できる微生物として、嫌気性中温菌であるクロストリジウム　セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）が報告された（非特許文献２）。その後、クロストリジウム　セルロボランスは「セルロソーム」とよばれる超タンパク質複合体を生産することが確認された（非特許文献３）。
　セルロソームは、セルロソーム骨格タンパク質にセルラーゼやヘミセルラーゼなどの酵素を搭載した超タンパク質複合体であり、基質に応じて酵素を組み合わせることでソフトバイオマスを効率よく分解する（非特許文献４）。本発明者らは、クロストリジウム　セルロボランスの全遺伝子情報を全ゲノム解析により解読し（非特許文献５）、この結果から、セルロソームの土台となるセルロソーム骨格タンパク質、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用することができるセルラーゼ、ヘミセルラーゼなどの酵素やタンパク質、さらに分泌型の糖質関連酵素であるノンセルロソームの同定および分類を完了した。また、プロテオーム解析の結果から基質に応じたセルロソームやノンセルロソームに関する情報も得ている（非特許文献６～８）。
　このうちクロストリジウム　セルロボランスが生産するセルロソーム骨格タンパク質の一つであるＣｂｐＡ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、単にＣｂｐＡと示す場合がある））は、（１）結晶性セルロースと結合することができる糖質結合モジュール（ＣＢＭ）が１つ、（２）菌体の細胞表層と結合する表層ホモロジードメイン（ＳＬＨ）が４つ、（３）セルロソームを構成する酵素が持つドックリンドメインと結合するコヘシンドメインが９つあり、これらの（１）～（３）から構成される分子量が１８９，０００の比較的大きなタンパク質である。ｃｂｐＡ遺伝子の下流にはセルラーゼおよびヘミセルラーゼの遺伝子が多数存在し、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターと呼ばれる遺伝子クラスターを形成している（非特許文献９）。
　クロストリジウム属の微生物には、クロストリジウム　セルロボランスのようにセルロソームを形成してリグノセルロースを分解したり、ブタノールやエタノール等のアルコールやアセトンなどの有機溶媒を生産したりするものがいくつか知られている。
　例えば、クロストリジウム　アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）やクロストリジウム　ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）はブタノール生産菌として知られており、これらの微生物によるアセトン・ブタノール・エタノール（ＡＢＥ）発酵が、酵母を使ったエタノール発酵に続いて実用化されている（非特許文献１０）。
　ＡＢＥ発酵によるアセトン・ブタノール生産は、化学合成法により安価な合成アルコールが普及するにつれて衰退したが、化石燃料の高騰や地球温暖化等の問題から、近年、再び世界的に注目されている。
　このようなバイオ燃料の製造のための技術として、例えば、特許文献１は、効率的にブタノールを得るために、クロストリジウム　アセトブチリカムやクロストリジウム　ベイジェリンキ等のクロストリジウム属に属する微生物を、一定量の乳酸を基質として含む環境（ｍｅｄｉｕｍ）で培養する方法を開示している。
　特許文献２は、酪酸の形成に関与するホスホトランスブチリラーゼをコードする遺伝子等の遺伝子が削除されているクロストリジウム属に属する微生物を培養することで、ｎ－ブタノールを高収率で生物学的に製造する方法を開示している。
　特許文献３は、アルコールの製造に直接関与するものではないが、セルロソ－ム足場タンパク質等の融合タンパク質をコードするポリ核酸を含む組換え微生物として、クロストリジウム属に属する微生物を得て、異種セルラーゼを分泌させる方法等を開示している。
　また、特許文献４は、クロストリジウム属に属する微生物等を培養することによって得られた１－ブタノール、２－ブタノール等の有機成分を特定のステップを経ることにより高濃度で回収する方法等を開示している。
　さらに、特許文献５は、クロストリジウム　セルロリティカム由来のセルロソーム構成タンパク質をコードする遺伝子（Ｃｅｌ５Ａ遺伝子またはＣｅｌ９Ｍ遺伝子）やピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）やアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ１）をコードする遺伝子等を組み込んだクロストリジウム　アセトブチリカムを得て、これを培養することにより、グルコースやセルロースを基質としてエタノールを産生させる方法等を開示している。
　この方法もセルロソーム発現プラスミドにより形質転換されたクロストリジウム属の微生物を用いて、アルコールを製造する方法に関するものであるが、セルロソームを構成しているタンパク質の種類や該タンパク質の由来、また生産させたセルロソームのサイズ等が本発明と異なり、生産しているアルコールも主にエタノールである。
　これらの技術により、バイオ燃料の製造において、微生物によるアルコール生産を効率化したり、回収率を高めたりすることが可能となりつつあるが、さらに有用な方法の提供が望まれている。
特許第４６６５０６６号 特表２０１０－５０８０１７号公報 特表２０１１－５２９３３６号公報 特表２０１３－５１３３９４号公報 国際公開第２０１０／０６３７６６号パンフレット
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　本発明は、バイオ燃料の製造において、従来の技術に対してさらに有用な方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題の解決を目的として鋭意検討した結果、セルロソーム発現プラスミドを構築し、該プラスミドにより形質転換された微生物を得て、これを培養することにより、従来の技術に対してさらに有用なアルコールの製造方法が提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明によって構築されるプラスミドは、セルロース系バイオマスを直接糖化可能なセルロソームを発現するためのプラスミドであり、該プラスミドによって、アルコール発酵が可能な微生物の形質転換体を得ることにより、該微生物の培養におけるエタノール、ブタノール等のアルコールの生産効率を高めることが可能となる。
　すなわち、本発明は、次の（１）～（９）に示されるアルコールの製造方法に関する。
（１）ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域を含むセルロソーム発現プラスミド。
（２）さらに、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む上記（１）に記載のセルロソーム発現プラスミド。
（３）配列表配列番号２に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域と、配列表配列番号３に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む、上記（２）に記載のセルロソーム発現プラスミド。
（４）上記（１）～（３）のいずれかに記載のプラスミドを微生物に導入して得られる形質転換体。
（５）微生物がクロストリジウム属に属する微生物または酵母である上記（４）に記載の形質転換体。
（６）微生物がクロストリジウム　ベイジェリンキまたはクロストリジウム　アセトブチリカムである上記（５）に記載の形質転換体。
（７）上記（４）～（６）のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含む、基質からアルコールを製造する方法。
（８）基質がセルロース系バイオマスである上記（７）に記載のアルコールを製造する方法。
（９）セルロース系バイオマスがローカストビーンガム、稲わら、バガス、コーンストーバー、スイッチグラス、ポプラまたは植物残渣である上記（８）に記載のアルコールを製造する方法。
　本発明によって構築されたセルローム発現プラスミドによりクロストリジウム　ベイジェリンキ等のアルコールを産生する微生物の形質転換体を得て、該形質転換体を培養することにより、セルロース系バイオマスから直接ブタノール等のアルコールを製造することが可能となる。これによりバイオ燃料の効率的な製造が可能となり、時間やコストを大幅に削減することができる。
セルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子の遺伝子発現量を示した図である（実施例１）。 ｃｂｐＡ遺伝子の塩基配列におけるプロモーター領域およびシグナルペプチド領域を示した図である（実施例１）。 ｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡのマップを示した図である（実施例１）。 形質転換体において、導入した遺伝子の挿入の有無を確認した図である（実施例２）。 形質転換体の酵素活性を確認した図である（実施例２）。 ローカストビーンガム（Ｌｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ　ｇｕｍ（以下、単にＬＢＧと示す場合がある））を含む培地における形質転換体の培養後の写真を示した図である（実施例３）。 ガスクロマトグラフィーによりブタノールの生産量を確認した図である（実施例３）。 ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキによるＬＢＧの分解結果を示した図である（実施例３）。
　本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、微生物に導入することにより、該微生物にセルロソームを賦与し、セルロソーム発現能を与え得るプラスミドのことをいう。
　本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、セルロソームを構築し得る遺伝子を含んでいればよい。このような遺伝子として、セルロソーム骨格タンパク質をコードする遺伝子やセルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードする遺伝子等のセルロソーム関連遺伝子が挙げられる。これらのセルロソーム関連遺伝子は従来知られるいずれの遺伝子であってもよい。
　本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含まれる遺伝子として、例えば、セルロソーム骨格タンパク質をコードするｃｂｐＡ遺伝子やｈｂｐＡ遺伝子が挙げられる。
　このｃｂｐＡ遺伝子として、配列表配列番号１に示される塩基配列が挙げられるが、ｃｂｐＡ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号１に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　また、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、ｃｂｐＡ遺伝子として示される塩基配列を全て含む必要はなく、少なくとも配列表配列番号２に示されるｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域を含むものであれば良い。また、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号２に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　さらに、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域に加えて配列表配列番号３に示されるｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含むものであることが好ましい。また、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドと同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号３に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　また、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域やｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域に加えて、配列表配列番号４に示されるｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域を含むものであることがさらに好ましい。ｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号４に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　セルロソーム骨格タンパク質をコードするｈｂｐＡ遺伝子としては、配列表配列番号８に示される塩基配列が挙げられる。また、ｈｂｐＡ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号８に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　さらに、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含まれる遺伝子として、例えば、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードするｅｘｇＳ遺伝子、ｅｎｇＨ遺伝子、ｅｎｇＫ遺伝子、ｅｎｇＬ遺伝子またはｅｎｇＭ遺伝子等が挙げられる。また、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、マンナナーゼ等のその他の酵素をコードするｍａｎＡ遺伝子やｍａｎＢ遺伝子等を含んでいても良い。
　このｅｘｇＳ遺伝子として、配列表配列番号５に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｘｇＳ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号５に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　ｅｎｇＨ遺伝子としては、配列表配列番号６に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｎｇＨ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号６に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　さらに、ｅｎｇＫ遺伝子として、配列表配列番号７に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｎｇＫ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号７に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　ｅｎｇＬ遺伝子として、配列表配列番号９に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｎｇＬ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号９に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　その他の酵素として、例えばマンナナーゼをコードする遺伝子としてｍａｎＡ遺伝子が挙げられる。ｍａｎＡ遺伝子としては、配列表配列番号１０に示される塩基配列が挙げられる。また、ｍａｎＡ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号１０に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。
　本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、セルロソームの構築が可能であれば、これらのセルロソーム骨格タンパク質をコードする遺伝子、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードする遺伝子や、その他の酵素をコードする遺伝子を２つ以上複数組み合わせて含むことができる。
　本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、セルロソームを微生物に発現させるためのベクターに、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域、またはｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域とｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を組み込むことにより構築することができる。これらにｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域を組み合わせても良く、さらにセルロソーム骨格タンパク質をコードする遺伝子、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードする遺伝子や、その他の酵素をコードする遺伝子を組み合わせて組み込んでも良い。
　本発明の「セルロソーム発現プラスミド」において使用するベクターは、従来知られるいずれのものであっても良いが、例えば、ブタノール生産菌のホスト－ベクター系として知られるＥ．ｃｏｌｉ－Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのシャトルベクター（参考文献１、２）、ｐＭＴＬ５００Ｅベクター（参考文献３）や、ｐＭＴＬ８００００ベクター（参考文献４）等を使用することができる。
参考文献１：Tummala, S. B., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (1999) Development and characterization of a gene expression reporter system for Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Appl Environ Microbiol 65, 3793-3799
参考文献２：Collas, F., Kuit, W., Clement, B., Marchal, R., Lopez-Contreras, A. M., and Monot, F. (2012) Simultaneous production of isopropanol, butanol, ethanol and 2,3-butanediol by Clostridium acetobutylicum ATCC 824 engineered strains. AMB Express 2, 45
参考文献３：Oultram, J. D., Loughlin, M., Swinfield, T-J., Brehm, J. K., Thompson, D. E., Minton, N. P. (1988) Introduction of plasmids into whole cells of Clostridium acetobutylicum by electroporation. FEMS Microbiol. Letters 56: 83-88
　このようにして構築した「セルロソーム発現プラスミド」として、例えば、ｐＭＴＬ５００ＥベクターにｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域およびｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域を組み合わせ、さらにｈｂｐＡ遺伝子、ｅｘｇＳ遺伝子、ｅｎｇＨ遺伝子、ｅｎｇＫ遺伝子、ｅｎｇＬ遺伝子およびｍａｎＡ遺伝子を組み合わせて組み込んだｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡ等が挙げられる。なお、これらの遺伝子等のベクターへの組み込み方法は、従来知られているいずれの方法であっても良い。
　本発明の「形質転換体」は、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」を微生物に導入することで、セルロソームを賦与された微生物のことをいう。
　本発明においてセルロソームを賦与する微生物は、従来知られているいずれの微生物であっても良いが、エタノール、ブタノール等のアルコールを生産し得る、バイオマス燃料の製造に有用な微生物であることが好ましい。
　このような微生物として、バイオマス燃料の製造に有用なクロストリジウム属に属する微生物等が挙げられ、クロストリジウム属に属する微生物としてクロストリジウム　ベイジェリンキ、クロストリジウム　アセトブチリカム等が挙げられる。また、酵母を「形質転換体」としても良い。
　本発明の「アルコールを製造する方法」は、本発明の「形質転換体」を基質を含む培地で培養する工程を含むことにより、基質からエタノールおよび／またはブタノールを製造する方法のことをいう。このような基質として、セルロース系バイオマスを挙げることができる。
　本発明のセルロース系バイオマスとして、ローカストビーンガム、稲わら、バッカス、コーンストーバー、スイッチグラス、ポプラまたは植物残渣等が挙げられる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
［実施例１］
プラスミドの構築
１．ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析によるプロモーターの検討
１）グルコース、セロビオース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キシラン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、ペクチンの６種類の糖を炭素源とした培地（非特許文献２、参照）でクロストリジウム　セルロボランスをそれぞれ培養し、対数増殖期中期にｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。
　その後、ｍＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーの調製とｒＲＮＡの量を減少させるためにＤＳＮ処理によるＮｏｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った後、次世代シークエンサーであるＨｉＳｅｑ　２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供した。
　シークエンスから得られたリード配列をゲノム配列にマッピングし、各遺伝子の発現量を、遺伝子の長さとリード量で正規化した単位（ＲＰＫＭ）で算出することにより求めた（参考文献５）。
参考文献５：Mortazavi, A,. Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B.(2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods., 
5, 621-628
２）クロストリジウム　セルロボランスにおいて発現した遺伝子のうち、セルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子に着目し、上記１）において求めた各遺伝子におけるＲＰＫＭに対して底を２とした対数変換を行い、得られた値［ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）］を遺伝子発現量とした。
　得られたセルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子の遺伝子発現量をヒートマップにより図１に表した。
　図１の（Ａ）は全てのセルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子の発現量を示したものである。このうち遺伝子発現量［ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）］が３．５以上のセルロソーム関連遺伝子を（Ｂ）にまとめて示し、同様のノンセルロソーム関連遺伝子を（Ｃ）にまとめて示した。これらの（Ａ）～（Ｃ）において、発現量が高い遺伝子は赤色、低い遺伝子は緑色、中間の遺伝子は黒色で示している。
３）上記１）および２）の結果、セルロソーム関連遺伝子では、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子（ｃｂｐＡ、ｅｘｇＳ、ｅｎｇＨ、ｅｎｇＫ、ｈｂｐＡ、ｅｎｇＬ、ｍａｎＡ、ｅｎｇＭ）とｍａｎＧＨ２６Ａ（ｍａｎＡ）、ｍａｎＧＨ２６Ｂ（ｍａｎＢ）がいずれの炭素源においても遺伝子発現量［ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）］が３．５以上の高い発現量を示すことが確認できた。
　従って、この結果より、クロストリジウム　ベイジェリンキにセルロソームを賦与する本発明のプラスミドの構築にあたり、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターの上流に位置するｃｂｐＡ遺伝子のプロモーターを選択した。また、菌体の表層に発現させるか、もしくは分泌させるために、そのシグナルペプチドも使用した。
　配列表配列番号１に、このｃｂｐＡ遺伝子の塩基配列を示すとともに、図２において、このｃｂｐＡ遺伝子の塩基配列におけるプロモーター領域（図２：太字、一重下線部（配列表配列番号２））、シグナルペプチド領域（図２：イタリック体、二重下線部（配列表配列番号３））をそれぞれ示した。
　また、配列表配列番号４にｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域の塩基配列を示し、配列表配列番号５にｅｘｇＳ遺伝子の塩基配列、同配列番号６にｅｎｇＨ遺伝子の塩基配列、同配列番号７にｅｎｇＫ遺伝子の塩基配列、同配列番号８にｈｂｐＡ遺伝子の塩基配列、同配列番号９にｅｎｇＬ遺伝子の塩基配列、同配列番号１０にｍａｎＡ遺伝子の塩基配列をそれぞれ示した。ｅｘｇＳ、ｅｎｇＨ、ｅｎｇＫ、ｅｎｇＬはセルラーゼ遺伝子であり、ｈｂｐＡはセルロソーム骨格タンパク質遺伝子であり、ｍａｎＡはマンナナーゼ遺伝子である（非特許文献９、参照）。
２．セルロソーム発現用プラスミドの構築
１）上記１．の結果より、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターのｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子までの遺伝子によりセルロソームの構築を行った。ｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子までの領域（配列表配列番号１１）は、表１に示したプライマーによるＰＣＲによって増幅し、これをｐＭＴＬ５００Ｅベクターに挿入した。
　ｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子までの領域を表１に示したプライマー（配列表配列番号１２、１３）により、クロストリジウム　セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い増幅した。表１の各プライマーは、増幅した断片をプラスミドに挿入するために、プラスミドと相同配列となるような塩基配列（表１、下線部）を含むものであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
 
２）上記１）によって増幅したｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子の断片を精製し、線状化したｐＭＴＬ５００Ｅベクターに、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応を行い、セルロソーム発現用プラスミドとした。
　このセルロソーム発現用プラスミドを大腸菌ＨＳＴ０８株へ導入した後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に植菌し３７℃で一晩静置培養した。コロニーＰＣＲにより、ｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子が挿入されているコロニーを選択してＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出した。このようにして得られたセルロソーム発現用プラスミドは、以下、本発明においてｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡと示す。図３にｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡのマップを示した。
なお、図３における各部分はそれぞれ次のものを示す。
ＡｐＲ、ｅｍＲ：抗生物質耐性遺伝子
斜線部：プロモーター領域
ｃｂｐＡ、ｈｂｐＡ：セルロソーム骨格タンパク質遺伝子
ｅｘｇＳ、ｅｎｇＨ、ｅｎｇＫ、ｅｎｇＬ：セルラーゼ遺伝子
ｍａｎＡ：マンナナーゼ遺伝子
［実施例２］
１．形質転換体の作製
１）エレクトロポレーション法により、ｐＭＴＬ５００Ｅ－ＣｂｐＡ－ＭａｎＡを導入し、クロストリジウム　ベイジェリンキの形質転換を行った。
　クロストリジウム　ベイジェリンキ（ＮＢＲＣ　１０３９０９）（（独）製品評価技術基盤機構より分譲を受けた）をＯＤ６００＝０．３になるまで表２の組成で作製した培地で培養した。この培養液を５ｍＬ容のチューブに入れ、嫌気チャンバー中の卓上遠心機で室温、２，４００ｇ、５分間遠心分離して集菌した。この上清を取り除き、氷上で冷したエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭ　スクロース、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、４．４ｍＭ　ＮａＨ２ ＰＯ４　ｐＨ６．０）を１ｍＬ加えて菌体を懸濁し、再び５分間遠心分離して集菌した。この上清を取り除き、１０ｍＭが含まれていない冷えたエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭ　スクロース、０．６ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、４．４ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４　ｐＨ６．０）を０．４ｍＬ加えて再懸濁し、氷上で１０分間静置した。
　滅菌済みの１．５ｍＬ容チューブに２０μＬの菌体懸濁液と２５ｎｇのｐＭＴＬ５００Ｅ－ＣｂｐＡ－ＭａｎＡを加えて混合し、氷上で８分間静置した。この混合液を、氷上で冷した０．１ｃｍギャップ滅菌済みエレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ－ＲＡＤ）に移し、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ（商標）エレクトロポレーションシステム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）により、エレクトロポレーション法による形質転換を行った。エレクトロポレーションの条件は、７００Ｖ、２００Ω、２５μＦで行った。エレクトロポレーションを行った後、キュベットを氷上で１０分間静置した。その後、１７０μＬの表２の組成で作製した培地を加え、混合してから２ｍＬ容の密栓できるチューブに移し、３７℃で２．５時間静置培養した。ここまでの操作は全て嫌気チャンバー内で行った。
２）上記１）のサンプルの入ったチューブを嫌気チャンバーから取り出し、表２の組成からなる培地に１．５％　Ａｇａｒを含んだ７ｍＬの培地を滅菌して溶解し、培地に二酸化炭素を吹き込みながら植菌した。植菌の際に、エリスロマイシンを４０μｇ／ｍＬになるように加えた。酸素が入らないようにブチル栓をし、ロールチューブ作製器（三紳工業株式会社）でロールチューブを作製した。作製したロールチューブを３７℃で一晩培養した。
　形質転換後、コロニーＰＣＲにより導入した遺伝子が挿入されているかを確認した。コロニーを鋳型とし、表１に記載のプライマーによりＰＣＲ反応を行い、導入した遺伝子の挿入を確認した（図４）。このようにして得られた形質転換体（ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキ）は、以下、単にＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体と示す場合がある。
　なお、図４における各部分はそれぞれ次のものを示す。
Ｍ：１ｋｂ　Ｅｘｔｅｎｄ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ）
１：ｐＭＴＬ５００Ｅ－ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ
２：ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体のコロニー鋳型ＰＣＲ
３：野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキのコロニー鋳型ＰＣＲ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
２．酵素活性の評価
　ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキの酵素活性を、コンゴーレッドによる活性染色によって評価した。
　ＬＢＧは不溶性であるため、ＬＢＧと同じマンナンを構成糖として持ち可溶性であるグルコマンナンを炭素源として、表３に示した組成で培地を作製した。滅菌後、ゲル化する前に嫌気チャンバー内でエリスロマイシンを２０μｇ／ｍＬになるように加え、シャーレに分注した。
　作製したシャーレにＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体とコントロールとして空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体の培養液を白金耳で植菌し、３７℃で２日間静置培養した。ここまでの操作はすべて嫌気チャンバー内で行った。
　培養後、シャーレに１％コンゴーレッド溶液を１ｍＬ加えスプレッターで広げ、５分間染色した。その後、１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を３ｍＬ加え脱色を４回繰り返して行った。
　その結果、図５に示すように、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体を植菌したもの（図５：Ｂ）はコロニーの周りにハローが観察されたが、ｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体を植菌したもの（図５：Ａ）には観察されなかった。従って、この結果より、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体がグルコマンナンの分解活性を有することが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
 
［実施例３］
アルコールの製造
　ＬＢＧを含む培地でＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキを培養し、反応生成物を検出した。
　即ち、ＬＢＧを炭素源として含む培地を表４の組成で１００ｍＬ容の密栓できるバイアル瓶に４０ｍＬずつ作製した。嫌気チャンバー内で培地にエリスロマイシンが１０μｇ／ｍＬになるように加え、その後、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体と空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体の植菌を行った。また、エリスロマイシンを含まない培地も作製し、それには野生型のクロストリジウム　ベンジェリンキも植菌した。それらは全て３７℃で３日間静置培養した。
　その結果、図６に示したように、野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキ（図６：Ａ）や、空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体（図６：Ｂ）を培養した系では、培養後も培地が濁ったままであり、培地に含まれるＬＢＧをほとんど分解されなかった。一方、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体（図６：Ｃ）を培養した系では、培養後の培地が透過しており、培地に含まれるＬＢＧがほぼすべて分解されたことが確認できた。
　そして、ガスクロマトグラフィーによりブタノール生産量を調べたところ、空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体を培養した系（図７：Ａ）ではブタノールの生産が確認できなかったが、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体を培養した系（図７：Ｂ）では、９．３ｍｇ／ｍＬのブタノールを生産していることが確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
 
　さらに、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキの培養後の培地（培養上清）と野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキの培養後の培地（培養上清）をサンプルとし、基質として０．５％のＬＢＧを含む培地で３７℃で１日間反応させた。その反応溶液に展開溶媒（１－ブタノール：酢酸：水＝２：１：１）を加えてＴＬＣに供与し、分解産物を確認した。
　図８にＴＬＣの結果を示した。図８の１は各糖をスポットしたマーカーであり、上からマンノース、マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、マンノペンタオース、マンノヘキサオースのスポットを示す。また、図８の４は基質であるＬＢＧのスポットを示す。
　図８の２は、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体の培地（培養上清）をサンプルとし、基質と反応させた結果を示したものであり、マンノヘキサオース（６糖）に相当する位置に分解産物が確認され、基質であるＬＢＧのスポットの色が薄くなっていた。従って、この結果より、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ転換体によって、ＬＢＧを分解できることが確認できた。
　図８の３は、野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキの培養上清をサンプルとし、基質と反応させた結果を示したものであるが、ＬＢＧの分解産物は確認されず、基質であるＬＢＧのスポットの減少も確認されなかった。
　実施例１～実施例３において、セルロソーム発現プラスミドを構築し、これを導入した形質転換体を得て、セルロース系バイオマスであるローカストビーンガムからブタノールを製造することが可能となった。
　一般に、セルロース系バイオマスからのバイオ燃料を得るには、前処理→糖化→発酵→蒸留の各工程が必要になる。しかし、本発明によって、クロストリジウム　セルロボランスのセルロソームが賦与されたクロストリジウム　ベイジェリンキにより、セルロース系バイオマスであるローカストビーンガムを直接糖化し、発酵することが可能となる。これにより、セルロース系バイオマスからのブタノールの製造を１つのタンクで行うことが可能となり、従来、バイオ燃料製造に要していた時間とコストを大幅に削減することができる。
　本発明によって構築されたセルローム発現プラスミドは、アルコールを産生する微生物の形質転換体を得るために、広く流通させることができる。このプラスミドを導入することによって得られた形質転換体は、培養によってセルロース系バイオマスから直接アルコール等を製造できるため、効率的なバイオ燃料の製造が可能となる。

Claims (9)

  1. ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域を含むセルロソーム発現プラスミド。
  2. さらに、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む請求項１に記載のセルロソーム発現プラスミド。
  3. 配列表配列番号２に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域と、配列表配列番号３に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む、請求項２に記載のセルロソーム発現プラスミド。
  4. 請求項１～３のいずれかに記載のプラスミドを微生物に導入して得られる形質転換体。
  5. 微生物がクロストリジウム属に属する微生物または酵母である請求項４に記載の形質転換体。
  6. 微生物がクロストリジウム　ベイジェリンキまたはクロストリジウム　アセトブチリカムである請求項５に記載の形質転換体。
  7. 請求項４～６のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含む、基質からアルコールを製造する方法。
  8. 基質がセルロース系バイオマスである請求項７に記載のアルコールを製造する方法。
  9. セルロース系バイオマスがローカストビーンガム、稲わら、バガス、コーンストーバー、スイッチグラス、ポプラまたは植物残渣である請求項８に記載のアルコールを製造する方法。
     
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