CN103882046A - 一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用，该表面展示体系构建方法为：利用来源丁香假单胞菌的人工合成截短冰核蛋白的NC端为锚定蛋白与靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合构建了原核表达载体pET28NCD3，并将其转化到大肠杆菌BL21中，构建了羧酸酯酶D-1CarE3的大肠杆菌细胞表面展示工程菌BL21/pET28NCD3。在T7强启动子作用下，经IPTG诱导表达，成功实现了羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面活性的展示，并使用超低温冷冻干燥法制备全细胞催化剂D-1CarE3。全细胞催化剂D-1CarE3可应用于环境农残污染的处理。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术和分析技术领域，涉及一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用。
背景技术
羧酸酯酶（Carboxylesterases,EC3.1.1.1）是一类能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，广泛存在于动物、植物、微生物体参与生命代谢活动，其与脂肪酶同属于α/β水解酶家族成员，具有Ser-Asp-His三联体结构催化活性中心。微生物来源的羧酸酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换上等具有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性。这些独特性质使羧酸酯酶在食品、化工、制药、能源开发和环境保护等领域具有广阔的应用前景。
当今农药在控制农作物病虫害促进农作物增产的同时也带来了严重的环境污染问题。羧酸酯酶是一种重要的农药降解酶，对含有羧酸酯键的农药有水解作用，可以用于部分有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药以及拟除虫菊酯类农药的降解。微生物降解农药残留多数是依靠胞内酶的酶解作用，但由于野生菌株产酶能力有限、生长周期长、收集复杂、产量小，生产成本高，限制了其推广应用。利用细胞表面展示技术可以将靶蛋白羧酸酯酶转运和定位到细胞表面，无需分离纯化，是一种开发高效、可再生全细胞催化剂的新思路，适合工业大规模生产应用。
冰核蛋白的N端具有表面定位功能，而C端具有细胞表面引导和定位功能，利用NC端则有利于提高其对外源蛋白的高效展示作用。本文利用来源丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的人工合成截短的冰核蛋白（Genbank登录号AF013159）的NC端为锚定蛋白与来源脂环酸芽孢杆菌D-1（Alicyclobacillus tengchongensis strainCGMCC1504）靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3（Genbank登录号JQ034612）融合构建了原核表达质粒pET28NCD3，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建了羧酸酯酶D-1CarE3的大肠杆菌细胞表面展示工程菌BL21(DE3)/pET28NCD3。利用低温冷冻干燥法制备了全细胞催化剂D-1CarE3，并将其应用于氟氯氰菊酯的降解实验中，结果表明该全细胞催化剂对拟除虫菊酯农药氟氯氰菊酯有降解作用，此外发明专利“一种羧酸酯酶及其在农药马拉硫磷和西维因的降解中的应用”（申请 号：201210401222.4）还公开了该羧酸酯酶D-1CarE3具有降解有机磷类农药中的马拉硫磷和氨基甲酸酯类农药中的西维因，这些表明细胞表面展示羧酸酯酶D-1CarE3的全细胞催化剂可应用于环境多种农残污染的处理。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种环境友好、操作方便的羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统及全细胞催化剂其制备方法及应用。其技术方案如下：
一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统，该细胞表面展示系统中利用了人工合成截短的冰核蛋白inaK的NC端作为锚定蛋白并与靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合构建了重组质粒pET28NCD3。
一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示工程菌，利用本发明所述中的重组质粒pET28NCD3转化到表达宿主BL21(DE3)构建了细胞表面展示工程菌BL21(DE3)/pET28NCD3。
一种包含本发明所述工程菌BL21(DE3)/pET28NCD3全细胞催化剂D-1CarE3的制备方法，其特征在于，取本发明所述工程菌株以0.1%的体积比接种量接种于含50μg/mL卡那抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h，然后将此活化的菌液再以1%体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养4h，待菌体密度OD600=0.5左右，加入终浓度0.05mMIPTG20℃诱导培养20h，12000rpm离心5min，收集菌体，置于超低温冷冻真空干燥机上冻成细胞干粉即为全细胞催化剂D-1CarE3。
全细胞催化剂D-1CarE3在环境农残污染处理中的应用。称取1mg权利要求3所述全细胞催化剂D-1CarE3加入100μl100mg/ml的氟氯氰菊酯丙酮溶液中室温震荡反应60min,加入等体积的正己烷抽提，离心取上层液适量于硅胶G板上进行簿层层析分析催化产物，结果显示全细胞催化剂D-1CarE3能够降解拟除虫菊酯农药氟氯氰菊酯，可应用于环境农残污染的处理。
本发明的有益效果：本发明利用inaK-NC锚定蛋白成功将具有几种农药降解功能的羧酸酯酶D-1CarE3定位到细胞表面并具有生物催化活性，解决了细胞内提取其羧酸酯酶D-1CarE3难的问题，其全细胞催化剂D-1CarE3催化活性达到540U/g细胞干重，是张红星等人只利用inaK-N端锚定有机磷水解酶所获得的活性表达870倍以上。本发明所制备的全细胞催化剂D-1CarE3具有活细胞固定化酶的作用，将全细胞催化剂D-1CarE3放入甲醇溶液中耐受1h回收细胞测定其催化活性无损失，将全细胞催化剂D-1CarE3常温放置42d，全细胞催化剂D-1CarE3催化活性损失不到3%，全细胞催化剂D-1CarE3克服了原始酶的不 稳定性，不易回收利用的问题。本发明所制备的全细胞催化剂D-1CarE3可以直接喷洒到农残污染区，其制备方法和使用都很简单，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是pET28NCD3质粒构建图谱；
图2是BL21(DE3)/pET28NCD3细胞组分的Western blot分析图：1，为细胞质成分；2，为细胞内膜；3，为细胞外膜；4，为空质粒对照；5，为蛋白质Marker；
图3是全细胞催化剂D-1CarE3催化氟氯氰菊酯降解产物的簿层层析图，1,2,3,为实验组；CK为对照组；产物1和产物2为氟氯氰菊酯水解的两种产物；
图4是全细胞催化剂D-1CarE3稳定性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实验材料和试剂
1、菌株、载体或基因：脂环酸芽孢杆菌D-1（Alicyclobacillus tengchongensis strain CGMCC1504）为实验室保藏菌株。大肠杆菌Escherichia coliBL21（DE3）和表达载体pET-28a(+)购于Novagen公司，大肠杆菌Escherichia coli TransT1购自全式金公司，ianK-NC为来源丁香假单胞菌Pseudomonas syringae的人工合成冰核蛋白（inaK）且去除中间重复序列只剩冰核蛋白的N端和C端核苷酸序列，二者连接处人为设计了“GTCGAC”SalⅠ酶切位点，以备用于切除C端序列。人工合成的ianK-NC由载体pGH携带，为上海捷瑞公司完成。
2、酶类及其它生化试剂：CIAP、限制性内切酶、DNA聚合酶和dNTP均购自TaKaRa公司；T4连接酶购自Promega公司；p-nitrophenyl butyrate(简称pNPB)和氟氯氰菊酯购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。
3、培养基：
LB培养基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，pH自然（约为7.0）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1：pET28NCD3质粒的构建
提取脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA：CTAB裂解法，具体步骤为：将液体培养12h的新鲜菌液离心取菌体，加入800μL溶液Ⅰ（20mMTris,pH8.0,2mMNa2-EDTA,终浓度 20mg/mL溶菌酶），37℃保温30min，加100μL10%SDS上下颠倒混匀，再加10μL10mg/mL的蛋白酶K，37℃保温30min，加150μL5MNaCl和150μL10%CTAB溶液上下颠倒混匀，65℃保温20min，加入等体积的酚/氯仿/异丙醇（体积比25：24：1）进行抽提，在4℃下12000rpm离心10min，取上清于氯仿/异丙醇（体积比24：1）中再次抽提除去杂蛋白，4℃下12000rpm离心10min，再取上清并加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的pH5.23MNaAc，-70℃沉淀1h，4℃下13500rpm离心20min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。
根据脂环酸芽孢杆菌D-1全基因组测序及基因注释分析羧酸酯酶基因D-1CarE3并设计引物CarF和CarR：
上游引物CarF:5’CGCGGATCCATGAACGTTAACTTGAACCGCGTG3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）
下游引物CarR:5’CCGCTCGAGGCCCCGAAGGCCCGGCCACT3’（划线部分为XhoⅠ酶切位点）
上游引物T7:5’TAATACGACTCACTATAGGG3’
下游引物T7ter:5’TGCTAGTTATTGCTCAGCGG3’为PCR检测阳性克隆子引物。
以脂环酸芽孢杆菌D-1基因组DNA为模板进行PCR扩增获得目的基因D-1CarE3。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；48℃退火30sec；72℃延伸1min30sec；30个循环后72℃保温5min。PCR纯化产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理过的表达载体pET-28a(+)连接构建质粒pET28D3，4℃过夜。取10μl连接产物pET28D3转化到100μlEscherichia coli TransT1感受态细胞中，涂布于含Kan的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取几株单菌落，使用引物(T7，T7ter)进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株TransT1/pET28D3。
根据人工合成的ianK-NC核苷酸序列设计不带终止密码子的引物inaK-NF和inaK-CR：
上游引物inaK-NF:5’GCAGGATCCATGACTCTCGACAAGGCGT3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）
下游引物inaK-CR:5’GCAGGATCCCTTTACCTCTATCCAGTCATCGTCC3’（划线部分为BamHⅠ酶切位点）
以ianK-NC/pGH质粒DNA为模板进行PCR扩增获得目的基因ianK-NC。PCR反应参数为：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸30sec；30 个循环后72℃保温5min。PCR纯化产物经BamHⅠ酶切，回收目的片段，再与经过同样酶切处理并去磷酸化的质粒pET28D3连接构建质粒pET28NCD3，4℃过夜。取10μl连接产物pET28NCD3转化到100μlEscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含Kan的LB固体平板上，37℃温箱培养13h，从转化板上挑取几株单菌落，使用引物(T7，inaK-CR)进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得工程菌BL21(DE3)/pET28NCD3。
实施例2：工程菌BL21(DE3)/NCD3全细胞催化剂的制备
取工程菌BL21(DE3)/NCD3和只含有pET-28a(+)的空质粒Escherichia coliBL21(DE3)菌株，以0.1%的体积比接种量接种于含50μg/mL卡那抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h，然后将此活化的菌液再以1%体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养3-4h，待菌体密度OD600=0.5左右，加入终浓度0.05mMIPTG20℃诱导培养20h，12000rpm离心5min，收集菌体，置于超低温冷冻真空干燥机上冻成干粉即为全细胞催化剂D-1CarE3。
细胞组分的分离，取适量上述离心收集菌体，PBS悬浮离心洗涤3次，再用适量的PBS悬浮于冰水混合物下超声波破碎菌体，115000g离心1h，上清即为细胞质组分，沉淀用含有0.01mMMgCl2和2%TritonX-100PBS重悬沉淀，室温放置30min溶解细胞内膜成分，115000g离心1h，上清即为细胞内膜组分，而沉淀即为细胞外膜成分，将相同蛋白含量的细胞组分进行Westen blot（图2）验证，结果显示细胞质和细胞内膜中均无融合蛋白，只有细胞外膜出现融合蛋白，大小约82kDa，与预期大小相当，表明重组羧酸酯酶D-1CarE3被成功锚定到了大肠杆菌BL21(DE3)的细胞表面。
全细胞催化剂D-1CarE3活性的测定采用pNPG法：取420μl1/15mol/LpH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液（含0.4%TritonX-100，0.1%阿拉伯胶），加入底物30μl10mM pNPG乙腈溶液，37℃预热5min，再加入50μl适当稀释全细胞催化剂D-1CarE3反应5min，立即加入50μl0.1MNa2CO3终止反应。以不加全细胞催化剂D-1CarE3为对照，在酶标仪405nm下测定吸光度值。1个酶活单位（U/mL）定义为一定条件下，每分钟分解底物pNPG生成1μmoLp-硝基苯酚所需要的酶量。
实施例3：工程菌BL21(DE3)/NCD3全细胞催化剂的应用
称取1mg实施例2所述全细胞催化剂D-1CarE3加入100μl 100mg/ml的氟氯氰菊酯丙酮溶液中室温震荡反应60min,加入等体积的正己烷抽提，离心取上层液适量于硅胶G板上进行簿层层析分析，以正己烷：丙酮体积比4:1为展开剂展开，自然风干硅胶G板于溴蒸汽熏5s，喷洒0.1%联甲苯胺丙酮溶液，风干后阳光下紫外照射2min显色（图3），结果显 示全细胞催化剂D-1CarE3能够催化拟除虫菊酯农药氟氯氰菊酯形成两种产物1和产物2，可以用在拟除虫菊酯农药污染上的处理。
将实施例2所述全细胞催化剂D-1CarE3放入甲醇溶液中耐受1h回收细胞测定其催化活性无损失，将全细胞催化剂D-1CarE3常温放置42d，测定全细胞催化剂D-1CarE3催化活性损失不到3%（图4），全细胞催化剂D-1CarE3克服了原始酶的不稳定性，不易回收利用的问题。本发明所制备的全细胞催化剂D-1CarE3具有降解马拉硫磷、西维因和氟氯氰菊酯的作用，可以将其直接喷洒到这些农残污染区，使用简单，具有广泛的应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示系统，其特征在于，该细胞表面展示系统中利用了人工合成截短的冰核蛋白inaK的NC端作为锚定蛋白并与靶蛋白羧酸酯酶D-1CarE3融合构建了重组质粒pET28NCD3。
2.一种羧酸酯酶D-1CarE3细胞表面展示工程菌，其特征在于，利用权利要求1所述中的重组质粒pET28NCD3转化到表达宿主BL21构建了细胞表面展示工程菌BL21/pET28NCD3。
3.一种包含权利要求2所述工程菌BL21/pET28NCD3全细胞催化剂D-1CarE3的制备方法，其特征在于，取权利要求2所述工程菌株以0.1%的体积比接种量接种于含50μg/mL卡那抗性的LB培养液中，37℃快速振荡12h，然后将此活化的菌液再以1%体积比接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，37℃振荡培养4h，待菌体密度OD600=0.5，加入终浓度0.05mMIPTG20℃诱导培养20h，12000rpm离心5min，收集菌体，置于超低温冷冻真空干燥机上冻成细胞干粉即为全细胞催化剂D-1CarE3。
4.全细胞催化剂D-1CarE3在环境农残污染处理中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140625 |