KR20230095616A

KR20230095616A - 셀룰로좀 기반 키티네이즈와 셀룰레이즈가 세포 외벽에 고정화된 전세포 효소화 재조합 미생물 및 이를 이용한 리그노셀룰로직 바이오매스 분해 방법

Info

Publication number: KR20230095616A
Application number: KR1020210185266A
Authority: KR
Inventors: 한성옥; 이명은; 고영진
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-06-29

Abstract

본 발명은 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 유전자; 상기 재조합 유전자를 포함하는 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 벡터; 상기 벡터가 도입된 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물을 이용한 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 미생물은 세포 외벽에 키티네이즈 및 셀룰레이즈가 복합체 형태로 고정화됨으로써 전처리 후 잔류하는 곰팡이 성분과 셀룰로오스를 동시에 분해할 수 있는바, 곰팡이 전처리된 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해능이 현저히 증가된 효과를 갖는다.

Description

셀룰로좀 기반 키티네이즈와 셀룰레이즈가 세포 외벽에 고정화된 전세포 효소화 재조합 미생물 및 이를 이용한 리그노셀룰로직 바이오매스 분해 방법{Whole cell biocatalyst of recombinant microorganism displaying chitinase and cellulase on cellulosome and a lignocellulosic biomass degradation method using the same}

본 발명은 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 유전자; 상기 재조합 유전자를 포함하는 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 벡터; 상기 벡터가 도입된 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물을 이용한 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 방법에 관한 것이다.

바이오매스를 분해하는 혐기성 미생물들은 일반적으로 셀룰로좀 (Cellulosome)이라고 하는 효소 복합체를 세포 외벽에 가지고 있다. 세포 외부 구조체에는 코헤신 (Cohesin)이라는 도메인이 있고, 외분비 효소 부분에는 도커린 (Dokerin)이라는 도메인이 연결되어 있다. 코헤신과 도커린은 칼슘이온에 의해 서로 부착하는 기능이 있어 효소 복합체를 세포 외부에 만들 수 있다. 셀룰로좀을 가진 균주는 외부에 사용할 수 있는 기질의 종류에 따라서 관련된 효소들을 다양하게 발현, 부착하고 부착된 여러 효소들 간의 시너지를 이용하여 효율적으로 영양분 얻고 사용한다. 코헤신-도커린의 상호작용을 응용하여 효소들을 셀룰로좀에 부착하여 시너지를 향상시킬 수 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 GRAS (Generally recognized as safe), 비병원성, 그람 양성 균주로 배양액 상에서의 프로테이즈 (Protease) 활성이 낮아 세포 외 단백질 생산 균주로 사용하기 적합하다. 또한 막단백질의 일종인 기계수용채널 (Mechanosensitive channel, Msc)을 이용하여 세포 외부에 단백질을 고정화할 수 있다. 이러한 코리네박테리움 글루타미쿰은 수크로오스 (Sucrose), 글루코오스 (Glucose), 유기산 (Organic acids)을 탄소원 및 에너지원으로 사용하여 성장하나, 리그노셀룰로오스는 직접적으로 분해해서 사용하지 못한다.

리그노셀룰로직 바이오매스 (Lignocellulosic biomass)는 난분해성 성분으로 크게 셀룰로오스 (Cellulose), 헤미셀룰로오스 (Hemicellulose), 리그닌 (Lignin)으로 구성된다. 이러한 리그노셀룰로직 바이오매스는 물리적, 화학적, 생물학적 전처리를 통해서 난분해성 성분을 분해하여 이용하기 쉬운 형태로 변형하여 사용되고 있다. 특히, 생물학적 전처리 방식으로는 대표적으로 곰팡이를 이용한 전처리 방식이 있으며, 곰팡이가 분비한 효소를 통해 리그노셀룰로직 바이오매스의 외부 구조인 헤미셀룰로오스를 분해할 수 있다. 이를 통해, 글루코오스를 얻기 위한 리그노셀룰로직 바이오매스 내부의 셀룰로오스에 대한 접근성을 높일 수 있다. 그러나 곰팡이를 이용하여 리그노셀룰로직 바이오매스를 전처리하는 경우, 곰팡이 성분이 남게 되어 리그노셀룰로직 바이오매스 내부의 셀룰로오스에 대한 접근성이 낮아지는 문제점이 있다.

한편, 곰팡이를 이용한 바이오매스 전처리 방식은 바이오매스 전처리 후 곰팡이 성분이 주요 기질과 혼합, 잔존하여 목표 기질 분해에 방해가 될 수 있다. 곰팡이의 세포벽은 22-44%의 키틴 (Chitin)으로 구성되어 있어 키틴 분해 활성을 가진 효소를 이용하면 곰팡이 세포벽을 분해하여 곰팡이 성분을 분해할 수 있다. 전처리 후 잔존하는 곰팡이 성분을 분해하여 내부의 셀룰로오스에 대한 분해능을 향상시킬 수 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 곰팡이를 이용하여 리그노셀룰로직 바이오매스를 전처리 할때, 전처리 과정 후 남은 곰팡이를 제거하고 내부의 셀룰로오즈에 대한 셀룰레이즈의 분해능을 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 하였다. 그 결과 곰팡이와 셀룰로오스를 동시에 분해할 수 있는 효소 복합체가 세포 외벽에 고정화된 재조합 미생물을 전세포 촉매 (Whole cell biocatalyst)로 이용하는 경우 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 효율을 효과적으로 개선시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2011-0045975호

따라서 본 발명의 목적은 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 벡터가 도입된 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자; 기계수용채널를 코딩하는 유전자; 소형 골격단백질을 코딩하는 유전자; 키티네이즈를 코딩하는 유전자; 및 셀룰레이즈를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 유전자를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되며, 상기 기계수용채널를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, 상기 소형 골격단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키티네이즈는 엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈 (Exo-β-N-acetylglucosaminidase)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 셀룰레이즈는 엔도-1,4-베타-글루카네이즈 (Endo-1,4-β-glucanase)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈는 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엔도-1,4-베타-글루카네이즈는 서열번호 5의 염기서열로 표시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자를 포함하는 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 벡터가 도입된 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미생물은 세포 외벽에 키티네이즈 및 셀룰레이즈가 고정화될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미생물은 전세포 촉매 (Whole cell biocatalyst)로 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 리그노셀룰로직 바이오매스에 곰팡이를 전처리하는 단계; 및 b) 전처리 과정을 거친 리그노셀룰로직 바이오매스에 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곰팡이는 알펙스 락테우스 (Irpex lacteus), 트라메테스 베르시콜라 (Trametes versicolor), 글로에오필룸 트라베움 (Gloeophyllum trabeum) 및 포미톱시스 팔루스트리스 (Fomitopsis palustris) 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 재조합 미생물은 세포 외벽에 키티네이즈 및 셀룰레이즈가 복합체 형태로 고정화됨으로써 전처리 후 잔류하는 곰팡이 성분과 셀룰로오스를 동시에 분해할 수 있는바, 곰팡이 전처리된 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해능이 현저히 증가된 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명에서 구축된 재조합 벡터의 백터맵을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 만들어진 재조합 벡터가 발현되었을 때 셀룰로좀 기반 키티네이즈와 셀룰레이즈가 세포 외부에 고정화된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 보여주는 모식도이다.
도 3은 리그노셀룰로직 바이오매스에 곰팡이를 전처리한 후 시간 경과에 따른 배양 상등액에 방출되는 환원당을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 리그노셀룰로직 바이오매스에 곰팡이를 전처리한 후 시간 경과에 따른 배양 상등액에 방출되는 리그닌 변화를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA 재조합 벡터가 도입된 균주의 세포외 mCbpA 발현 유무를 초록 형광 단백질-도커린을 이용하여 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 형질전환체를 짧은 길이의 기질에 적용하여 효소 활성을 확인한 결과이다(6a: pNPGln, 6b: pNPGlc).
도 7은 본 발명의 형질전환체를 긴 길이의 기질에 적용하여 효소 활성을 확인한 결과이다(7a: Avicel, 7b: CMC).
도 8은 소형 골격단백질 (mCbpA) 유전자가 도입되지 않은 균주와 비교하여 mCbpA 유전자가 도입된 균주에서의 세포 성장을 확인한 결과이다.
도 9는 키티네이즈 (NAG) 또는 셀룰레이즈 (CelE)의 단일 유전자가 도입된 균주 대비 상기 2종의 유전자가 동시에 도입된 균주에서 세포 성장을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자; 기계수용채널을 코딩하는 유전자; 소형 골격단백질을 코딩하는 유전자; 키티네이즈를 코딩하는 유전자; 및 셀룰레이즈를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 유전자에 대한 것이다.

본 발명에서 "시그널 펩타이드 (Signal peptide, Sp)"는 효소 외분비에 관여하는 펩타이드로, 상기 시그널 펩타이드는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명에서 "기계수용채널 (Mechanosensitive channel, Msc)"은 세포막의 기계적 자극에 의해 활성화되는 채널로서, 세포질의 막부분을 관통하여 고정되어 있는 단백질로 이온 차지 (ion charge)에 민감하게 반응하여 여러 개의 도메인이 뭉쳐서 중간에 구멍을 만들어 주는 특징을 지니고 있으며, C-말단 부분이 세포 외부로 뻗어있어서 외부로 발현된 단백질과 연결되어 결합된 형태를 형성하는 것이 가능하다. 상기 기계수용채널 (Msc)은 클로스트리디움 셀룰로보란스 (Clostridium cellulovorans) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 2의 염기서열로 표시될 수 있다.

본 발명에서 "소형 골격단백질 (Mini-Cellulose-binding protein A, mCbpA)"은 본 발명의 효소 복합체의 골격을 이루는 단백질로, 코헤신 모듈 (Cohesin module)과 함께 탄수화물 결합 모듈 (CBM)을 포함할 수 있으며, 효소 복합체의 분해 대상이 되는 기질, 즉 리그노셀룰로직 바이오매스에 대한 접근성을 향상시키는 기능을 수행할 수 있다. 상기 소형 골격단백질 (mCbpA)은 클로스트리디움 셀룰로보란스 (Clostridium cellulovorans) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있다.

참고로, 셀룰로좀의 형성은 하나의 셀룰로좀 형성 효소의 도커린 도메인과 지지체 단백질의 여러 개의 코헤신 도메인 중 하나의 결합으로 이루어진다. 그러나, 자연계의 셀룰로좀은 그 크기가 매우 커서 제작과 이용에 어려움이 있다. 이에, 본 발명에서는 자연계의 셀룰로좀을 소형화하여 리그노셀룰로직 바이오매스 분해용 효소 복합체의 골격단백질로 제공하고자 하였으며, 이를 소형 골격단백질 (mCbpA)이라 명명하였다.

본 발명에서 "도커린 (dockerin)"은 혐기성 박테리아의 셀룰로좀 세포 구조에서 발견되는 단백질 도메인으로서, 엔도글루카나아제 효소에서 많이 발견된다. 도커린 (dockerin)의 결합 파트너는 스캐폴딘 (scaffoldin) 단백질에 위치한 코헤신 (cohesin) 도메인으로, 셀룰로좀의 효소 성분의 도커린 도메인과 스캐폴딘 단백질의 코헤신 도메인 사이의 이러한 상호작용은 셀룰로좀 복합체의 구성에 필수적이다. 본 발명에서, 도커린(dockerin)은 도커린 모듈 (dockerin module) 또는 도커린 도메인 (dockerin domain)과 동일한 의미이다.

본 발명에서 "코헤신 (cohesin)"은 도커린과 상호 작용하여 소형 골격단백질과 결합할 수 있도록 하는 기능을 수행하는 도메인이다. 본 발명에서, 코헤신 (cohesin)은 코헤신 모듈 (cohesin module) 또는 코헤신 도메인 (cohesin domain)과 동일한 의미이다.

본 발명에서 "탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module, CBM)"은 탄수화물 활성 효소 (예: 글리코시드 가수분해효소)에서 발견되는 단백질 도메인으로, 이들 도메인의 대부분은 탄수화물 결합 활성을 갖는다. 이러한 도메인 중 일부는 셀룰로오스 스캐폴딘 단백질에서 발견된다. CBM은 이전에 셀룰로오스 결합 도메인으로 알려져 있었다. CBM은 아미노산 서열 유사성에 따라 수많은 패밀리로 분류되며, 2011년 6월 기준 CAZy 데이터베이스에는 64개의 CBM 계열이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 "키티네이즈 (Chitinase)"는 일반적으로 곤충, 갑각류의 껍질, 곰팡이의 세포벽에 존재하는 키틴 (Chitin)이라는 다당류를 분해하여 엔-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine)이라는 아민이 붙은 당을 만드는 효소이다. 상기 키티네이즈는 엔-아세틸글루코사민 기반 다당류의 β-1,4 결합을 비환원당 말단부터 하나씩 자르는 효소일 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 키티네이즈는 엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈 (Exo-β-N-acetylglucosaminidase, GlcNAcase)일 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있다. 상기 엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈는 자체적으로 type 1 도커린 도메인을 가지고 있다.

본 발명에서 "셀룰레이즈 (Cellulase)"는 일반적으로 식물, 조류 등의 주요 구성성분이자 지구상에서 가장 많이 존재하는 셀룰로오스 (Cellulose)를 분해하여 글루코오스 (Glucose)를 만드는 효소이다. 상기 셀룰레이즈는 셀룰로오스 다당류의 β-1,4 결합을 무작위로 자르는 효소일 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 상기 셀룰레이즈는 엔도-1,4-베타-글루카네이즈 (Endo-1,4-β-glucanase, CelE)일 수 있으며, 클로스트리디움 셀룰로보란스 (Clostridium cellulovorans) 균주로부터 유래될 수 있고, 서열번호 5의 염기서열로 표시될 수 있다. 상기 엔도-1,4-베타-글루카네이즈는 자체적으로 type 1 도커린 도메인을 가지고 있다.

본 발명의 상기 5개의 유전자(시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자; 기계수용채널을 코딩하는 유전자; 소형 골격단백질을 코딩하는 유전자; 키티네이즈를 코딩하는 유전자; 및 셀룰레이즈를 코딩하는 유전자)는, 각 유전자에 해당하는 서열번호의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 5개의 유전자(시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자; 기계수용채널을 코딩하는 유전자; 소형 골격단백질을 코딩하는 유전자; 키티네이즈를 코딩하는 유전자; 및 셀룰레이즈를 코딩하는 유전자)를 포함하는 재조합 유전자는, 세포에 도입되어 발현되는 경우 세포 외벽에 고정화된 효소 복합체를 형성할 수 있다. 자세하게는, 본 발명의 상기 효소 복합체는 키티네이즈, 셀룰레이즈 및 소형 골격단백질 3종이 연결된 형태의 복합체를 형성하며, 이들 효소 복합체가 세포 외벽에 고정화된다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자를 포함하는 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 유전자가 클로닝될 수 있는 "벡터 (vector)"로는 pEKEx2 플라스미드를 이용하고 있으나, 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이고, 본 발명의 구체적인 실시예에서 이용하고 있는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

또한, 본 발명에서 "재조합 발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

상기 벡터는 클로닝되는 유전자와 작동가능하게 연결된 (operatively linked) 프로모터를 포함할 수 있으며, 본 발명에서 "프로모터"는 도입하고자 하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로서 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본인자 (Basal element)뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서 (enhancer)가 더 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 본 발명의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 것을 말한다. 본 발명에서 ‘형질전환’은 본 발명에 따른 프로모터, 또는 추가적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입 하는 것을 의미한다. 또한, 형질전환 된 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 세포 외벽에 키티네이즈 및 셀룰레이즈가 고정화될 수 있으며, 전세포 촉매 (Whole cell biocatalyst)로 사용될 수 있다.

참고로, 미생물과 같은 생명체에서 효소를 생산한 후 세포 파쇄 등의 절차를 통하여 원하는 효소만 분리 정제하여 사용하게 되는데 이러한 과정은 복잡할 뿐만 아니라 소요되는 비용도 커지게 된다. 따라서, 효소가 생산되는 세포 자체를 촉매와 같은 용도로 사용하고자 하는 것이 전세포 촉매 시스템의 개념이며 이를 통하여 활성의 안정화 및 경제성 등의 장점을 가질 수 있다. 그러나, 이러한 전세포 촉매 시스템이 제대로 작동하려면 세포막을 통한 물질 전달을 원활히 하여야 하는 문제를 해결해야 한다. 이를 위하여 효소를 세포막과 세포벽 사이의 공간인 세포 간극(periplasmic space) 또는 세포 표면(cell surface)에 위치시켜 물질 전달 문제를 해결하는 전세포 촉매 시스템들이 개발되고 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 세포 표면(또는 세포 외벽)에 키티네이즈 및 셀룰레이즈를 위치시킬 수 있는바, 상기 미생물 자체를 전세포 촉매로 이용할 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 세포 표면(또는 세포 외벽)에 키티네이즈 및 셀룰레이즈가 복합체 형태로 고정화됨으로써 전처리 후 잔류하는 곰팡이 성분과 셀룰로오스를 동시에 분해할 수 있는바, 리그노셀룰로직 바이오매스 분해에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 미생물(재조합 벡터가 도입되는 숙주세포)은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 리그노셀룰로직 바이오매스에 곰팡이를 전처리하는 단계; 및 b) 전처리 과정을 거친 리그노셀룰로직 바이오매스에 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 방법에 관한 것이다.

상기 리그노셀룰로직 바이오매스에 전처리되는 곰팡이는 곰팡이는 알펙스 락테우스 (Irpex lacteus), 트라메테스 베르시콜라 (Trametes versicolor), 글로에오필룸 트라베움 (Gloeophyllum trabeum) 및 포미톱시스 팔루스트리스 (Fomitopsis palustris) 등을 예시할 수 있으나, 특별히 이를 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료

코리네박테리움 글루타미쿰 13032 (Corynebacterium glutamicum 13032) 은 KCTC 균주은행 (KCTC 1445)으로부터 분양받아 사용하였으며; 알펙스 락테우스 (Irpex lacteus)는 김규혁 교수 연구팀 (고려대)으로부터 분양받아 사용하였고; pMT1s 벡터는 실험실에서 자체 제작하였고(대한민국 등록특허 제10-1756338호 참조); pEKEx2 벡터는 우한민 교수 연구팀(성균관대)으로부터 수득하였으며; ligation kit는 Enzynomics에서 구입하였고; Gibson assembly kit는 New England Biolabs에서 구입하였으며; 볏짚은 충청남도 공주시 농가에서 수득하였다.

LB 배지 및 BT 배지는 실험실에서 자체 제작하였다. LB 배지는 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 5 g/L sodium chloride, 25 mg/mL kanamycin이 포함되도록 제조하였으며; BT 배지는 2 g/L (NH₂)₂CO, 7 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.5 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 6 mg/L Fe₂SO₄·7H₂O, 4.2 mg/L MnSO₄·H₂O, 0.2 mg/L biotin, 0.2 mg/L thiamine, 40 g/L glucose 또는 1 g 곰팡이 전처리된 볏짚, 1 mM isopropyl thio-β-D-galactoside (IPTG)이 포함되도록 제조하였다.

<실시예 1>

엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈 (NAG)와 엔도-1,4-베타-글루카네이즈 (CelE)의 시그널 펩타이드 (Signal peptide) 융합을 위한 유전자 증폭

엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈 (Exo-β-N-acetylglucosaminidase, GlcNAcase; 이하 간략하게 ‘NAG’로 약칭함)와 엔도-1,4-베타-글루카네이즈 (Endo-1,4-β-glucanase; 이하 간략하게 ‘CelE’로 약칭함)의 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 외부 효소 복합체 형성을 위해 효소 외분비에 관여하는 시그널 펩타이드 (Signal peptide; 이하 간략하게 ‘Sp’로 약칭함) 유전자 확보 과정을 진행하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 pMT1s 벡터와 지노믹디엔에이로부터 시그널 펩타이드 유전자 (cg0955) 염기서열을 증폭하였다. 증폭한 시그널 펩타이드를 NAG (자체적으로 type 1 도커린을 가지고 있어서 추가로 연결하지 않았음)와 CelE (클로스트리디움 셀룰로보란스 유래 엔도-베타-1,4-글루칸아제-비 type 1 도커린이 연결된 유전자를 사용하여 추가로 연결하지 않았음)에 Overlap PCR을 통해 연결하였다. 최종적으로 ‘시그널 펩타이드-NAG-type 1 도커린 도메인’ 혹은 ‘시그널 펩타이드-CelE-type 1 도커린 도메인’의 형태로 유전자를 만들었다. 해당 재조합 유전자는 각각 Sp::NAG doc, Sp::CelE doc로 명명하였다.

유전자 증폭에 사용된 프라이머

재조합 유전자 표기명	실제 삽입된 유전자	프라이머	제한효소	프라이머 서열(5‘->3’)	서열번호	클로닝방식
Sp::NAG doc	cg0955::Clocel3193 genes	Sp-Clocel3193-F	Pst1	aatctgcagatgcaaataaaccgccga	7	T4 DNA ligation
		Clocel3193-Sp-R(ov)	-	tacagtgaaatttattgcttgaagggcgttgg	8
		Sp-Clocel3193-F(ov)	-	caacgcccttcaagcaataaatttcactgtaagttatacttcagc	9
		Sp-Clocel3193-R	BamH1	aaaggatcctcagtggtggtggtggtggtgactaagtaattttttctttaaaagtgctaaatc	10
Sp::CelE doc	cg0955::CelE genes	Sp-CelE-F	BamH1	aaaggatccatgcaaataaaccgccga	11	T4 DNA ligation
		CelE_Sp-R(ov)	-	aagctttgttcccgatgcttgaagggcgttgg	12
		Sp_CelE-F(ov)	-	aacgcccttcaagcatcgggaacaaagcttttggat	13
		Sp-CelE-R	Kpn1	aatggtacctcagtggtggtggtggtggtgtaaaagcatttttttaagaacagctaaatc	14

<실시예 2>

시그널 펩타이드, 기계수용채널 (Mechanosensitive channel, Msc), mini CbpA (mCbpA) 융합과 mCbpA, NAG, CelE 동시 발현을 위한 유전자 증폭

코리네박테리움 글루타미쿰 세포 외부 효소 복합체를 발현하기 위해 효소 외분비에 관여하는 시그널 펩타이드와 막단백질의 일종인 기계수용채널 (Mechanosensitive channel, 이하 간략하게 ‘Msc’라 약칭함), 소형 골격단백질 (miniCbpA, 이하 간략하게 ‘mCbpA’라 약칭함)의 유전자 확보 과정을 진행하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 지노믹디엔에이로부터 시그널 펩타이드 유전자 (cg0955)와 클로스트리디움 셀룰로보란스 (Clostridium cellulovorans)의 지노믹디엔에이로부터 Msc (NCgl 1221), mCbpA 유전자의 염기서열을 증폭하였다. 시그널 펩타이드와 Msc 유전자의 정방향 프라이머의 5’에는 코리네박테리움용 pEKEx2 벡터의 앞쪽으로 18 bp만큼의 인식서열이, 역방향프라이머의 5’에는 벡터의 뒤쪽으로 18 bp만큼의 인식서열이 삽입되도록 프라이머를 디자인하여 합성하였다. mCbpA 유전자는 NEBuilder 프로그램이 제안하는 Gibson assembly용 프라이머로 제작하였다.

상기 <실시예 1>을 통해 제조된 Sp::NAG doc, Sp::CelE doc 유전자를 RBS (Ribosome binding site)가 포함된 프라이머를 이용해 ‘RBS-시그널 펩타이드-NAG-type 1 도커린 도메인’ 혹은 ‘RBS-시그널 펩타이드-CelE-type 1 도커린 도메인’의 형태로 유전자를 만들었다.

모든 재조합 유전자들은 아래의 표와 같이 명명하였다.

유전자 증폭에 사용된 프라이머

재조합 유전자 표기명	실제 삽입된 유전자	프라이머	제한효소	프라이머 서열(5‘->3’)	서열번호	클로닝 방식
Sp::Msc	cg0955::NCgl1221 genes	cg0955-F	BamH1	aatggatccatgcaaataaaccgccgagg	15	T4 DNA ligation
		cg0955-R(ov)	-	gcatgggatctgcttgaagggcgttgg	16
		Msc-F(ov)	-	ccttcaagcagatcccatgcgtattatcaagc	17
		Msc-R	Kpn1	aatggtaccgtacccaccgtagtgggc	18
Sp::Msc::mCbpA	cg0955::NCgl1221::mCbpA genes	Msc-mCbpA-F	-	cactacggtgggtacggtaacagcagcgacatcatcaatg	19	Gibson assembly
Sp::Msc::mCbpA	cg0955::NCgl1221::mCbpA genes	Gb-mCbpA-R	Kpn1	agtgaattcgagctcggtacctcatataggatctccaatatttattgtaac	20	Gibson assembly
Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc	cg0955::NCgl1221::mCbpA::RBS::cg0955::Clocel3193 genes	Gb-mCbpA-Clocel3193-F	-	ggagatcctatatgaggtaaccgacaaggagatatacatg	21	Gibson assembly
Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc		Gb-mCbpA-Clocel3193-R	Kpn1	agtgaattcgagctcggtacctcaactaagtaattttttctttaaaag	22	Gibson assembly
Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc	cg0955::NCgl1221::mCbpA::RBS::cg0955::CelE genes	Gb-Clocel3193-CelE-F	-	aaattacttagttgaggtaaccgacaaggagatatacatg	23	Gibson assembly
Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc	cg0955::NCgl1221::mCbpA::RBS::cg0955::Clocel3193::RBS::cg0955::CelE genes	Gb-Clocel3193-CelE-R	Kpn1	agtgaattcgagctcggtacctcataaaagcatttttttaagaacag	24	Gibson assembly

<실시예 3>

외분비 키티네이즈, 외분비 셀룰레이즈, 세포외 고정화 mCbpA가 통합된 효소 복합체 클로닝과 코리네박테리움 글루타미쿰으로의 도입과 배양

상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>에서 PCR을 통해 증폭된 재조합 유전자를 ligation kit와 Gibson assembly kit를 이용하여 글루타미쿰 벡터 중 하나인 pEKEx2 벡터클로닝하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 13032 (Corynebacterium glutamicum 13032)에 전기천공법으로 형질전환 하였다. 이렇게 만들어진 재조합 벡터들을 아래의 표와 같이 명명하였고, 벡터들에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다. 또한 재조합 벡터들이 도입되어 만들어지는 최종 균주의 모식도는 도면 2에 나타내었다.

형질전환체의 효소 및 단백질을 발현하기 위한 배양을 수행하였다. 형질전환체를 카나마이신(Kanamycin)이 함유된 LB 배지에 접종하여 24시간 동안 30℃에서 배양하고 원심분리기를 통해 배지 상등액이 제거된 세포를 모았다. 앞서 모든 세포를 1mM IPTG (Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside)와 카나마이신을 함유한 BT 배지로 옮겨 48시간 동안 배양한 뒤 원심 분리하여 세포와 상등액을 확보하였다.

제조합 벡터

재조합 벡터명	벡터와 삽입된 유전자명	클로닝 방식
pEKEx2::Sp::NAG doc	pEKEx2 carrying cg0955::Clocel3193 genes	T4 DNA ligation
pEKEx2::Sp::CelEdoc	pEKEx2 carrying cg0955::CelE genes	T4 DNA ligation
pEKEx2::Sp::Msc	pEKEx2 carrying cg0955::Ncgl1221 genes	T4 DNA ligation
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA	pEKEx2 carrying cg0955::Ncgl1221::mCbpA genes	Gibson assembly
pEKEx2::sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc	pEKEx2 carrying cg0955::Ncgl1221::mCbpA::RBS::cg0955::Clocel3193 genes	Gibson assembly
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc	pEKEx2 carrying cg0955::Ncgl1221::mCbpA::RBS::cg0955::CelE genes	Gibson assembly
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc	pEKEx2 carrying cg0955::Ncgl1221::mCbpA::RBS::cg0955::Clocel3193::RBS::cg0955::CelE genes	Gibson assembly

<실시예 4>

곰팡이를 이용한 리그노셀룰로직 바이오매스 전처리, 헤미셀룰로오스 및 리그닌 분해 분석과 제거

상기 <실시예 3>에서 확보한 형질전환체의 분해 기질로 사용하기 위해, 리그노셀룰로직 바이오매스 중 볏짚을 선택하여 곰팡이를 이용한 전처리 과정 (헤미셀룰로오스와 리그닌 제거)을 수행하였다. 1% NaOH를 1시간 30분 간 볏짚에 처리한 후, HCl로 pH7.0까지 적정하였다. 이후 증류수로 2번 씻고 50도 드라이오븐에서 말렸다. 알펙스 락테우스 (Irpex lacteus)곰팡이를 PBA (Potato dextrose agar)에 7일간 배양하였다. 고체 배양한 알펙스 락테우스를 1 L의 PDB (Potato dextrose broth)로 옮겨 액체 배양하였다. 앞서 NaOH 처리하여 말린 볏짚 20 g을 멸균한 뒤 액체 배양한 곰팡이를 접종하여 21일간 배양하였다. 배양 과정 중 상등액을 일부 추출하여 DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid)와 HPLC (High-performance liquid chromatography)를 통해 나오는 환원당과 당의 종류, 양을 측정하였다. 분해되서 나오는 리그닌 (ASL; Acid soluble lignin)은 205 nm에서 microplate reader기를 통해 측정하였다.

배양이 종료된 후, 해당 볏짚은 증류수를 통해 2번 씻고 50℃ 드라이 오븐에서 말린 후 가루 형태로 갈았다. 관련 결과들은 도 3 내지 5에 나타내었다.

먼저, 볏집에 곰팡이를 전처리한 후 시간 경과에 따른 배양 상등액에 방출되는 환원당을 측정하여 헤미셀룰로오스 분해를 분석하였다. 그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 볏집에 곰팡이를 전처리하는 경우 10일이 경화한 후부터 17일까지 환원당이 가파르게 증대되는 것으로 나타났으며, 17일 이후부터는 환원당이 감소되는 추세를 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 리그노셀룰로직 바이오매스에 곰팡이를 전처리하는 경우 10일부터 17일까지 헤미셀룰로오스 분해가 본격적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 볏집에 곰팡이를 전처리한 후 시간 경과에 따른 배양 상등액에 방출되는 환원당의 종류를 분석하였다. 그 결과 하기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 환원당으로 헤미셀룰로오스의 성분인 자일로트리오스(Xylotriose)가 주로 방출되는 것으로 나타났으며, 이외에 셀룰로오스의 성분인 소량의 글루코오스도 방출되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 곰팡이 전처리 과정 동안 리그노셀룰로오스의 헤미셀룰로오스 부분이 주로 분해되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 볏집에 곰팡이를 전처리한 후 시간 경과에 따른 배양 상등액에 방출되는 리그닌의 변화를 분석하였다. 그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 볏집에 곰팡이를 전처리한 후 3일이 경과한 후부터 리그닌의 분해가 이루어지는 것으로 나타났으며, 특히, 곰팡이 전처리한 다음 10일 이후부터 15일까지 리그닌의 분해가 집중적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

볏집에 곰팡이 전처리 후 시간 당 상등액에 방출되는 환원당의 종류

환원당 종류	당 농도 (g/L)
환원당 종류	볏집	곰팡이 전처리
자일로오스	0.035±0.021	-
자일로바이오스	-	-
자일로트리오스	-	3.8±0.028
자일로테트라오스	-	-
자일로펜타오스	-	-
자일로헥사오스	-	-
아라비노오스	-	-
글루코오스	-	0.17±0
셀로비오스	-	-
셀로트리오스	-	-
셀로테트라오스	-	-
셀로펜타오스	-	-
셀로헥사오스	-	-

<실시예 5>

초록 형광 단백질-도커린 (GFP-doc)을 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 외부 효소 복합체 확인

상기 <실시예 3>에서 확보한 형질전환체 중 mCbpA의 발현을 확인하기 위해, 대장균에서 초록 형광 단백질-도커린(GFP-doc)을 발현하여 부착 반응을 수행하였다. 초록 형광 단백질-도커린의 발현을 유도하기 위해 암피실린 (Ampicillin)이 포함된 LB 배지에 접종하여 24시간 동안 37℃에서 사전 배양하였다. 이후 암피실린이 포함된 1 L의 LB 배지에 사전배양액을 접종하고 600 nm에서의 optical density (O.D.600)가 1.0 정도 일때 초록 형광 단백질-도커린 발현을 유도하기 위해 유도제 (inducer)인 IPTG를 최종 농도 1 mM로 투입하였다. 18-20시간 동안 배양한 뒤 원심 분리하여 세포를 확보하였다. 이후 세포를 초음파를 이용하여 파쇄하고 원심 분리하여 상등액을 준비하고 농축하였다. 이미다졸 (imidazol) 농도 차이 (~20 mM)에 의한 친화성 크로마토그래피 방법을 이용해 단백질의 N-terminal에 연결되어 있는 His-tag으로 정제하였다. 초록 형광 단백질-도커린의 정량은 브레드포드 방식 (Bradford assay)를 통해서 진행하였다. 10 μl의 단백질 또는 효소에 400 μl의 브레드포드 (bradford)시약을 처리하고 잘 섞은 뒤 분광광도계 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기준이 되는 단백질은 알부민 (Albumin)을 사용하여 기준선과 농도를 잡고 정량 분석을 통해 단백질 및 사용한 효소의 농도를 측정하였다. 25 mM sodium acetate pH 6.0, 15 mM CaCl2, 7 μg의 초록 형광 단백질의 혼합액에 optical density 0.5의 세포를 넣고 4℃에서 18시간 정치하여 초록 형광 단백질-도커린과 세포외 mCbpA의 연결 반응을 진행하였다. 반응 후, 반응액은 원심분리하여 상등액을 회수하고 이를 485 nm (exitation), 535 nm (emission)의 microplate reader기로 측정하여 부착된 정도를 산출하였다. 대조군 세포는 pEKEx2 공벡터만 들어간 코리네박테리움 글루타미쿰을 사용하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, pEKEx2 공벡터가 도입된 균주에서는 초록 형광 단백질의 부착이 거의 나타나지 않은 반면, 본 발명의 pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA 재조합 벡터가 도입된 균주의 겨우 초록 형광 단백질의 부착능이 46.56%로 확인하였다.

<실시예 6>

코리네박테리움 글루타미쿰 세포 외부 효소 복합체의 효소적 활성 확인

상기 <실시예 3>에서 확보한 형질전환체의 효소적 활성을 확인하기 위해, 짧은 길이의 기질로 4-니트로페닐-베타-D-글루피라노사이드 (4-nitrophenyl-β-D-glupyranoside, 이하 간략하게 ‘pNPGlc’로 약칭함) 및 4-니트로페닐-N-아세틸-베타-D-글루코사미나이드 (4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide, 이하 간략하게 ‘pNPGln’로 약칭함)를 사용하였으며, 긴 길이의 기질로 아비셀 (Avicel) 및 카르복시메틸 셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose, 이하 간략하게 ‘CMC’로 약칭함)을 사용하였다. pNPGlc 및 pNPGln의 경우는 1 mM, Avicel 및 CMC 경우는 0.5중량%의 기질을 투입하고 10 mM 소듐 시트레이트 (sodium citrate) pH 6.0과 상기 <실시예 3>의 방식으로 배양한 형질전환체를 optical density 10이 되도록 반응액을 조성하였다. 본 반응액을 30℃에서 1시간, 18시간 반응하고 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 상등액의 산물을 405 nm (pNPGlc, pNPGln의 분해 산물인 4-니트로페놀 (4-nitrophenol)을 측정하기 위함), DNS 540 nm (Avicel과 CMC의 분해 산물인 글루코오스의 환원 말단 측정하기 위함)에서 측정하였다. 기준이 되는 물질로 4-니트로페놀 (4-nitrophenol)과 글루코오스를 이용해서 분해 산물을 정량하고 Unit/DCW (DCW; dry cell weight)로 환산하였다.

그 결과는 하기 표 5 내지 9, 및 도 6 내지 7에 자세히 나타내었다.

먼저, 짧은 길이를 가진 키틴 관련 기질인 pNPGlc에 상기 <실시예 3>에서 확보한 형질전환체를 적용하여 배양시킨 결과, 배양 상등액에서는 분해 산물인 4-니트로페놀이 매우 미미한 것으로 나타난 반면, 세포에서는 분해 산물이 높게 측정되었다. 자세하게는, pEKEx2::Sp::NAG doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 4.66±0.03 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 14.64±0.31 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 20.63±0.12 Unit/DCW의 분해 산물이 측정되었다. 특히, NAG 및 CelE가 동시에 도입된 세포 부착형 형질전환체에서 NAG 단일 유전자가 도입된 세포 부착형 형질전환체 대비 분해 산물이 약 1.41배 증대된 것을 확인할 수 있었다(표 5 및 도 6a 참조).

또한, 짧은 길이를 가진 셀룰로오스 관련 기질인 pNPGlc에 상기 <실시예 3>에서 확보한 형질전환체를 적용하여 배양시킨 결과, 배양 상등액에서는 분해 산물인 4-니트로페놀이 다소 미미한 것으로 나타난 반면, 세포에서는 분해 산물이 두드러지게 높게 측정되었다. 자세하게는, pEKEx2::Sp::NAG doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 1.13±0.02 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 1.11±3.90e-3 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 1.43±7.90e-3 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 1.25±0.07 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 1.54±0.07 Unit/DCW의 분해 산물이 측정되었다. 특히, NAG 및 CelE가 동시에 도입된 세포 부착형 형질전환체에서 CelE 단일 유전자가 도입된 세포 부착형 형질전환체 대비 분해 산물이 약 1.23배 증대된 것을 확인할 수 있었다(표 6 및 도 6b 참조).

또한, 긴 길이를 가진 셀룰로오스 관련 기질인 아비셀 (Avicel)에 상기 <실시예 3>에서 확보한 형질전환체를 적용하여 배양시킨 결과, 배양 상등액에서는 분해 산물인 글루코오스가 다소 미미한 것으로 나타난 반면, 세포에서는 분해 산물이 높게 측정되었다. 자세하게는, pEKEx2::Sp::NAG doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 7.26e-3±2.96e-5 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 8.33e-3±2.37e-4 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 7.26e-3±2.96e-5 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 0.01±1.18e-4 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 0.02±5.92e-5 Unit/DCW의 분해 산물이 측정되었다. 특히, NAG 및 CelE가 동시에 도입된 세포 부착형 형질전환체에서 CelE 단일 유전자가 도입된 세포 부착형 형질전환체 대비 분해 산물이 약 2.00배 증대된 것을 확인할 수 있었다(표 7 및 도 7a 참조).

또한, 긴 길이를 가진 셀룰로오스 관련 기질인 아비셀 CMC에 상기 <실시예 3>에서 확보한 형질전환체를 적용하여 배양시킨 결과, 배양 상등액에서는 분해 산물인 글루코오스가 매우 미미한 것으로 나타난 반면, 세포에서는 분해 산물이 상대적으로 높게 측정되었다. 자세하게는, pEKEx2::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 8.81e-3±2.85e-3 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 0.033±3.72e-3 Unit/DCW, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 균주를 적용한 경우 0.06±1.31e-3 Unit/DCW의 분해 산물이 측정되었다. 특히, NAG 및 CelE가 동시에 도입된 세포 부착형 형질전환체에서 CelE 단일 유전자가 도입된 세포 부착형 형질전환체 대비 분해 산물이 약 2.00배 증대된 것을 확인할 수 있었다(표 8 및 도 7b 참조).

상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc 벡터가 도입된 형질전환체의 경우, 세포 외벽에 키티네이즈와 셀룰레이즈 효소 복합체가 고정화됨으로써 키틴 및 셀룰로오스를 효과적으로 분해할 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 형질전환체의 pNPGln (키틴 관련 기질)에 대한 효소적 활성

재조합 균주	Unit/g of dry cell weight
재조합 균주	상등액 (Sup)	세포 (Cell)
pEKEx2	0.28±0.01	0.15±0.02
pEKEx2::Sp::NAG doc	0.04±0.00	4.66±0.03
pEKEx2::Sp::CelE doc	0.10±3.90e-3	0.61±0.02
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc	0.05±3.90e-3	14.64±0.31
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc	0.61±0.02	1.40±4.70e-3
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc	0.13±8.00e-3	20.63±0.12

본 발명의 형질전환체의 pNPGlc (셀룰로오스 관련 기질)에 대한 효소적 활성

재조합 균주	Unit/g of dry cell weight
재조합 균주	상등액 (Sup)	세포 (Cell)
pEKEx2	0.10±3.90e-3	0.15±7.90e-3
pEKEx2::Sp::NAG doc	0.06±7.90e-3	1.13±0.02
pEKEx2::Sp::CelE doc	0.11±4.00e-3	1.11±3.90e-3
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc	0.08±7.90e-3	1.43±7.90e-3
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc	0.21±0.00	1.25±0.07
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc	0.11±7.90e-3	1.54±0.07

본 발명의 형질전환체의 Avicel (셀룰로오스 관련 기질)에 대한 효소적 활성

재조합 균주	Unit/g of dry cell weight
재조합 균주	상등액 (Sup)	세포 (Cell)
pEKEx2	7.20e-4±0.00	7.45e-4±0.00
pEKEx2::Sp::NAG doc	7.19e-4±2.96e-5	7.26e-3±2.96e-5
pEKEx2::Sp::CelE doc	7.18e-4±2.94e-5	8.33e-3±2.37e-4
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc	7.19e-4±0.00	7.26e-3±2.96e-5
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc	7.19e-4±2.98e-5	0.01±1.18e-4
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc	7.20e-4±2.96e-5	0.02±5.92e-5

본 발명의 형질전환체의 CMC (셀룰로오스 관련 기질)에 대한 효소적 활성

재조합 균주	Unit/g of dry cell weight
재조합 균주	상등액 (Sup)	세포 (Cell)
pEKEx2	1.98e-5±0.00	1.84e-3±0.00
pEKEx2::Sp::NAG doc	2.00e-5±6.00e-5	1.06e-3±6.57e-4
pEKEx2::Sp::CelE doc	1.99e-5±0.00	8.81e-3±2.85e-3
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc	2.02e-5±6.53e-5	9.09e-4±0.00
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc	1.94e-5±7.00e-5	0.03±3.72e-3
pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc	1.93e-5±. 6.00e-5	0.06±1.31e-3

<실시예 7>

곰팡이 전처리된 리그노셀룰로직 바이오매스를 이용한 세포 외부 효소 복합체가 부착된 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 성장 확인

상기 <실시예 4>에서 확보한 곰팡이 전처리된 볏짚을 분해하여 형질전환체가 성장하는 것을 확인하기 위해, 곰팡이 전처리된 볏짚이 포함된 배지에 형질전환체를 배양하고 성장 정도를 측정하였다. 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 사전 배양한 형질전환체들을 원심분리하여 세포만을 회수하였다. 회수된 세포들을 곰팡이 전처리된 기질 1 g이 포함된 100 ml BT media로 옮겨 30도 180 rpm에서 48시간동안 배양하였다. 배양 과정 동안 배양액을 추출하여 세포 성장정도를 optical density 600 nm에서 측정하였다.

그 결과는 하기 표 9 내지 10, 및 도 8 내지 9에 자세히 나타내었다.

먼저, 소형 골격단백질(mCbpA) 유전자가 도입되지 않은 균주(pEKEx2, pEKEx2::Sp::Msc::Sp::NAG doc, pEKEx2::Sp::Msc::Sp::CelE doc)와 비교하여 mCbpA 유전자가 도입된 균주(pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc)에서 세포 성장이 두드러지게 우수한 것을 확인하였다(표 9 및 도 8 참조). 소형 골격단백질(mCbpA)은 코헤신 모듈(Cohesin module) 및 탄수화물 결합 모듈(carbohydrate binding module)을 포함하고 있는바, 상기 유전자가 도입되지 않는 경우 효소를 세포 외부에 부착하는 것이 불가능하다. 따라서, 상기와 같은 결과를 통해 효소가 세포 외부에 미부착된 균주 대비 효소가 세포 외부에 부착된 균주에서 세포 성장이 매우 효과적인 것을 확인할 수 있었다.

또한, NAG 또는 CelE의 단일 유전자가 도입된 균주(pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc, pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc) 대비 상기 2종의 유전자가 동시에 도입된 균주(pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::NAG doc)에서 세포 성장이 가장 우수한 것을 확인하였다(표 10 및 도 9 참조). 이를 통해 효소의 세포 부착시, 효소에 의해 분해된 탄소원을 빠르게 세포에 전달하여 세포의 성장이 더 많이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

세포 외부 효소 복합체가 부착된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 vs 효소 미부착된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 세포 성장 비교

시간 (h)	세포 성장 (O.D. 600)
시간 (h)	pEKEx2	pEKEx2::Sp::Msc::Sp::NAG doc	pEKEx2::Sp::Msc::Sp::CelE doc	pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::NAG doc
0	0.00±9.19e-3	0.00±8.49e-3	0.00±9.19e-3	0.00±8.49e-3
12	0.3030±7.78e-3	0.16±9.19e-3	0.31±0.01	0.73±0.09
24	0.37±5.66e-3	0.32±0.03	0.53±0.03	0.78±7.07e-3
36	0.43±0.03	0.54±0.02	0.73±8.49e-3	2.18±0.15
48	0.47±0.08	0.68±0.05	0.49±0.08	1.95±0.12

세포 외부 효소 복합체가 부착된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 vs 단일 효소가 부착된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 세포 성장 비교

시간 (h)	세포 성장 (O.D. 600)
시간 (h)	pEKEx2	pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc	pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::CelE doc	pEKEx2::Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::NAG doc
0	0.00±9.19e-3	0.00±8.49e-3	0.00±0.00	0.00±8.49e-3
12	0.30±7.78e-3	0.72±0.11	0.44±0.02	0.73±0.09
24	0.37±5.66e-3	1.22±5.66e-3	0.57±7.78e-3	0.78±7.07e-3
36	0.43±0.03	1.94±0.04	0.87±0.02	2.18±0.15
48	0.47±0.08	2.10±0.10	0.63±0.04	1.95±0.12

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Whole cell biocatalyst of recombinant microorganism displaying chitinase and cellulase on cellulosome and a lignocellulosic biomass degradation method using the same <130> NPDC-100399 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 99 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgcaaataa accgccgagg cttcttaaaa gccaccgcag gacttgccac tatcggcgct 60 gccagcatgt ttatgccaaa ggccaacgcc cttcaagca 99 <210> 2 <211> 1280 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <400> 2 gatcccatgc gtattatcaa gcgccgagtg gagtctgcag ccgatgcgga caccactaag 60 aaccagctcg cgttcgccgg cgttggcgtt tatatcgcgc aaattgtggc gtttttcatg 120 cttgccgtct ccgcgatgca ggcttttggt ttctctctcg cgggcgctgc gattccggca 180 accattgcgt cagctgccat tggccttggt gcgcagtcga ttgttgcgga cttcttggcc 240 ggatttttca tcctgacgga aaagcaattc ggcgtgggtg actgggtgcg ttttgagggc 300 aacggcatcg ttgtcgaagg caccgtcatt gagatcacca tgcgcgcgac caaaattcgc 360 acgattgcac aagagaccgt gatcatcccc aactccacgg cgaaagtgtg catcaacaat 420 tctaataact ggtcgcgtgc ggttgtcgtt attccgatcc ccatgttggg ttctgaaaac 480 atcacagatg tcatcgcgcg ctctgaagct gcgactcgtc gcgcacttgg ccaggagaaa 540 atcgcaccgg aaatcctcgg tgaactcgat gtgcacccag ccacggaagt cacgccgcca 600 acggtggtcg gcatgccgtg gatggtcacc atgcgtttcc tcgtgcaagt caccgccggc 660 aatcaatggc tggtcgaacg cgccatccgc acagaaatca tcagcgaatt ctgggaagaa 720 tacggcagcg caaccactac atcgggaacc ctcattgatt ccttacacgt tgagcatgaa 780 gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc gaagccggag 840 gctgcggcga cggttgcatc gctagctgca tcctctaacg acgatgcaga caatgcagac 900 gcctcggtga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 960 gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1020 ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc 1080 cgcatgagca cgtccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggtcatg 1140 actgtggaac caagtgagaa ttggcaaaac tccagtggat ggctgtcacc aagcactgcc 1200 acctcaactg cggtgaccac ctccgaaact tccgcgccag taagcacgcc ttcgatgaca 1260 gtgcccacta cggtgggtac 1280 <210> 3 <211> 1650 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <400> 3 gcagcgacat catcaatgtc agttgaattt tacaactcta acaaatcagc acaaacaaac 60 tcaattacac caataatcaa aattactaac acatctgaca gtgatttaaa tttaaatgac 120 gtaaaagtta gatattatta cacaagtgat ggtacacaag gacaaacttt ctggtgtgac 180 catgctggtg cattattagg aaatagctat gttgataaca ctagcaaagt gacagcaaac 240 ttcgttaaag aaacagcaag cccaacatca acctatgata catatgttga atttggattt 300 gcaagcggag cagctactct taaaaaagga caatttataa ctattcaagg aagaataaca 360 aaatcagact ggtcaaacta cactcaaaca aatgactatt catttgatgc aagtagttca 420 acaccagttg taaatccaaa agttacagga tatataggtg gagctaaagt acttggtaca 480 gcaccaggtc cagatgtacc atcttcaata attaatccta cttctgcaac atttgataaa 540 aatgtaacta aacaagcaga tgttaaaact actatgactt taaatggtaa cacatttaaa 600 acaattacag atgcaaacgg tacagctcta aatgcaagca ctgattatag tgtttctgga 660 aatgatgtaa caataagcaa agcttattta gcaaaacaat cagtaggaac aactacatta 720 aactttaact ttagtgcagg aaatcctcaa aaattagtaa ttacagtagt tgacacacca 780 gttgaagctg taacagctac aattggaaaa gtacaagtaa atgctggaga aacggtagca 840 gtaccagtta acttaacaaa agttccagca gctggtttag caacaattga attaccatta 900 acttttgatt ctgcatcatt agaagtagta tcaataactg ctggagatat cgtattaaat 960 ccatcagtaa acttctcttc tacagtaagt ggaagcacaa taaaattatt attcttagat 1020 gatacattag gaagccaatt aatcactaag gatggagttt ttgcaacaat aacatttaaa 1080 gcaaaagcta taactggaac aactgcaaaa gtaacttcag ttaaattagc tggaacacca 1140 gtagttggtg atgcgcaatt acaagaaaaa ccttgtgcag ttaacccagg aacagtaact 1200 atcaatccaa tcgataatag aatgcaaatt tcagttggaa cagcaacagt aaaagctgga 1260 gaaatagcag cagtgccagt aacattaaca agtgttccat caactggaat agcaactgct 1320 gaagcacaag taagttttga tgcaacatta ttagaagtag catcagtaac tgctggagat 1380 atcgtattaa atccaacagt aaacttctct tatacagtaa acggaaatgt aataaaatta 1440 ttattcctag atgatacatt aggaagccaa ttaattagta aagatggagt ttttgtaaca 1500 ataaacttca aagcaaaagc tgtaacaagc acagtaacaa caccagttac agtatcagga 1560 acacctgtat ttgcagatgg tacattagca gaagtacaat ctaaaacagc agcaggtagc 1620 gttacaataa atattggaga tcctatatga 1650 <210> 4 <211> 1704 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <400> 4 ataaatttca ctgtaagtta tacttcagca gtgggaaaga ctgaaaatta tacttgtgca 60 acaagagatt ccttttatga tttgaatgat aattcagtta acagagctac ttcagaacat 120 ttccaaataa tttggggaaa tggtgatact acaggaactg ttaatcaaga attagtaaaa 180 ggtaatttac aaaacctaga ggcaataaga gatttctatg ttaatgtaat gggctttgta 240 gatactagtg tatctgttaa tagtccacta actagcagca atcactacaa aacaaatgtg 300 tacatatcca atactggact ttcaaagatt acagatgatt gggcatatat gtcttctgac 360 ggagaaggct ttgctttctt agttttacat ccaggagcta tgcgtgttga cccaccaagt 420 tgggtagttc ctcacgaata tgctcatgcc attactatgc atcaacgtgg tgttatcgat 480 gctccttggt atgaagtaac agcaaattgg ttcagagatc aatatttagg aagtagtttt 540 tataagtatg gaaataatgt ttatggacct gattcagact tctttaggcc aatagtcttg 600 aactcagact actactttcc acatttgaag aactattatg atgcttggcc attcttacta 660 tatgtaactg aaaatcctga ccaaatgaaa ggattaggtc ttgaagtaat gaaagcgatg 720 tttaaggaca ctaataatga agttatgttt aagaaattag agagattatc tggaacatct 780 gctaaagata tgttaggtgg ctatgctaga agaatggtaa cctttgattt taagagacaa 840 gctaattata aaaaatatta tgatgaatta atagcagagg acagtgcaaa ttataataaa 900 atttatacaa ccttagaaaa tgatagtaat ggatggttta aggttcctag ctcaagggct 960 ccacaacaag gtggatataa tattattcca cttaacatag atctaaagag taagcaggta 1020 gtcgttaatt ttcaaggaaa tagttcagaa gtaggggcag attggcgtgc aagcattgtt 1080 gctaaaacaa aaactggaca aactagatat tctacaatgt ggaatagtgg aactaacact 1140 ttgaatctac aaggagatga agaaaaagtt tatcttgtag tatgtgcaac tccgaaggaa 1200 atgcttaatt taacttcatt tgatttagat gtagtaggaa caagatatcc atataaagtg 1260 caaatatcaa cgaatagcgc tgtttcaaag gtagaaatgc caactgttag tgtagcagca 1320 ggtagttaca atgctgcaca aacaatatca cttagcagta aaacttcagg tacaactata 1380 tattatacac ttgacggaag tactccaaca gcttcatcta ctgcctatag tagtccgata 1440 gtagtatcaa aaaatacaac tattaaggct gttgcaataa agagtggaat gacaaactct 1500 gatataactt ctgctacata tacaatttct ataattggtg atgttaatga agatggtcgt 1560 gtaaatgcaa ttgattatgc caatattaag agctatttac tggctaattc aacaaagata 1620 aatttaaaga acgcagatat gaataatgat agtaaagtaa atgccatcga tttagcactt 1680 ttaaagaaaa aattacttag ttga 1704 <210> 5 <211> 1326 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 tcgggaacaa agcttttgga tgcaagcgga aacgagcttg taatgagggg catgcgtgat 60 atttcagcaa tagatttggt taaagaaata aaaatcggat ggaatttggg aaatactttg 120 gatgctccta cagagactgc ctggggaaat ccaaggacaa ccaaggcaat gatagaaaag 180 gtaagggaaa tgggctttaa tgccgtcaga gtgcctgtta cctgggatac gcacatcgga 240 cctgctccgg actataaaat tgacgaagca tggctgaaca gagttgagga agtggtaaac 300 tatgttcttg actgcggtat gtacgcgatc ataaatgttc accatgacaa tacatggatt 360 atacctacat atgccaatga gcaaaggagt aaaaaaaaac ttgtaaaagt ttgggaacaa 420 atagcaaccc gttttaaaga ttatgacgac catttgttgt ttgagacaat gaacgaaccg 480 agagaagtag gttcacctat ggaatggatg ggcggaacgt atgaaaaccg agatgtgata 540 aacagattta atttggcggt tgttaatacc atcagagcaa gcggcggaaa taacgataaa 600 agattcatac tggttccgac caatgcggca accggcctgg atgttgcatt aaacgacctt 660 gtcattccga acaatgacag cagagtcata gtatccatac atgcttattc accgtatttc 720 tttgctatgg atgtcaacgg aacttcatat tggggaagtg actatgacaa ggcttctctt 780 acaagtgaac ttgatgctat ttacaacaga tttgtgaaaa acggaagggc tgtaattatc 840 ggagaattcg gaaccattga caagaacaac ctgtcttcaa gggtggctca tgccgagcac 900 tatgcaagag aagcagtttc aagaggaatt gctgttttct ggtgggataa cggctattac 960 aatccgggtg atgcagagac ttatgcattg ctgaacagaa aaactctctc atggtattat 1020 cctgaaattg tccaggctct tatgagaggt gccggcgttg aacctttagt ttcaccgact 1080 cctacaccta cattaatgcc gaccccctcg cccacgatga cagcaaatat tttgtacggt 1140 gatgttaaca aagatggaaa ggtaaatgct atcgattatg cagtgcttaa atcaattctt 1200 ttaggtacaa atactaacgt tgatttatca gtatcagaca tgaataagga tggtaaagta 1260 aatgctttgg atttagctgt tcttaaaaaa atgcttttag attacaagga tgacgacgat 1320 aagtga 1326 <210> 6 <211> 6284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of Sp::Msc::mCbpA::Sp::NAG doc::Sp::CelE doc <400> 6 atgcaaataa accgccgagg cttcttaaaa gccaccacag gacttgccac tatcggcgct 60 gccagcatgt ttatgccaaa ggccaacgcc cttggagcag atcccatgcg tattatcaag 120 cgccgagtgg agtctgcagc cgatgcggac accactaaga accagctcgc gttcgccggc 180 gttggcgttt atatcgcgca aattgtggcg tttttcatgc ttgccgtctc cgcgatgcag 240 gcttttggtt tctctctcgc gggcgctgcg attccggcaa ccattgcgtc agctgccatt 300 ggccttggtg cgcagtcgat tgttgcggac ttcttggccg gatttttcat cctgacggaa 360 aagcaattcg gcgtgggtga ctgggtgcgt tttgagggca acggcatcgt tgtcgaaggc 420 accgtcattg agatcaccat gcgcgcgacc aaaattcgca cgattgcaca agagaccgtg 480 atcatcccca actccacggc gaaagtgtgc atcaacaatt ctaataactg gtcgcgtgcg 540 gttgtcgtta ttccgatccc catgttgggt tctgaaaaca tcacagatgt catcgcgcgc 600 tctgaagctg cgactcgtcg cgcacttggc caggagaaaa tcgcaccgga aatcctcggt 660 gaactcgatg tgcacccagc cacggaagtc acgccgccaa cggtggtcgg catgccgtgg 720 atggtcacca tgcgtttcct cgtgcaagtc accgccggca atcaatggct ggtcgaacgc 780 gccatccgca cagaaatcat cagcgaattc tgggaagaat acggcagcgc aaccactaca 840 tcgggaaccc tcattgattc cttacacgtt gagcatgaag agccaaagac ctcgcttatc 900 gacgcctccc cccaggctct taaggaaccg aagccggagg ctgcggcgac ggttgcatcg 960 ctagctgcat cctctaacga cgatgcagac aatgcagacg cctcggtgat caatgcaggc 1020 aatccagaga aggaacttga ttccgatgtg ctggaacaag aactctccag cgaagaaccg 1080 gaagaaacag caaaaccaga tcactctctc cgaggcttct tccgcactga ttactaccca 1140 aatcggtggc agaagatcct gtcgtttggc ggacgtgtcc gcatgagcac gtccctgttg 1200 ttgggtgcgc tgctcttgct gtcactattt aaggtcatga ctgtggaacc aagtgagaat 1260 tggcaaaact ccagtggatg gctgtcacca agcactgcca cctcaactgc ggtgaccacc 1320 tccgaaactt ccgcgccagt aagcacgcct tcgatgacag tgcccactac ggtgggtacg 1380 gtaacagcag cgacatcatc aatgtcagtt gaattttaca actctaacaa atcagcacaa 1440 acaaactcaa ttacaccaat aatcaaaatt actaacacat ctgacagtga tttaaattta 1500 aatgacgtaa aagttagata ttattacaca agtgatggta cacaaggaca aactttctgg 1560 tgtgaccatg ctggtgcatt attaggaaat agctatgttg ataacactag caaagtgaca 1620 gcaaacttcg ttaaagaaac agcaagccca acatcaacct atgatacata tgttgaattt 1680 ggatttgcaa gcggagcagc tactcttaaa aaaggacaat ttataactat tcaaggaaga 1740 ataacaaaat cagactggtc aaactacact caaacaaatg actattcatt tgatgcaagt 1800 agttcaacac cagttgtaaa tccaaaagtt acaggatata taggtggagc taaagtactt 1860 ggtacagcac caggtccaga tgtaccatct tcaataatta atcctacttc tgcaacattt 1920 gataaaaatg taactaaaca agcagatgtt aaaactacta tgactttaaa tggtaacaca 1980 tttaaaacaa ttacagatgc aaacggtaca gctctaaatg caagcactga ttatagtgtt 2040 tctggaaatg atgtaacaat aagcaaagct tatttagcaa aacaatcagt aggaacaact 2100 acattaaact ttaactttag tgcaggaaat cctcaaaaat tagtaattac agtagttgac 2160 acaccagttg aagctgtaac agctacaatt ggaaaagtac aagtaaatgc tggagaaacg 2220 gtagcagtac cagttaactt aacaaaagtt ccagcagctg gtttagcaac aattgaatta 2280 ccattaactt ttgattctgc atcattagaa gtagtatcaa taactgctgg agatatcgta 2340 ttaaatccat cagtaaactt ctcttctaca gtaagtggaa gcacaataaa attattattc 2400 ttagatgata cattaggaag ccaattaatc actaaggatg gagtttttgc aacaataaca 2460 tttaaagcaa aagctataac tggaacaact gcaaaagtaa cttcagttaa attagctgga 2520 acaccagtag ttggtgatgc gcaattacaa gaaaaacctt gtgcagttaa cccaggaaca 2580 gtaactatca atccaatcga taatagaatg caaatttcag ttggaacagc aacagtaaaa 2640 gctggagaaa tagcagcagt gccagtaaca ttaacaagtg ttccatcaac tggaatagca 2700 actgctgaag cacaagtaag ttttgatgca acattattag aagtagcatc agtaactgct 2760 ggagatatcg tattaaatcc aacagtaaac ttctcttata cagtaaacgg aaatgtaata 2820 aaattattat tcctagatga tacattagga agccaattaa ttagtaaaga tggagttttt 2880 gtaacaataa acttcaaagc aaaagctgta acaagcacag taacaacacc agttacagta 2940 tcaggaacac ctgtatttgc agatggtaca ttagcagaag tacaatctaa aacagcagca 3000 ggtagcgtta caataaatat tggagatcct atatgaggta accgacaagg agatatacat 3060 gcaaataaac cgccgaggct tcttaaaagc caccgcagga cttgccacta tcggcgctgc 3120 cagcatgttt atgccaaagg ccaacgccct tcaagcaata aatttcactg taagttatac 3180 ttcagcagtg ggaaagactg aaaattatac ttgtgcaaca agagattcct tttatgattt 3240 gaatgataat tcagttaaca gagctacttc agaacatttc caaataattt ggggaaatgg 3300 tgatactaca ggaactgtta atcaagaatt agtaaaaggt aatttacaaa acctagaggc 3360 aataagagat ttctatgtta atgtaatggg ctttgtagat actagtgtat ctgttaatag 3420 tccactaact agcagcaatc actacaaaac aaatgtgtac atatccaata ctggactttc 3480 aaagattaca gatgattggg catatatgtc ttctgacgga gaaggctttg ctttcttagt 3540 tttacatcca ggagctatgc gtgttgaccc accaagttgg gtagttcctc acgaatatgc 3600 tcatgccatt actatgcatc aacgtggtgt tatcgatgct ccttggtatg aagtaacagc 3660 aaattggttc agagatcaat atttaggaag tagtttttat aagtatggaa ataatgttta 3720 tggacctgat tcagacttct ttaggccaat agtcttgaac tcagactact actttccaca 3780 tttgaagaac tattatgatg cttggccatt cttactatat gtaactgaaa atcctgacca 3840 aatgaaagga ttaggtcttg aagtaatgaa agcgatgttt aaggacacta ataatgaagt 3900 tatgtttaag aaattagaga gattatctgg aacatctgct aaagatatgt taggtggcta 3960 tgctagaaga atggtaacct ttgattttaa gagacaagct aattataaaa aatattatga 4020 tgaattaata gcagaggaca gtgcaaatta taataaaatt tatacaacct tagaaaatga 4080 tagtaatgga tggtttaagg ttcctagctc aagggctcca caacaaggtg gatataatat 4140 tattccactt aacatagatc taaagagtaa gcaggtagtc gttaattttc aaggaaatag 4200 ttcagaagta ggggcagatt ggcgtgcaag cattgttgct aaaacaaaaa ctggacaaac 4260 tagatattct acaatgtgga 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Sp-CelE-F <400> 11 aaaggatcca tgcaaataaa ccgccga 27 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_CelE_Sp-R(ov) <400> 12 aagctttgtt cccgatgctt gaagggcgtt gg 32 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Sp_CelE-F(ov) <400> 13 aacgcccttc aagcatcggg aacaaagctt ttggat 36 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Sp-CelE-R <400> 14 aatggtacct cagtggtggt ggtggtggtg taaaagcatt tttttaagaa cagctaaatc 60 60 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_cg0955-F <400> 15 aatggatcca tgcaaataaa ccgccgagg 29 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_cg0955-R(ov) <400> 16 gcatgggatc tgcttgaagg gcgttgg 27 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Msc-F(ov) <400> 17 ccttcaagca gatcccatgc gtattatcaa gc 32 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Msc-R <400> 18 aatggtaccg tacccaccgt agtgggc 27 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Msc-mCbpA-F <400> 19 cactacggtg ggtacggtaa cagcagcgac atcatcaatg 40 <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Gb-mCbpA-R <400> 20 agtgaattcg agctcggtac ctcatatagg atctccaata tttattgtaa c 51 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Gb-mCbpA-Clocel3193-F <400> 21 ggagatccta tatgaggtaa ccgacaagga gatatacatg 40 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Gb-mCbpA-Clocel3193-R <400> 22 agtgaattcg agctcggtac ctcaactaag taattttttc tttaaaag 48 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Gb-Clocel3193-CelE-F <400> 23 aaattactta gttgaggtaa ccgacaagga gatatacatg 40 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Gb-Clocel3193-CelE-R <400> 24 agtgaattcg agctcggtac ctcataaaag cattttttta agaacag 47

Claims

시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자;
기계수용채널을 코딩하는 유전자;
소형 골격단백질을 코딩하는 유전자;
키티네이즈를 코딩하는 유전자; 및
셀룰레이즈를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 유전자.
제1항에 있어서,
상기 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되며, 상기 기계수용채널를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, 상기 소형 골격단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자.
제1항에 있어서,
상기 키티네이즈는 엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈인 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자.
제1항에 있어서,
상기 셀룰레이즈는 엔도-1,4-베타-글루카네이즈인 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자.
제3항에 있어서,
상기 엑소-베타-엔-아세틸글루코사미니데이즈는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자.
제4항에 있어서,
상기 엔도-1,4-베타-글루카네이즈는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자.
제1항의 재조합 유전자를 포함하는 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 벡터.
제7항의 벡터가 도입된 리그노셀룰로직 바이오매스 (lignocellulosic biomass) 분해용 재조합 미생물.
제8항에 있어서,
상기 미생물은 세포 외벽에 키티네이즈 및 셀룰레이즈가 고정화되는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물
제8항에 있어서,
상기 미생물은 전세포 촉매 (Whole cell biocatalyst)로 사용되는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
제8항에 있어서,
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
a) 리그노셀룰로직 바이오매스에 곰팡이를 전처리하는 단계; 및
b) 전처리 과정을 거친 리그노셀룰로직 바이오매스에 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 방법.
제12항에 있어서,
상기 곰팡이는 알펙스 락테우스 (Irpex lacteus), 트라메테스 베르시콜라 (Trametes versicolor), 글로에오필룸 트라베움 (Gloeophyllum trabeum) 및 포미톱시스 팔루스트리스 (Fomitopsis palustris) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 리그노셀룰로직 바이오매스의 분해 방법.