CN113528412A

CN113528412A - 一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用

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Publication number: CN113528412A
Application number: CN202110755090.5A
Authority: CN
Inventors: 杨建明; 梁波; 杨京; 汤若昊; 王兆宝; 李美洁
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-07-05
Also published as: CN113528412B

Abstract

本发明提供了一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。所述爆炸物可视化生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因和爆炸物可视化的目标基因DntA和DntB基因。本发明利用锚定蛋白将目标基因表达产物锚定到宿主菌表面，最终获得爆炸物可视化生物传感器。该生物传感器可以将爆炸物分子2,4‑二硝基甲苯（2,4‑DNT）降解成一种肉眼可见的红色物质2‑羟基‑5‑甲基苯醌，进而判断待测样品中是否存在爆炸物分子，并且其在420nm处具有最大吸光值，可根据测定的吸光值、结合标准曲线计算2,4‑DNT浓度。本发明的生物传感器的检测范围宽、灵敏度高、方法简便、成本低、安全性强，具有广泛的应用前景。

Description

一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

微生物细胞表面展示技术是利用锚定蛋白的作用将目标肽或蛋白质展示在噬菌体、细菌和酵母细胞的表面。与从细胞质中纯化肽或蛋白质酶，微生物细胞表面展示有三个优势。首先，目标蛋白可以在锚蛋白的作用下锚定在宿主细胞的外膜上，因此展示的蛋白能够直接接触细胞外界环境种的底物，从而加快蛋白与底物的反应。其次，通过使用细胞膜作为基质，蛋白质的稳定性提高。第三，只需收获细胞即可获得蛋白质，无需冗长繁琐的纯化过程。到目前为止，该方法已广泛应用于疫苗筛选、环境修复、全细胞催化、生物传感器等领域。在生物传感器方面，已经开发了各种检测模式和系统，具有优异的灵敏度、特异性和稳定性，包括基于细菌或酵母表面展示系统的电化学和光谱学检测中。

生物感应技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件是负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等等；而报告元件可在感应元件的作用下而产生感应信号，一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）和荧光素酶，分别产生绿色荧光、黄色荧光、红色荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这些较为常见的报告元件的特点是技术成熟、容易操作，但是荧光和自发光的检测需要借助于分析仪器，例如酶标仪、紫外分析仪、荧光检测仪、自发光检测仪等，还需要对荧光信号和自发光信号进行定量和定性分析。荧光和自发光均不能实现肉眼观察，尤其是在明场情况下。

战区残留爆炸物（例如地雷）对于生命安全、生态系统都造成了不可修复的损伤，因此针对地雷进行安全有效的检测具有重要的战略意义。通过生物感应检测技术对残留地雷进行检测是一种有效的手段。爆炸物（例如地雷）的有效成份为2,4,6-三硝基甲苯（TNT），TNT可自然分解为多种化合物，如1,3-二硝基苯（1,3-DNB）和2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT），其中2,4-DNT的稳定性最高，可在自然环境中长期存在。以色列科学家Shimshon Belkin报道了对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的生物感应系统，检测限达到0.01 mg/L（New Biotechnology, 2020, 59, 65-73），处于国际上领先水平。此生物感应系统以GFP作为报告元件，在野外进行爆炸物探测时，需使用仪器进行特定波长的紫外激发，以及绿色荧光信号的收集。另外，野外情况较为复杂，多种非GFP物质都能在紫外激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。此外，产生的绿色荧光需要在一定的距离范围内进行收集，否则荧光发生散射，距离越远，信号越弱，而对于爆炸物分子，远距离检测是基本的要求，较近距离的检测会增加检测人员的危险性。

但到目前为止，国内外无利用表面展示来进行爆炸物分子可视化检测的相关报道。

发明内容

为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器，所述爆炸物可视化生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因和爆炸物可视化的目标基因。

进一步的，所述爆炸物可视化的目标基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；

（3）与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或者SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的，且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

优选的，所述爆炸物可视化的目标基因为DntB基因或DntA基因。

进一步的，所述DntA基因包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7所示的DntAa、DntAb、DntAc、DntAd基因。

进一步的，所述锚定蛋白包括冰核蛋白、外膜蛋白、脂蛋白、自转运蛋白、S-layer、芽孢蛋白。

进一步的，所述锚定蛋白的编码基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

（3）与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或者SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的，且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

优选的，所述锚定蛋白的编码基因为Spycather基因或Lot基因。

本发明还提供了所述的爆炸物可视化生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）克隆爆炸物可视化的目标基因DntA或DntB基因；

（2）克隆锚定蛋白的编码基因Lot或Spycather基因，通过遗传操作插入大肠杆菌的表达载体中，获得含有锚定蛋白基因的表达载体；

（3）将克隆的DntA或DntB基因通过遗传操作分别插入步骤（2）中含有锚定蛋白基因的表达载体中，获得DntA或DntB大肠杆菌细胞表面展示表达重组载体；

（4）将所述DntA或DntB大肠杆菌细胞表面展示表达重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，获得含有DntA或DntB展示系统的大肠杆菌工程菌株；

（5）将所述含有DntA或DntB展示系统的大肠杆菌工程菌株活化培养后，洗涤收集菌体，获得具有DntA或DntB酶活性的全细胞催化剂，获得爆炸物可视化生物传感器。

本发明还提供了所述的爆炸物可视化生物传感器在用于爆炸物分子的实时检测中的应用。

进一步的，所述爆炸物可视化生物传感器的使用方法是：将所述爆炸物可视化生物传感器加入待测样品中，37 ℃反应1 h后，肉眼观察培养液颜色，若此时显示红色则确定样品中含有爆炸物分子，且红色越深则爆炸物分子的浓度越高；然后离心终止反应，利用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测吸光值，根据标准曲线定量计算得出爆炸物分子的浓度，吸光值越大则爆炸物分子的浓度越高。

进一步的，在使用时，既能够单独使用一种含目标基因的爆炸物可视化生物传感器，也能够将两种含有不同目标基因的爆炸物可视化生物传感器混合使用。

进一步的，混合使用时，将含有DntA和DntB基因的所述爆炸物可视化生物传感器以1:10-10:1的体积比混合。

优选的，将含有DntA基因的爆炸物可视化生物传感器和含有DntB基因的爆炸物可视化生物传感器以5:1的体积比混合。

进一步的，所述爆炸物可视化生物传感器能够检测到的爆炸物分子浓度的线性范围为0.001 mg/L-1mg/L，最低检测限是0.001 mg/L。

进一步的，所述爆炸物分子为2,4-DNT。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益技术效果：

（1）大肠杆菌的遗传操作系统是最为简单成熟的原核细菌遗传操作系统，将来源于洋葱伯克霍尔德氏菌中的与2,4-DNT降解途径有关基因转入大肠杆菌中进行表达，大大方便了后期大规模检测的需求；

（2）运用细胞表面展示技术，2,4-DNT无需进入到细胞内即可与细胞表面的酶蛋白发生反应，大大缩短了反应时间，与胞内反应相比，检测的灵敏度更高；

（3）当样品中含有2,4-DNT时，经过生物传感器的检测会呈现红色，肉眼可见，无需仪器进行信号检测。因此，本发明的爆炸物可视化生物传感器检测更加便捷、成本低，在环境保护、反恐防恐和维护国家安全等领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明中表达载体pACYCDute-Lot的质粒图谱。

图2是本发明中表达载体pACYCDute-Lot-DntB的质粒图谱。

图3是本发明中表达载体pACYCDute-Spycather的质粒图谱。

图4是本发明中表达载体pACYCDuet-Spycather-DntA-Spytag的质粒图谱。

图5是本发明中表达载体pACYCDute-DntA的质粒图谱。

图6是本发明中表达载体pACYCDute-DntB的质粒图谱。

图7是本发明载体构建过程中基因片段扩增的电泳图片。

图8是胞内表达菌株与展示工程菌株的酶活比较结果图。

图9是本发明的展示工程菌株的细胞表面定位荧光图。

图10是本发明中的两种展示工程菌株按不同比例混合的酶活比较结果图。

图11是本发明的生物感应器对不同浓度的2,4-DNT的检测结果图。

图12是本发明中生物感应器对不同浓度的2,4-DNT的检测时产生的红色物质2-羟基-5-甲基苯醌的结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。

实施例1：基因的获得和载体的构建

1、基因的获得

锚定蛋白基因Lot，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由苏州金唯智公司化学合成至pUC-GW-Kan载体上，获得pUC-Lot载体。

锚定蛋白基因Spycather，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由苏州金唯智公司化学合成至pUC-GW-Kan载体上，获得pUC-Spycather载体。

目标基因DntA，其由DntAa、DntAb、DntAc、DntAd构成，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，而DntAa、DntAb、DntAc、DntAd的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQID NO.6、SEQ ID NO.7所示，由洋葱伯克霍尔德氏菌基因组中扩增获得。

目标基因DntB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，由洋葱伯克霍尔德氏菌基因组中扩增获得。

2、pACYCDuet-Lot-DntB表达载体的构建

（1）以pUC-Lot为模板，利用引物Lot-F和引物Lot-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增lyc片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
Lot-F	0.5 μM
		Lot-R	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95ºC 3 min ；30 循环 ×（95ºC 15 s，58ºC 15 s，72ºC 30s）；72ºC10 min；16ºC ∞。

引物序列如下所示：

Lot-F:

5’- CATGCCATGGGCATGAAAGCCACCAAACTGGTGCT -3’（SEQ ID NO.9）；

Lot-R：

5’- ACGCGTCGACATCTCTAAAGCCTTCTTCACTG -3’（SEQ ID NO.10）。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。

利用限制性内切酶NcoІ（Thermo，货号FD0573）和限制性内切酶Sal I（Thermo，货号FD0644）同时双酶切pACYCDute质粒和PCR产物，其酶切体系为：

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Nco І	1 μL
Sal I	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

组分	用量
		质粒酶切片段	100 ng
PCR产物酶切片段	50 ng
		10 × T4 DNA Ligase Buffer	2 μL
T4 DNA Ligase	0.5 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 20 μL

连接体系置于22 ºC孵育2 h。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDute-Lot（图1），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

（2）以洋葱伯克霍尔德氏菌基因组为模板，利用引物DntB-F和引物DntB-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增DntB片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
DntB-F	0.5 μM
		DntB-R	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95ºC 3 min ；30 循环 ×（95ºC 15 s，62ºC 15 s，72ºC 1min 45s）；72ºC 10 min；16ºC ∞。

引物序列如下所示：

DntB-F:

5’- CCCAAGCTTGTGCATCACGTTTCTACTAAGTCGCC-3’（SEQ ID NO.11）；

DntB-R：

5’- GGGGTACCGGCAGCTACGACCGATGCATCTA -3’（SEQ ID NO.12）。

利用限制性内切酶Hind III（Thermo，货号FD0504）和限制性内切酶 Kpn I（Thermo，货号FD0524）同时双酶切pACYCDute-Lot质粒和PCR产物，其酶切体系为：

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Hind III	1 μL
Kpn I	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

连接体系置于22 ºC孵育2 h。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDute-Lot-DntB (图2)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

3、pACYCDuet-Spycather表达载体的构建

以pUC-Spycather为模板，引物Spycather-F和引物Spycather-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增EstA片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
Spycather-F	0.5 μM
		Spycather-R	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95ºC 3 min；30 循环×（95ºC 15 s，62ºC 15 s，72ºC 2min）；72ºC 10min；16ºC ∞。

引物序列如下所示：

Spycather-F:

5’- CATGCCATGGGCATGAAAGCGACCAAGCTGGTGCT -3’（SEQ ID NO.13）；

Spycather-R：

5’- ATAAGAATGCGGCCGCTTAAATGTGCGCATCGCCTTTG -3’（SEQ ID NO.14）。

利用限制性内切酶Nco I（Thermo，货号FD0573）和限制性内切酶Not I（Thermo，货号FD0593）同时双酶切pACYCDute质粒和PCR产物，其酶切体系为：

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Nco I	1 μL
Not I	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

连接体系置于22 ºC孵育2h。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34 mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDute-Spycather（图3），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

5、pACYCDuet-Spycather-DntA-Spytag表达载体的构建

以洋葱伯克霍尔德氏菌基因组为模板，引物DntAa-F和引物DntAa-R、引物DntAb-F和引物DntAb-R、引物DntAc-F和引物DntAc-R、引物DntAd-F和引物DntAd-R进行聚合酶链式反应（PCR），分别扩增DntAa、DntAb、DntAc、DntAd片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
DntAa/DntAb/DntAc/DntAd-F	0.5 μM
		DntAa/DntAb/DntAc/DntAd-R	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95ºC 3 min；30循环 ×（95ºC 15 s，60ºC 15 s，72ºC 1min 30s）；72ºC 10 min；16ºC ∞。

引物序列如下所示：

DntAa-F: 5’- ATGGAACTGGTAGTAGAAC -3’（SEQ ID NO.15）；

DntAa-R：5’- CCAGTTCTCGCTCATCTCCTTGACGCCGCTGGGATAG-3’（SEQ ID NO.16）；

DntAb-F:

5’- CTATCCCAGCGGCGTCAAGGAG ATGAGCGAGAACTGGATCGACG-3’（SEQ ID NO.17）；

DntAb-R:

5’- GTTTTGGTAACTCATCTCCTTGTCCAGCTTGAGCATCACGCG-3’ （SEQ ID NO.18）；

DntAc-F:

5’- ATGCTCAAGCTGGACAAGGAGATGAGTTACCAAAACTTAGTGA-3’ （SEQ ID NO.19）；

DntAc-R:

5’- CTGGGTATTGATCATCATCTCCTTGCGATCAGTCGTCTTGGTGAGTT-3’ （SEQ IDNO.20）；

DntAd-F:

5’- AAGACGACTGATCGCAAGGAGATGATGATCAATACCCAGGAAG-3’ （SEQ ID NO.21）；

DntAd-R: 5’- CAGGAAGATTATCAGGTTGTGG-3’ （SEQ ID NO.22）。

回收后的DntAa、DntAb、DntAc、DntAd进行overlap反应：

组分	用量
		DntAa/DntAb/DntAc/DntAd片段	100 ng
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 46 μL

先PCR反应10个循环，10个循环结束以后，往反应液中各加入2μL DntAa-F和DntAd-R，继续反应32个循环；

PCR程序为：95ºC 3 min；（95ºC 15 s，62ºC 15 s，72ºC 3min）；72ºC 10 min；16ºC∞。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化，获得目的片段DntA。

设计引物，将DntA作为模板，设计引物将Spytag扩增到DntA上。

Spytag-F: 5’-GGAATTCCATATGATGGAACTGGTAGTAGAACCCCT-3’（SEQ ID NO.23）;

Spytag-R: 5’-CCGGTCGAGTTTGGTCGGTTTATATGCATCAACCATAACAATATGTGCGCTACCACCACCACCCAGGAAGATTATCAGGTTGT-3’（SEQ ID NO.24）。

PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
Spytag-F	0.5 μM
		Spytag-R	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95ºC 3 min；30 循环×（95ºC 15 s，60ºC 15 s，72ºC 3min 30s）；72ºC 10 min；16ºC ∞。

利用限制性内切酶Nde I（Thermo，货号FD0583）和限制性内切酶Xho I（Thermo，货号FD0694）同时双酶切pACYCDute-Spycather质粒和PCR产物，其酶切体系为：

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Nde I	1 μL
Xho I	1 μL
		ddH2O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

组分	用量
		质粒酶切片段	100 ng
PCR产物酶切片段	50 ng
		10 × T4 DNA Ligase Buffer	2 μL
T4 DNA Ligase	0.5 μL
		ddH2O	Up to 20 μL

连接体系置于22 ºC孵育2h。连接产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到含34 mg/L氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDute- Spycather-DntA-Spytag（图4），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

按照与上述相同方式，构建只含有目的基因的重组质粒pACYCDute-DntA（图5）和pACYCDute-DntB（图6）。

上述构建载体过程中的基因片段扩增的电泳图片如图7所示。

实施例2：

1、重组菌株的构建

将pACYCDuet-Lot-DntB质粒、pACYCDuet-Spycather-DntA-Spytag质粒、pACYCDute-DntA质粒、pACYCDute-DntB质粒分别转化E.coliBL21(DE3) 感受态细胞，涂布到含34 mg/mL氯霉素的LB固体平板上，获得阳性克隆，由此获得含有载体pACYCDuet-Lot- DntB质粒和pACYCDuet-Spycather-DntA-Spytag质粒、pACYCDute-DntA质粒、pACYCDute-DntB质粒的工程菌株。

2、工程大肠杆菌的培养

将活化后的上述四种工程大肠杆菌按1:100的比例分别接种到含有氯霉素的LB液体培养液中，37 ℃，180 rpm条件下振荡培养，当OD₆₀₀为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），然后转入16℃，180 rpm条件下，继续培养。当工程菌株过夜诱导后，收获细胞，并用50 mM Tris-HCl（pH 7.8）洗涤，并进行后续酶活实验检测。

3、酶活性检测

将上述制备得到的含有pACYCDuet-Lot-DntB质粒和pACYCDuet-Spycather-DntA- Spytag质粒的工程菌株（分别为DntA和DntB展示工程菌株）以及含有pACYCDute-DntA质粒、pACYCDute-DntB质粒的工程菌株（胞内表达菌株）分别活化诱导培养，得到的全细胞催化剂进行酶活反应检测。还原型辅酶Ⅰ（NADH）是DntA催化反应中的辅酶，以2,4-DNT为底物，检测NADH在340nm处的最大吸收值，计算某时间内340 nm处最大吸收值的变化去计算NADH量的减少，从而知道DntA的催化活性；每分钟消耗1 µmol NADH定义为一个活力单位。DntB检测原理同DntA相同，以4-甲基邻苯二酚为底物，检测还原型辅酶Ⅱ（NADPH）量的减少去计算DntB的催化活性，每分钟消耗1 µmol NADPH定义为一个活力单位。

4、胞内外酶活的比较

将上述制备得到的含有pACYCDuet-Lot-DntB质粒和pACYCDuet-Spycather-DntA- Spytag质粒的工程菌株（分别为DntA和DntB展示工程菌株）以及含有pACYCDute-DntA质粒、pACYCDute-DntB质粒的工程菌株（胞内表达菌株）分别活化诱导培养，获得的全细胞催化剂（OD₆₀₀=1）分别再添加到含有2,4-DNT至终浓度为1 mg/L，在37 ℃反应1 h后，离心使其反应停止。使用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测反应物的吸光值，并测DntA、DntB的酶活性。

结果图8所示，展示工程菌株的酶活显著高于胞内表达菌株，连接了锚定蛋白的菌株中DntA、DntB的酶活均比相应胞内表达菌株的酶活提高了10倍左右。

4、DntA、DntB酶的细胞表面定位分析

对于荧光成像，诱导后的展示工程菌株用PBS洗涤，并用含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液在室温下封闭0.5小时，然后加入抗6x His Tag小鼠单克隆抗体 (1:200)并在室温下孵育2小时。用PBS洗涤3 次后，将细胞与FITC偶联驴抗小鼠IgG (1:200)(Sangon Biotech Co., Ltd, China.) 室温孵育1 h。在荧光显微镜（Axio Scope A1，CarlZeiss，Germany）下观察PBS洗涤的细胞。

结果如图9所示，DntA和DntB酶蛋白被成功展示到细胞表面，说明通过锚定蛋白的作用，将DntA和DntB带到细胞膜外面，并固定在细胞膜上。

5、添加不同比例全细胞催化剂的酶级联反应测定

将DntA和DntB展示工程菌株接种于含有氯霉素的LB液体培养基中，37 ℃，180rpm条件下振荡培养后，使用50 mM的Tris-HCl（pH 7.8）洗涤后，得到的不同全细胞催化剂，按不同比例混合后，添加到含有1 mg/L的2,4-DNT且OD₆₀₀为1的相同缓冲液中，两种全细胞催化剂具体的混合体积比参见图10，在37 ℃反应1h后，使用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测其吸光值，测DntA、DntB的酶活。

结果如图10显示，当由DntA、DntB展示工程菌株培养洗涤后得到全细胞催化剂的体积比为5:1时，420 nm处的吸光值最高，说明此时两个酶级联反应的酶活最好。

6、不同浓度的2,4-DNT的检测

将上述表达的菌株于37 ℃和200 rpm接种于100 mL含相应抗生素的LB液体培养基中。当细菌的OD₆₀₀达到0.6时，添加IPTG诱导在16℃下过夜诱导后，收获细胞后用50 mMTris-HCl（pH 7.8）洗涤，将洗涤后的全细胞催化剂按体积比为5:1的比例作为一种生物传感器添加到含有0.001 mg/L-1 mg/L的2,4-DNT中，OD为1，37 ℃反应后，离心停止反应，使用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测其吸光值。

结果如图11和12显示，随着2,4-DNT浓度的增加，吸光值随着爆炸物分子浓度的增大呈线性增加，且肉眼可见，生物传感器培养液的颜色越来越红，这是因为该生物传感器能够将爆炸物分子2,4-DNT降解成一种肉眼可见的红色物质2-羟基-5-甲基苯醌，进而可以简单的通过肉眼，即可判断待测样品中是否存在爆炸物分子，并且其在420nm处具有最大吸光值，说明本发明构建的感应2,4-DNT的生物传感器的检测范围为0.001 mg/L-1mg/L，最低检测限为0.001 mg/L，比已报道的最低检测限度低10倍。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 锚定蛋白基因(Lot)

<400> 1

atgaaagcca ccaaactggt gctgggtgca gtgattctgg gcagcaccct gctggctggc 60

tgcagcagca atgccaaaat tgatcaaggc atttttaccc ctgataacat taatgcagat 120

attagcctgg gcaccctgag tggcaaaacc aaagaaagag tgtatctggc agaagaaggt 180

ggcagaaaag tgagtcagct ggattggaaa tttaacaatg cagccattat taaaggtgcc 240

attaactggg atctgatgcc acagattagc attggtgcag ctggctggac caccctgggc 300

agcagaggtg gcaacatggt ggatcaagat tggatggata gcagcaaccc tggcacctgg 360

actgatgaaa gcagacatcc tgatactcag ctgaactatg ccaatgaatt tgatctgaac 420

attaaaggct ggctgctgaa tgaaccaaac tatagactgg gcctgatggc tggctatcaa 480

gaaagcagat atagctttac tgcaagaggt ggcagctata tttatagcag tgaagaaggc 540

tttagagatt aa 552

<210> 2

<211> 798

<212> DNA

<213> 锚定蛋白基因(Spycather)

<400> 2

atgaaagcga ccaagctggt gctgggcgcg gtgattctgg gcagcaccct gctggcgggc 60

tgcagcagca acgcgaaaat tgatcaaggc attaacccgt atgtgggctt tgaaatgggc 120

tatgattggc tgggccgcat gccgtataaa ggcagcgtgg aaaacggcgc gtataaagcg 180

caaggcgtgc agctgaccgc gaaactgggc tatccgatta ccgatgatct ggatatttat 240

acccgcctgg gcggcatggt gtggcgcgcg gataccaaaa gcaacgtgta tggcaaaaac 300

catgataccg gcgtgagccc ggtgtttgcg ggcggcgtgg aatatgcgat taccccggaa 360

attgcgaccc gcctggaata tcagtggacc aacaacattg gcgatgcgca taccattggc 420

acccgcccgg ataacggcgt gggcggtggc ggcagcgtgg ataccctgag cggcctgagc 480

agcgaacaag gtcagagtgg cgatatgacc attgaagaag atagcgcgac ccatattaaa 540

tttagcaaac gcgatgaaga tggcaaagaa ctggcgggcg cgacgatgga actgcgcgat 600

agcagcggca aaaccattag cacctggatt agcgatggcc aagtgaaaga tttttatctg 660

tatccgggca aatatacctt tgtggaaacc gcggcgccgg atggctatga agtggcgacc 720

gcgattacct ttaccgtgaa cgaacaaggc caagtgacgg tgaacggcaa agcgaccaaa 780

ggcgatgcgc acatttaa 798

<210> 3

<211> 3231

<212> DNA

<213> 目标基因(DntA)

<400> 3

atggaactgg tagtagaacc cctcaatttg catctgaacg cggagaccgg cagcaccctg 60

cttgacgtgc tcaggtccaa cgaggtcccc atttcttata gctgcatgtc gggccgctgc 120

ggcacttgcc gttgccgtgt gattgccggc catcttcgcg ataacggccc cgagacaggg 180

cgcccgcagg caggaaaggg ggcctatgtc ctggcctgtc aggcggttct gaccgaagac 240

tgcacgatcg agattcctga atctgacgag atcgtggttc acccggcgcg catcgtcaag 300

gggacggtca cagcgataga cgaagccacc catgacatcc ggcgcctgcg catcaaactg 360

gccaaaccgc ttgagttcag ccctggccag tacgcaacgg tgcagttcac gcccgaatgc 420

gtccgcccct attcgatggc cgggctgcct agcgatgcgg aaatggagtt tcagattcgc 480

gcggttccgg gcgggcatgt cagcaactac gttttcaatg aactgtccgt aggcgcttcg 540

gtgcggatca gcggccccct cggaacggcc tatctgcggc gcacgcacac cggccccatg 600

ctttgtgtgg ggggtggaac aggtctggcg cccgtccttt cgatcgttcg aggcgcactg 660

gaaagcggga tgagcaaccc catccatctg tacttcggtg tgcggagcga gcaggacatc 720

tatgacgagg aacgccttca cgcattggct gcaaggtttc cgaatctcaa ggtgaatgtc 780

gttgttgcaa caggccctgc cggccctggt catcgatccg gcctggtcac cgatctgatc 840

ggccgtgact tgcccaattt ggcgggatgg cgcgcctacc tgtgtggcgc tccggccatg 900

gtcgaggccc tgaacctgct cgttgctcgc ctaggcatag tacccgggca catccatgcc 960

gatgcgttct atcccagcgg cgtctgaatg agcgagaact ggatcgacgc cgccgcccgc 1020

gacgaggtgc ccgagggcga cgtgatcggc atcaatatcg tcggcaagga gattgccctc 1080

tacgaggtgg cgggcgagat ctacgccacc gacaacacct gcactcacgg cgccgcccgc 1140

atgagcgatg gctttctcga aggccgggaa attgaatgtc ctttgcatca aggccgattc 1200

gatgtttgca cgggtaaagc cttgtgcaca cccctgacac aggacatcaa aacctacccc 1260

gtaaaaatcg aaaacatgcg cgtgatgctc aagctggact aaatgagtta ccaaaactta 1320

gtgagtgaag cagggctgac gcaaaagcac ctgatttatg gcgacaaaga acttttccag 1380

cacgaattga agaccatctt cgcgcggaac tggctttttc tgacccatga cagtctgatt 1440

ccctcccccg gcgactatgt caaagccaaa atgggcgtcg atgaagtcat cgtctcccgc 1500

cagaacgatg gctcggtgcg agcctttttg aatgtttgcc gtcaccgggg caagacaata 1560

gttgacgctg aagccggaaa tgcgaaaggc tttgtgtgcg gttaccacgg ctggggctat 1620

ggctccaacg gcgaactgca aagcgttccc tttgaaaaag agttgtacgg agatgcgatc 1680

aaaaagaaat gcctgggctt gaaagaagtc ccccgcatcg aaagctttca tggctttatc 1740

tatggctgtt ttgatgcaga agctcccccg ctcatcgatt atctgggtga tgcagcctgg 1800

tacctggaac ccaccttcaa gcactctggt ggcctggaac ttgtaggccc ccccggcaaa 1860

gtggtggtta aggccaactg gaagcctctt gcggaaaact ttgtaggtga cgtctaccac 1920

attggttgga cgcacgcatc tattttgcgc gcagggcagt cgatatttgc tcctcttgcg 1980

ggcaacgcta tgtttccacc cgaaggcgcg ggcttgcaaa tgaccaccaa gtatggcagt 2040

ggaattggcg tattgtggga cgcctactcc ggtatccaga gcgctgatat ggttcccgaa 2100

atgatggcat tcggcggcgc aaaacaggaa aagctcgcca aagaaatcgg cgatgtccgg 2160

gcgcggattt accgcagcca actgaacggc acggttttcc cgaacaacag ctttttgacc 2220

tgctccggtg tcttcaaggt ctttaacccg atcgatgaaa acacgaccga ggtttggacg 2280

tatgccatcg tagaaaaaga catgcctgag gacttaaagc gtcgcttggc tgacgcggtt 2340

cagcgcagtg tcggaccagc aggatactgg gaaagcgacg acaacgacaa catggggacg 2400

ttgtcgcaaa atgccaagaa ataccaatcc agcaacagtg atctgattgc cgatttgggt 2460

ttcggcaagg acgtctacgg cgacgaatgc tatccgggcg tcgttggcaa atcggcaatc 2520

agcgaaacca gctatcgcgg attctaccgt gcctaccagg ctcacatcag cagctccaat 2580

tgggccgagt tcgaaaacac ctcccgaaat tggcacaccg aactcaccaa gacgactgat 2640

cgctaaatga tgatcaatac ccaggaagac aagctggtct ccgcgcacga cgccgaagaa 2700

tttcaccgtt tcttcgtcgg gcacgacagc gatctgcagc aagaagtcac cacactcctg 2760

acccgcgaag cgcacctgct ggacattcag gcctacaaag cctggcttga acactgcgtt 2820

gcccccgaga tcaaatacca agtgatctcg cgagaacttc gctccacttc cgagcgtcga 2880

taccaactga atgatgcggt gaatatctac aacgagaact atcaacagct gaaagttcga 2940

gttgaacacc agatggatcc tcagaactgg tacaacagcc cgaagatccg cttcacccgc 3000

ttcgtcacca atgtcacggc ggccaaggac aagagcgcac cggaaatgct gcatgtgcgg 3060

tccaacctca ttctccatcg cgccagacga ggaaaccaag ttgacgtctt ctatgcaacg 3120

cgagaagaca aatggaaacg catcgaaggt ggtggcatca aattggtcga acgctttgtg 3180

gactacccgg agcgcagtcc ccaaacccac aacctgataa tcttcctgtg a 3231

<210> 4

<211> 987

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAa)

<400> 4

atggaactgg tagtagaacc cctcaatttg catctgaacg cggagaccgg cagcaccctg 60

cttgacgtgc tcaggtccaa cgaggtcccc atttcttata gctgcatgtc gggccgctgc 120

ggcacttgcc gttgccgtgt gattgccggc catcttcgcg ataacggccc cgagacaggg 180

cgcccgcagg caggaaaggg ggcctatgtc ctggcctgtc aggcggttct gaccgaagac 240

tgcacgatcg agattcctga atctgacgag atcgtggttc acccggcgcg catcgtcaag 300

gggacggtca cagcgataga cgaagccacc catgacatcc ggcgcctgcg catcaaactg 360

gccaaaccgc ttgagttcag ccctggccag tacgcaacgg tgcagttcac gcccgaatgc 420

gtccgcccct attcgatggc cgggctgcct agcgatgcgg aaatggagtt tcagattcgc 480

gcggttccgg gcgggcatgt cagcaactac gttttcaatg aactgtccgt aggcgcttcg 540

gtgcggatca gcggccccct cggaacggcc tatctgcggc gcacgcacac cggccccatg 600

ctttgtgtgg ggggtggaac aggtctggcg cccgtccttt cgatcgttcg aggcgcactg 660

gaaagcggga tgagcaaccc catccatctg tacttcggtg tgcggagcga gcaggacatc 720

tatgacgagg aacgccttca cgcattggct gcaaggtttc cgaatctcaa ggtgaatgtc 780

gttgttgcaa caggccctgc cggccctggt catcgatccg gcctggtcac cgatctgatc 840

ggccgtgact tgcccaattt ggcgggatgg cgcgcctacc tgtgtggcgc tccggccatg 900

gtcgaggccc tgaacctgct cgttgctcgc ctaggcatag tacccgggca catccatgcc 960

gatgcgttct atcccagcgg cgtctga 987

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAb)

<400> 5

atgagcgaga actggatcga cgccgccgcc cgcgacgagg tgcccgaggg cgacgtgatc 60

ggcatcaata tcgtcggcaa ggagattgcc ctctacgagg tggcgggcga gatctacgcc 120

accgacaaca cctgcactca cggcgccgcc cgcatgagcg atggctttct cgaaggccgg 180

gaaattgaat gtcctttgca tcaaggccga ttcgatgttt gcacgggtaa agccttgtgc 240

acacccctga cacaggacat caaaacctac cccgtaaaaa tcgaaaacat gcgcgtgatg 300

ctcaagctgg actaa 315

<210> 6

<211> 1344

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAc)

<400> 6

atgagttacc aaaacttagt gagtgaagca gggctgacgc aaaagcacct gatttatggc 60

gacaaagaac ttttccagca cgaattgaag accatcttcg cgcggaactg gctttttctg 120

acccatgaca gtctgattcc ctcccccggc gactatgtca aagccaaaat gggcgtcgat 180

gaagtcatcg tctcccgcca gaacgatggc tcggtgcgag cctttttgaa tgtttgccgt 240

caccggggca agacaatagt tgacgctgaa gccggaaatg cgaaaggctt tgtgtgcggt 300

taccacggct ggggctatgg ctccaacggc gaactgcaaa gcgttccctt tgaaaaagag 360

ttgtacggag atgcgatcaa aaagaaatgc ctgggcttga aagaagtccc ccgcatcgaa 420

agctttcatg gctttatcta tggctgtttt gatgcagaag ctcccccgct catcgattat 480

ctgggtgatg cagcctggta cctggaaccc accttcaagc actctggtgg cctggaactt 540

gtaggccccc ccggcaaagt ggtggttaag gccaactgga agcctcttgc ggaaaacttt 600

gtaggtgacg tctaccacat tggttggacg cacgcatcta ttttgcgcgc agggcagtcg 660

atatttgctc ctcttgcggg caacgctatg tttccacccg aaggcgcggg cttgcaaatg 720

accaccaagt atggcagtgg aattggcgta ttgtgggacg cctactccgg tatccagagc 780

gctgatatgg ttcccgaaat gatggcattc ggcggcgcaa aacaggaaaa gctcgccaaa 840

gaaatcggcg atgtccgggc gcggatttac cgcagccaac tgaacggcac ggttttcccg 900

aacaacagct ttttgacctg ctccggtgtc ttcaaggtct ttaacccgat cgatgaaaac 960

acgaccgagg tttggacgta tgccatcgta gaaaaagaca tgcctgagga cttaaagcgt 1020

cgcttggctg acgcggttca gcgcagtgtc ggaccagcag gatactggga aagcgacgac 1080

aacgacaaca tggggacgtt gtcgcaaaat gccaagaaat accaatccag caacagtgat 1140

ctgattgccg atttgggttt cggcaaggac gtctacggcg acgaatgcta tccgggcgtc 1200

gttggcaaat cggcaatcag cgaaaccagc tatcgcggat tctaccgtgc ctaccaggct 1260

cacatcagca gctccaattg ggccgagttc gaaaacacct cccgaaattg gcacaccgaa 1320

ctcaccaaga cgactgatcg ctaa 1344

<210> 7

<211> 585

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAd)

<400> 7

atgatgatca atacccagga agacaagctg gtctccgcgc acgacgccga agaatttcac 60

cgtttcttcg tcgggcacga cagcgatctg cagcaagaag tcaccacact cctgacccgc 120

gaagcgcacc tgctggacat tcaggcctac aaagcctggc ttgaacactg cgttgccccc 180

gagatcaaat accaagtgat ctcgcgagaa cttcgctcca cttccgagcg tcgataccaa 240

ctgaatgatg cggtgaatat ctacaacgag aactatcaac agctgaaagt tcgagttgaa 300

caccagatgg atcctcagaa ctggtacaac agcccgaaga tccgcttcac ccgcttcgtc 360

accaatgtca cggcggccaa ggacaagagc gcaccggaaa tgctgcatgt gcggtccaac 420

ctcattctcc atcgcgccag acgaggaaac caagttgacg tcttctatgc aacgcgagaa 480

gacaaatgga aacgcatcga aggtggtggc atcaaattgg tcgaacgctt tgtggactac 540

ccggagcgca gtccccaaac ccacaacctg ataatcttcc tgtga 585

<210> 8

<211> 1683

<212> DNA

<213> 目标基因(DntB)

<400> 8

gtgcatcacg tttctactaa gtcgccgtct accttgtcgg cggagtgtga agttctcatc 60

gtcgggggta gcttggtcgg cttgtcgctt gcaaactttc tcggccacca cggcgtaagc 120

gctgcagtcg tcgagcggca caagggaacg gccatccacc ctcgtgctgg ccactttcac 180

ctgaggacca ttgaagcatt tcgatatgca ggaatcgagc cagaagtcat gcaggagtct 240

cttcgacagt tcgatccgga cggcggtatc aacgtcgtcg aatcgcttgc cggcaaggag 300

atcgccagcc tgattggcaa cttgaacgaa ggcgtcgaaa aactcagtcc aagtaagcgc 360

ctgttcatga cacaacaaag tctcgaaccc ttgcttagaa agaacgctga aaagctgggg 420

gcccaactta actaccagat ggaattggtt tcattcgagc aggacgccac gggtgtgact 480

gcgcgagtca ggtacatccc atccggggcc gtgagccaag tgcgtgccaa gtacctaatc 540

gccgccgacg gtaaccgcag cccagtccga gagaagctcg gaattgaaat gcgcggctac 600

ggattactct ccaacagtat caccatctac ttcaaggcgg actgcacaaa atggatggct 660

ggacgcaacc tcggcgtggt ctatgtcaac aatcctgacg ttcgcggctt cttccgcttg 720

acgcgggagg ccaagagtgg cttcttgggt gtgaacaccg taggagatgt cagccgcccg 780

gaggcgaaca atgtcgctga aggtatcacg gcagagcgct gcgtcgaaat tgtacgttcc 840

gctgtgggca ttcccgatct ggaagttgaa attgagggca ttgccccgtg gcgcgccgtt 900

gccgatgtgg ctgaccgtta cagaagtgga aatgtgtttc tcatcggcga cgccgcacac 960

gtcgttcctc ctaccggcgg attcggcggg aacactggtg ttcaggacgc gcacaacctt 1020

ggttggaagc tggcttcagt actaaagggt caagcagggc cggctctgct cgacacctac 1080

gaggaggagc ggcgcccggt cggtcaactt acgatcgagc aggcctattc ccgatatgtg 1140

ctgcggatcg cacctgaact gggccgtgaa acgatgaagc ctgtggtcga cgacttgagc 1200

atggaaattg gctaccgcta tttctcatca gccatcttgt cgaacgaaaa gcggggagat 1260

cgtgtttacg ttgatccgcg cacgtcgttc agcttgcctg ggaccagagt gggacacctc 1320

gtctttcagc gagacgggaa atcgatggcg accctggacg tttgtgccgg tggtatgacc 1380

cttcttgccg gagcgggcgg cgtcgcctgg tgtcagtcga cgactgaagc tgccgtaaag 1440

ctgggtatcg aggtcgagtc gaacgtcatt ggaaacgcgg gtggactgac agatgtttca 1500

ggtcgcgcgc tcgaggttct cggaatcgaa agcgcaggtg caattctggt gcgccccgac 1560

ggtttcgtgg cttggcgctc agaacccggt gaggccgcga gtgtcgcgag gatgatcaac 1620

gtgctgaccg ctgtaatgtg tctccagagt cagcgcgtag atgcatcggt cgtagctgcc 1680

taa 1683

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catgccatgg gcatgaaagc caccaaactg gtgct 35

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgcgtcgac atctctaaag ccttcttcac tg 32

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccaagcttg tgcatcacgt ttctactaag tcgcc 35

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggggtaccgg cagctacgac cgatgcatct a 31

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catgccatgg gcatgaaagc gaccaagctg gtgct 35

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ataagaatgc ggccgcttaa atgtgcgcat cgcctttg 38

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggaactgg tagtagaac 19

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccagttctcg ctcatctcct tgacgccgct gggatag 37

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctatcccagc ggcgtcaagg agatgagcga gaactggatc gacg 44

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gttttggtaa ctcatctcct tgtccagctt gagcatcacg cg 42

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atgctcaagc tggacaagga gatgagttac caaaacttag tga 43

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgggtattg atcatcatct ccttgcgatc agtcgtcttg gtgagtt 47

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagacgactg atcgcaagga gatgatgatc aatacccagg aag 43

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caggaagatt atcaggttgt gg 22

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggaattccat atgatggaac tggtagtaga acccct 36

<210> 24

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccggtcgagt ttggtcggtt tatatgcatc aaccataaca atatgtgcgc taccaccacc 60

acccaggaag attatcaggt tgt 83

Claims

1.一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器，其特征在于，所述爆炸物可视化生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因和爆炸物可视化的目标基因。

2.根据权利要求1所述的爆炸物可视化生物传感器，其特征在于，所述爆炸物可视化的目标基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；

3.根据权利要求1所述的爆炸物可视化生物传感器，其特征在于，所述锚定蛋白包括冰核蛋白、外膜蛋白、脂蛋白、自转运蛋白、S-layer、芽孢蛋白。

4.根据权利要求3所述的爆炸物可视化生物传感器，其特征在于，所述锚定蛋白的编码基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

5.权利要求1-4任一项所述的爆炸物可视化生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）克隆爆炸物可视化的目标基因；

（2）克隆锚定蛋白的编码基因，通过遗传操作插入大肠杆菌的表达载体中，获得含有锚定蛋白基因的表达载体；

（3）将克隆的目标基因通过遗传操作插入步骤（2）中含有锚定蛋白基因的表达载体中，获得含有目标基因的大肠杆菌细胞表面展示表达重组载体；

（4）将所述含有目标基因的大肠杆菌细胞表面展示表达重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，获得含有目标基因展示系统的工程菌株；

（5）将所述含有目标基因展示系统的工程菌株活化培养后，洗涤收集菌体，获得具有目标基因编码蛋白酶活性的全细胞催化剂，即为爆炸物可视化生物传感器。

6.权利要求1-4任一项所述的爆炸物可视化生物传感器在用于爆炸物分子的实时检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述爆炸物可视化生物传感器的使用方法是：将所述爆炸物可视化生物传感器加入待测样品中，37 ℃反应1 h后，肉眼观察培养液颜色，若此时显示红色则确定样品中含有爆炸物分子，且红色越深则爆炸物分子的浓度越高；然后离心终止反应，利用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测吸光值，根据标准曲线定量计算得出爆炸物分子的浓度，吸光值越大则爆炸物分子的浓度越高。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在使用时，既能够单独使用一种含目标基因的爆炸物可视化生物传感器，也能够将两种含有不同目标基因的爆炸物可视化生物传感器混合使用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，混合使用时，将含有DntA和DntB基因的所述爆炸物可视化生物传感器以1:10-10:1的体积比混合。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述爆炸物可视化生物传感器能够检测到的爆炸物分子浓度的线性范围为0.001 mg/L-1mg/L，最低检测限是0.001 mg/L。