CN114250243B - 一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法 - Google Patents

一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114250243B
CN114250243B CN202011014249.XA CN202011014249A CN114250243B CN 114250243 B CN114250243 B CN 114250243B CN 202011014249 A CN202011014249 A CN 202011014249A CN 114250243 B CN114250243 B CN 114250243B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
trna
samp1
coding gene
aminoacyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011014249.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN114250243A (zh
Inventor
付宪
张浩霖
沈玥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Priority to CN202011014249.XA priority Critical patent/CN114250243B/zh
Publication of CN114250243A publication Critical patent/CN114250243A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114250243B publication Critical patent/CN114250243B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测极端嗜盐生物中氨酰‑tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)制备具有功能元件表达框的重组表达载体；功能元件表达框包括如下元件：报告蛋白的编码基因、待测氨酰‑tRNA合成酶的编码基因、待测tRNA的编码基因；报告蛋白包括标签蛋白区段、SAMP1G24amb蛋白区段；相对于SAMP1蛋白的第2‑87位的编码基因，SAMP1G24amb蛋白区段的编码基因中进行了一个由甘氨酸密码子至“TAG”的替换；(2)将重组表达载体导入目标菌株；(3)在含有非天然氨基酸的环境中培养重组菌，检测报告蛋白。本发明可用于挖掘和鉴定极端嗜盐环境中的氨酰‑tRNA合成酶/tRNA工具资源，从而推动非天然氨基酸领域相关的应用。

Description

一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系 统及方法
技术领域
本发明涉及一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法。
背景技术
基因密码子拓展技术可通过基因编码的方式合成携带非天然氨基酸的蛋白质，为进一步拓展蛋白质的结构和功能开辟了新的路径，并在生物探针、成像、药物设计开发等多个领域展现出广阔的应用前景。
基于非天然氨基酸的应用，其先决条件是需要在宿主细胞体内引入高度正交的翻译工具(即，外源引入的翻译工具不能和宿主细胞中任何内源的tRNA、氨酰-tRNA合成酶、氨基酸或密码子相互反应)。如图1所示，该编码过程必须满足以下的条件：(1)使用空白的密码子用于非天然氨基酸的重新编码：目前，主流研究思路是利用琥珀终止密码子(UAG)来编码非天然氨基酸；(2)改造后的翻译工具酶(氨酰-tRNA合成酶)能够特异性地识别非天然氨基酸，并将其连接到对应的tRNA上；(3)被激活的tRNA能够特异性地识别空白密码子，并携带非天然氨基酸到核糖体用于翻译过程中多肽链的延长。
上述过程中，氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对是翻译编码过程中的核心工具，因此，开发高效、正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA配对是基因密码子拓展技术的重点研究内容。近年来，海量的基因组与宏基因组数据成为开发新型氨酰-tRNA合成酶/tRNA的重要资源，通过生物信息学的深度分析挖掘，一些新型的翻译工具被挖掘和发现，具有开发成非天然氨基酸编码工具的潜力。然而目前待发掘的新型工具配对很多来自于非模式生物，包括极端环境中(高盐、高温、极端pH)的生物，通常面临工具不表达或者达活性低等问题，从而限制了新型工具配对的开发。综上所述，目前急需针对极端环境中新型氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具活性的检测系统，从而推动新型翻译工具的开发研究。
基于GFP(绿色荧光蛋白)的报告系统的示意图见图2。在蓝光到紫外线的激发作用下，GFP可发出绿色荧光，通过荧光显微镜观察或者使用酶标仪进行测量和定量。荧光蛋白能稳定内源表达，在定量或其他实验中慢慢取代了传统的化学染料。通过在GFP编码基因中的特定位置引入终止密码子，即可构造一个简单的报告蛋白表达的检测体系。当非天然氨基酸存在时，在外源翻译工具(包括可识别终止密码子的tRNA)的作用下，非天然氨基酸被特异性地引入在终止密码子的位置，从而产生全长的GFP，可被激发并发出荧光。当非天然氨基酸翻译工具没有活性或者底物不存在时，GFP的翻译提前终止，即不能产生具有荧光的全长的GFP。上述报告系统可以通过荧光的有无判断非天然氨基酸翻译工具的活性，且荧光的强度与翻译效率成正相关的关系，故被广泛应用于氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对的活性研究。虽然基于GFP的报告蛋白体系被广泛应用于非天然氨基酸工具的开发研究，但是该方法的使用场景具有一定的局限性。在极端生理环境下，GFP的表达和功能极易受到影响，所以不适用于针对极端环境生物中新型氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具活性的检测。此外，有一些微生物自身具有颜色，会与绿色荧光发生干扰，制约GFP报告蛋白体系的适用性。
基于蛋白免疫印迹的检测技术。免疫印迹法(Western blotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。通过把标签(如Flag、6x His标签)添加到目标检测蛋白的N端或者C端，可通过识别指定标签的特异性抗体来快速检测目标蛋白的表达情况。该技术用于评价非天然氨基酸工具配对活性的关键是选择合适的报告蛋白和选择蛋白中合适的位点(终止密码子的位置)来插入非天然氨基酸。当非天然氨基酸存在时，在外源翻译工具的作用下，非天然氨基酸被特异性地引入在终止密码子的位置，产生完整分子量的目标蛋白，从而被后续检测出来。当非天然氨基酸翻译工具没有活性或者底物不存在时，目标蛋白的翻译提前终止：若标签在蛋白的N端，则免疫印迹法检测到的为截短的目标蛋白(分子量为N端到基因内部终止密码子之间的多肽，通常被快速降解)；若标签在蛋白的C端，则免疫印迹法检测不到信号。基于蛋白免疫印迹的检测技术具有分析敏感度高、特异性强等优点。该方法的有效性需要研究人员巧妙地选取报告蛋白，并通过蛋白结构分析选择合适的位置引入非天然氨基酸，故具有一定的技术壁垒，依赖于研发人员的经验，难点相对较大。
基于酶活的检测技术。一些酶催化的化学反应能产生颜色变化，可用于检测酶的表达。例如β-半乳糖苷酶检测常用于遗传学、分子生物学，以及其他生命科学。有活性的酶可以利用X-gal作为底物来进行检测，会在裂解β-半乳糖苷后形成一个深蓝色的产物5-溴-4-淀蓝，容易辨识和量化。与基于GFP和蛋白免疫印迹用于检测非天然氨基酸工具活性的方法原理相似，在目标酶中引入终止密码子，基于具有功能的全长的酶表达与否，可以用于判断目标氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对的活性。基于酶活的检测技术劣势在于：其灵敏性弱于基于蛋白免疫印迹的检测技术且操作流程较为繁琐。
基于荧光标记技术的tRNA激活检测方法的原理示意图见图3。研究人员最近开发了一种基于荧光标记技术的tRNA激活检测方法(Rapid Discovery and Evolution ofOrthogonal aminoacyl-tRNA synthetase-tRNA Pairs)。该方法可以有效地判断在大肠杆菌中外源引入的外源氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对是否具有活性。当外源氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对具有活性时，目标tRNA被激活，被氨酰化的tRNA可以防止被氧化剂NaIO4氧化，从而在后续的延伸翻译中实现扩增，产生可与DNA探针配对的双链DNA。而没有被激活的tRNA在氧化剂的作用下，3’端核糖上的二醇基团被氧化，不能进行后续的延伸反应。利用双链和单链DNA探针在PAGE胶中迁移速度不同的性质，可以利用荧光成像判断外源引入的外源氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对是否具有活性。基于荧光标记技术的tRNA激活检测方法只能特异性地用于鉴定目标氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对的体内活性，不能判断其它翻译工具元件的体内活性。此外，该方法目前只被验证在大肠杆菌中适用于检测目标氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具配对的表达活性，而一些极端环境来源的生物元件(如氨酰-tRNA合成酶)，导入大肠杆菌后，会面临着外源的蛋白质不表达的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法。
本发明提供了一种检测翻译工具是否具有合成非天然氨基酸的蛋白质的活性的方法；所述翻译工具为待测氨酰-tRNA合成酶和待测tRNA；
所述方法包括如下步骤：
(1)制备具有功能元件表达框的重组表达载体；功能元件表达框包括如下元件：报告蛋白的编码基因、待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因、待测tRNA的编码基因；功能元件表达框中，报告蛋白的编码基因和待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因以多顺反子形式被组成型启动子驱动表达；所述报告蛋白自N端至C端包括如下两个区段：标签蛋白区段、SAMP1G24amb蛋白区段；SAMP1G24amb蛋白区段对应于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基，并且相对于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基的编码基因而言，SAMP1G24amb蛋白区段的编码基因中进行了一个密码子替换，该密码子为SAMP1蛋白的第24位氨基酸残基的密码子，由甘氨酸密码子替换为了“TAG”；
(2)将具有功能元件表达框的重组表达载体导入目标菌株，得到重组菌；
(3)在含有非天然氨基酸的环境中培养重组菌，然后检测重组菌中报告蛋白的表达情况。
具体的，步骤(3)中，采用蛋白免疫印迹法检测重组菌的全菌蛋白中报告蛋白的表达情况。具体的，蛋白免疫印迹法检测时采用所述标签蛋白的抗体。
具体的，所述目标菌株为嗜盐底盘菌。示例性的，所述目标菌株具体为沃氏富盐菌。示例性的，所述目标菌株具体为沃氏富盐菌H26。
具体的，具有功能元件表达框的重组表达载体先借助甲基化系统缺失的大肠杆菌进行扩繁，再导入所述目标菌株。即，先将具有功能元件表达框的重组表达载体导入甲基化系统缺失的大肠杆菌，得到重组菌，然后培养重组菌，然后提取质粒，然后将质粒导入所述目标菌株。示例性的，所述甲基化系统缺失的大肠杆菌具体为E.coli GM2163。
具体的，所述重组表达载体的出发载体为可在大肠杆菌和沃氏富盐菌中复制的穿梭质粒。所述重组表达载体的出发载体具体可为质粒pJAM202c。
如果检测到蛋白和泛素的共缀物，所述翻译工具则具有合成非天然氨基酸的蛋白质的活性。
本发明还保护一种检测翻译工具是否具有合成非天然氨基酸的蛋白质的活性的试剂盒；所述翻译工具为待测氨酰-tRNA合成酶和待测tRNA；
所述试剂盒包括特异DNA分子；
所述特异DNA分子包括如下元件：报告蛋白的编码基因、供待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因插入的位点甲、供待测tRNA的编码基因插入的位点乙；所述报告蛋白自N端至C端包括如下两个区段：标签蛋白区段、SAMP1G24amb蛋白区段；SAMP1G24amb蛋白区段对应于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基，并且相对于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基的编码基因而言，SAMP1G24amb蛋白区段的编码基因中进行了一个密码子替换，该密码子为SAMP1蛋白的第24位氨基酸残基的密码子，由甘氨酸密码子替换为了“TAG”；
使用时，将待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因插入位点甲、待测tRNA的编码基因插入位点乙，得到功能元件表达框；功能元件表达框中，报告蛋白的编码基因和待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因以多顺反子形式被组成型启动子驱动表达。
所述试剂盒还包括嗜盐底盘菌。示例性的，所述嗜盐底盘菌具体为沃氏富盐菌。示例性的，所述嗜盐底盘菌具体为沃氏富盐菌H26。
所述试剂盒还包括甲基化系统缺失的大肠杆菌。示例性的，所述甲基化系统缺失的大肠杆菌具体为E.coli GM2163。
所述试剂盒还包括用于构建重组表达载体的出发载体。具体的，所述出发载体为可在大肠杆菌和沃氏富盐菌中复制的穿梭质粒。示例性的，所述出发载体具体可为质粒pJAM202c。
以上任一所述功能元件表达框中，报告蛋白的编码基因和目标氨酰-tRNA合成酶的编码基因被组成型强启动子驱动表达，由T7终止子介导转录终止。
以上任一所述功能元件表达框中，待测tRNA的编码基因被tRNALys启动子驱动表达，由rrnC终止子介导转录终止。
以上任一所述功能元件表达框中，报告蛋白的编码基因上游具有核糖体结合位点。
以上任一所述功能元件表达框中，待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因上游具有核糖体结合位点。
示例性的，所述标签蛋白为Flag标签。
示例性的，所述组成型启动子具体为P2启动子。
具体的，所述功能元件表达框中，在待测tRNA表达框下游额外添加T7终止子。
具体的，所述方法适用于极端嗜盐生物。
具体的，所述方法适用于检测来自极端嗜盐生物的翻译工具是否具有合成非天然氨基酸的蛋白质的活性。
P2启动子具体如序列表的序列1所示。
核糖体结合位点具体如序列表的序列2所示。
T7终止子具体如序列表的序列4所示。
tRNALys启动子具体如序列表的序列5所示。
rrnC终止子具体如序列表的序列6所示。
SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基具体如序列表的序列14所示。
SAMP1G24amb蛋白区段的编码基因具体如序列表的序列7第34-291位核苷酸所示。
报告蛋白的编码基因具体如序列表的序列7所示。
所述功能元件表达框自上游至下游依次包括：序列表的序列13中第26-662位核苷酸所示的DNA分子、待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因、序列表的序列13中第1485-2237位核苷酸所示的DNA分子、待测tRNA的编码基因、序列表的序列13中第2334-2550位核苷酸所示的DNA分子。
所述功能元件表达框自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13中第26-662位核苷酸所示的DNA分子、待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因、序列表的序列13中第1485-2237位核苷酸所示的DNA分子、待测tRNA的编码基因、序列表的序列13中第2334-2550位核苷酸所示的DNA分子。
所述特异DNA分子自上游至下游依次包括：序列表的序列13中第26-662位核苷酸所示的DNA分子、供待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因插入的位点甲、序列表的序列13中第1485-2237位核苷酸所示的DNA分子、供待测tRNA的编码基因插入的位点乙、序列表的序列13中第2334-2550位核苷酸所示的DNA分子。
所述特异DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列13中第26-662位核苷酸所示的DNA分子、供待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因插入的位点甲、序列表的序列13中第1485-2237位核苷酸所示的DNA分子、供待测tRNA的编码基因插入的位点乙、序列表的序列13中第2334-2550位核苷酸所示的DNA分子。
所述非天然氨基酸的蛋白质指的是含有一个非天然氨基酸的蛋白质或含有多个非天然氨基酸的蛋白质。
所述非天然氨基酸的蛋白质指的是含有一种非天然氨基酸的蛋白质或含有多种非天然氨基酸的蛋白质。
针对极端环境(高盐、高温、极端pH)来源的生物元件在模式生物中易聚集沉降和活性低等突出问题，本发明构建了一套检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具活性的系统，可以针对性地用于分析极端嗜盐环境中氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具的体内活性，具有简单、可靠、灵敏等突出优势。
本发明方法涉及：底盘细胞的选择、报告蛋白的选择、表达元件的选择和优化、以及报告蛋白中终止密码子替换位置的选择。本发明选择了沃氏富盐菌(Haloferaxvolcanii)作为底盘细胞，其具有全基因组序列已知，具备可遗传操作、培养简单等优势。本发明选择了类泛素蛋白SAMP1作为报告蛋白，该蛋白具有分子量小、结构稳定、折叠简单等表达优势；可通过泛素链接反应形成蛋白共缀物，用于蛋白免疫印迹反应中信号的放大，并且摆脱了菌体颜色(H.volcanii菌体自身带有红色)对于GFP发光的干扰。本发明在SAMP1报告蛋白中选择了一个G24位点，作为琥珀终止密码子UAG的替换位点，在目标氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具的作用下可将非天然氨基酸特异性的引入，保证不影响SAMP1蛋白的结构和功能。本发明设计和优化了报告蛋白和目标氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具的表达框，包括元件位置的选择、启动子和终止子的选择、以及引入用于提高报告蛋白SAMP1翻译的核糖体结合位点，从而保证目标工具和报告蛋白在同一个载体上的高效表达。
本发明能够解决当利用传统的GFP和酶活检测体系时，极端嗜盐环境来源的氨酰-tRNA合成酶易聚集沉降、活性低的突出问题。结合蛋白免疫印迹的检测技术，本发明技术可快速、简单、有效地判断目标氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具的体内活性，并发挥了基于蛋白免疫印迹检测技术的高灵敏性的优势。本发明技术可用于挖掘和鉴定极端嗜盐环境中亟待挖掘的氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具资源，为开发新一代基因密码子拓展工具奠定基础，从而推动非天然氨基酸领域相关的应用。
附图说明
图1为用于基因编码非天然氨基酸的正交的翻译系统示意图。
图2为基于GFP(绿色荧光蛋白)的报告系统的示意图。
图3为基于荧光标记技术的tRNA激活检测方法的原理示意图。
图4为表达框设计图。
图5为SAMP1报告蛋白中G24位点结构示意图。
图6为实施例2中免疫印迹结果图。
图7为实施例3中免疫印迹结果图。
图8为实施例4中免疫印迹结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
固体培养基均添加琼脂，液体培养基中不添加琼脂。
LB A+培养基：含0.1mg·ml-1氨苄西林的LB培养基。
高盐YPC培养基：去离子水100ml、30％SW溶液200ml、10×YPC溶液33ml，1M CaCl2水溶液1ml。30％SW溶液(1L)：NaCl 240g、MgCl2·6H2O 30g、MgSO4·7H2O 35g、KCl 7g、1MTris·HCl(pH7.5)20ml，余量为水。10×YPC溶液(170ml)：酵母提取物8.5g、蛋白胨1.7g、酪蛋氨基酸1.7g、1M KOH水溶液3ml，余量为水。
高盐YPC N+培养基：含1μg·ml-1新生霉素的高盐YPC培养基。
球囊成形溶液(100ml)：NaCl 4.7g、KCl 0.2g、蔗糖15g、1M Tris·HCl(pH8.2)5ml、15ml甘油，余量为水。
Regeneration缓冲液(1L)：NaCl 206g、MgSO4·7H2O 37g、KCl 3.7g、1M Tris-Cl(pH7.2)50ml、0.68M CaCl2·2H2O溶液5ml、60g/100ml蔗糖溶液250ml。
PEG solution(10ml)：PEG600(Sigma P3390)6ml,球囊成形溶液4ml。
Flag抗体：Sigma-Aldrich。
MoaE,全称为Molybdopterin synthase catalytic subunit。
实施例1、方案的设计
一、嗜盐底盘细胞的选择
针对极端高盐环境来源的氨酰-tRNA合成酶/tRNA工具在模式生物中易聚集沉降和活性低等问题，选择沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)作为底盘细胞，用于目标工具体内活性的检测。
二、具有标签的报告蛋白的选择与设计
选择类泛素蛋白(SAMP1蛋白)作为报告蛋白。SAMP1蛋白具有分子量小、结构稳定、折叠简单等表达优势；SAMP1蛋白可通过泛素链接反应形成蛋白共缀物(SAMP1-MoaE蛋白)，用于蛋白免疫印迹反应中信号的放大。
考虑到SAMP1蛋白的C端的最末尾有关键的di-glycine位点，故Flag标签置于的SAMP1蛋白的N端。
三、功能元件表达框的设计、构建、优化
功能元件表达框的核心元件包括：具有标签的报告蛋白(Flag-SAMP1蛋白)、待测氨酰-tRNA合成酶、待测tRNA。其中，Flag-SAMP1蛋白和待测氨酰-tRNA合成酶以多顺反子形式被P2启动子(组成型强启动子)驱动表达，转录的终止由T7终止子介导。为了提高Flag-SAMP1蛋白的丰度，在flag-samp1基因上游引入核糖体结合位点，以增强Flag-SAMP1蛋白表达。待测tRNA的表达由H.volcanii内源的tRNALys启动子介导，转录终止由rrnC终止子介导。为了不影响表达框元件对于质粒上下游区域的影响，在目标tRNA表达框之后额外添加了一个T7终止子。
整个功能元件的表达框被添加到可以在大肠杆菌和沃氏富盐菌中复制的穿梭质粒中，该质粒具有氨苄西林抗性基因和新生霉素抗性基因(用于质粒的筛选和维持体内表达的稳定)。
表达框的设计的示意图见图4。
P2启动子如序列表的序列1所示。
核糖体结合位点如序列表的序列2所示。
具有Flag标签的重组SAMP1wt蛋白的编码基因如序列表的序列3所示。
T7终止子如序列表的序列4所示。
tRNALys启动子如序列表的序列5所示。
rrnC终止子如序列表的序列6所示。
四、报告蛋白中终止密码子的选择
琥珀密码子的位置选择是报告蛋白系统设计的关键之一。为了保证非天然氨基酸的引入不会影响报告蛋白的结构和功能，进行蛋白结构分析，选择野生型SAMP1蛋白中G24号位点作为非天然氨基酸的引入位点，将G24对应的密码子变为琥珀密码子TAG(相应于RNA为UAG)。基于结构分析的位点选择的原理包括：①非天然氨基酸插入位置区域不能与E1酶直接接触；②非天然氨基酸的插入位置在SAMP1蛋白的延伸环上，从而尽量地避免对二级结构的影响；③被替换的氨基酸不带电荷。
SAMP1报告蛋白与其对应的类泛素反应激活酶E1的相互作用示意图见图5。编码第24位甘氨酸的密码子被替换成琥珀密码子，用于指导非天然氨基酸的特异性插入。SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基如序列表的序列14所示。SAMP1G24amb蛋白区段对应于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基，并且相对于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基的编码基因而言，SAMP1G24amb蛋白区段的编码基因中进行了一个密码子替换，该密码子为SAMP1蛋白的第24位氨基酸残基的密码子，由甘氨酸密码子替换为了“TAG”。
具有Flag标签的重组SAMP1G24amb蛋白的编码基因如序列表的序列7所示。
实施例2、报告蛋白的表达验证
E.coli GM2163，全称为Escherichia coli GM2163，为甲基化系统缺失的大肠杆菌。简介：F–ara-14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm-6hisG4rfbD1 rpsL136 dam13::Tn9 xylA5 mtl-1thi-1mcrB1 hsdR2。New England Biolabs。
沃氏富盐菌H26，又称为Haloferax volcanii H26。简介：DS70ΔpyrE2。提及该菌株的文献：Allers T,Ngo HP,Mevarech M,Lloyd RG.2004.Development of additionalselectable markers for the halophilic archaeon Haloferax volcanii based onthe leuB and trpA genes.Appl Environ Microbiol 70:943-953.。
待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因如序列表的序列8所示。
待测tRNA的编码基因如序列表的序列9所示。
一、构建重组表达载体
将特异DNA分子通过Gibson组装插入骨架载体中，得到重组表达载体。
骨架载体为质粒pJAM202c，为可在大肠杆菌和沃氏富盐菌中复制的穿梭质粒。提及该质粒的文献：Reuter C,Uthandi S,Puentes J,Maupin-Furlow J.2010.Hydrophobiccarboxy-terminal residues dramatically reduce protein levels in thehaloarchaeon Haloferax volcanii.Microbiology-SGM:248-255。
Gibson组装中借助上游同源臂和下游同源臂依次为：GGTCAGTGCCGACTGAACCTTTCGT和TCGGGGCGTTGACGCGCTTCGAGGG。
特异DNA分子如序列表的序列10所示，通过Gibson组装插入骨架载体中，得到质粒pXF214。序列10中，第495-562位核苷酸为P2启动子，第574-596位核苷酸为核糖体结合位点，第663-1484位核苷酸为待测氨酰-tRNA合成酶基因，第1510-1803位核苷酸为Flag标签-SAMP1wt蛋白基因，第1818-1865位核苷酸为T7终止子，第1891-2000位核苷酸为tRNALys启动子，第2016-2111位核苷酸为待测tRNA基因，第2127-2155位核苷酸为rrnC终止子，第2213-2260位核苷酸为T7终止子。
特异DNA分子如序列表的序列11所示，通过Gibson组装插入骨架载体中，得到质粒pXF243。序列11中，第495-562位核苷酸为P2启动子，第574-596位核苷酸为核糖体结合位点，第663-1484位核苷酸为待测氨酰-tRNA合成酶基因，第1521-1543位核苷酸为核糖体结合位点，第1550-1843位核苷酸为Flag标签-SAMP1wt蛋白基因，第2055-2102位核苷酸为T7终止子，第2113-2222位核苷酸为tRNALys启动子，第2238-2333位核苷酸为待测tRNA基因，第2349-2377位核苷酸为rrnC终止子，第2435-2482位核苷酸为T7终止子。
二、转化大肠杆菌
将步骤1得到的重组表达载体(质粒pXF214或质粒pXF243)导入E.coli GM2163感受态细胞，得到重组菌。质粒带有甲基化位点时会被沃氏富盐菌识别降解，采用E.coliGM2163扩繁重组表达载体可以避免质粒甲基化，以提高后续转化沃氏富盐菌的转化效率。
1、大肠杆菌GM2163感受态细胞制备
E.coli GM2163感受态细胞制备采用市售试剂盒(即Zymo Research公司旗下的Mix&Go！E.coli Transformation Kit，产品号为T3001)。
具体步骤：将E.coli GM2163涂布于LB固体培养基平板，37℃培养18-24小时；挑取单克隆接种于50ml SOB液体培养基，20℃、220rpm振荡培养12小时，2500g离心5分钟，弃上清；用5ml预混洗涤液(2.5ml洗涤液母液+2.5ml稀释液)重悬菌体沉淀，2500g离心5分钟，弃上清；用5ml预混感受态缓冲液(2.5ml感受态缓冲液母液+2.5ml稀释液)重悬菌体沉淀，每管100μl分装，-80℃保存。
洗涤液母液即试剂盒中的Wash Buffer(2X Stock)。稀释液即试剂盒中的Dilution Buffer。感受态缓冲液母液即试剂盒中的Competent Buffer(2X Stock)。
2、转化
取1管大肠杆菌GM2163感受态细胞于冰上完全溶解，加入2.5μl步骤一构建的重组表达载体(100ng/μl)，吹吸混匀30秒，然后全部涂匀于LB A+固体培养基平板，37℃培养18-24小时。
三、转化沃氏富盐菌
1、质粒的提取
完成步骤二后，挑取固体培养基平板上生长的单克隆，接种至装有4ml LB A+液体培养基的14m离心管中，37℃、220rpm振荡培养18-24小时，16000g离心5分钟，收集菌体沉淀。取菌体沉淀，采用天根质粒小提试剂盒并按说明书操作，提取质粒。采用NanoDrop 2000测量质粒浓度，质粒浓度为100-400ng/μl。
2、沃氏富盐菌H26感受态细胞制备
具体步骤：将沃氏富盐菌H26涂布于高盐YPC固体培养基平板，42℃培养36-48小时；挑取单克隆至2.5ml高盐YPC液体培养基，42℃、220rpm振荡培养18-24小时；取适量菌液接种至50ml高盐YPC液体培养基中传代(完成接种的初始时刻，单位菌液光学浓度[OD600nm]为0.1)，42℃、220rpm振荡培养16-20小时(此时OD600nm达到0.4-0.6)，2500g离心5分钟，弃除上清；用2ml球囊成形溶液重悬菌体沉淀，每管200μl分装，-80℃保存。
3、转化
取1管沃氏富盐菌H26感受态细胞，于冰上完全解冻；然后，加入10μl 0.5M EDTA水溶液，旋转10分钟混匀；然后，加入步骤1提取的质粒(质粒含量为1μg)，旋转5分钟混匀；然后，加入230μl PEG solution，旋转1分钟混匀；然后，加入10ml Regeneration缓冲液，颠倒混匀，42℃孵育过夜；然后3500g离心10分钟，弃除部分上清，剩余离心管底部的约100μl菌液，将这些菌液混匀后涂板至高盐YPC N+固体培养基平板，42℃培养5-7天。
四、培养沃氏富盐菌
1、完成步骤三后，挑取平板上的单克隆，接种至新的高盐YPC N+固体培养基平板，42℃培养48-72小时。
2、完成步骤1后，挑取单克隆，接种至2.5ml高盐YPC N+液体培养基，42℃、220rpm振荡培养18-24小时。
3、取步骤2得到的菌液，接种至2ml高盐YPC N+液体培养基中(完成接种的初始时刻，单位菌液光学浓度[OD600nm]为0.1)，42℃、220rpm振荡培养40-48小时，收集菌液。
五、目标蛋白的表达的检测(蛋白免疫印迹法)
1、蛋白样品准备
取步骤四得到的菌液，菌量为光学浓度[OD600nm]总值为2.0，16000g离心5分钟，完全弃除上清，用100μl 2×SDS-PAGE上样缓冲液(碧云天)重悬菌体沉淀，100℃煮15分钟，然后16000g离心5分钟。
2、电泳
采用伯乐CriterionTM电泳槽、金斯瑞12％SDS-PAGE预制胶、MOPS/SDS电泳液(生工)。
每孔加入10μl步骤1制备的蛋白样品，先50V电泳10分钟，再120V电泳30分钟。
3、蛋白上样量确定
用eStainTML1全自动蛋白染色系统染色，使用两张染色纸夹住胶，置于染色槽上，将染色槽插入机器内，加入预制染色液和洗脱液，染色至机器运行完毕，染色胶使用Epson扫描仪成像。
4、化学荧光成像
转膜：使用硝酸纤维素膜(Amersham)和伯乐湿转系统，缓冲液为含有20％(体积比)甲醇的Tris-Glycine溶液(伯乐)，转膜条件为恒流300mA、90分钟。封闭：使用10ml伯乐封闭液摇晃孵育10分钟。敷抗：使用约1ml敷抗液(1ml伯乐封闭液+1μl Flag抗体)，静置4℃过夜。洗脱：使用30ml TBST溶液，洗脱30分钟。显影：使用Immobilon HRP显影液和Azure600显影仪。
结果见图6。图6中，CBB为考马斯亮蓝(用于证明不同样品组之间总蛋白的上样量一致)。10kDa左右处蛋白信号是SAMP1蛋白，55kDa左右处蛋白信号认为是SAMP1-MoaE共缀物蛋白。蛋白上样量基本一致。质粒pXF214实验组和质粒pXF243实验组中有游离的SAMP1蛋白和SAMP1-MoaE共缀蛋白的表达，证明本发明中的基因表达框能够较好地表达氨酰-tRNA合成酶基因下游的SAMP1报告蛋白。质粒pXF243实验组中目的蛋白丰度显著高于质粒pXF214实验组，即在flag-samp1基因上游引入核糖体结合位点，可以有效增强Flag-SAMP1蛋白表达，可提升检测方法的效果。
实施例3、检测方法有效性的验证
测试一株极端嗜盐产甲烷古菌HMET中的新型PylRS/tRNAPyl配对的活性。利用本发明的方法，发现该来源于极端嗜盐生物中新型的PylRS2/tRNA2工具的体内活性，证明本发明技术可有效地用于极端嗜盐生物来源的新型翻译工具的活性鉴定。
待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因如序列表的序列8所示。
待测tRNA的编码基因如序列表的序列9所示。
一、构建重组表达载体
将特异DNA分子通过Gibson组装插入骨架载体中，得到重组表达载体。骨架载体为质粒pJAM202c，为可在大肠杆菌和沃氏富盐菌中复制的穿梭质粒。Gibson组装中借助上游同源臂和下游同源臂依次为：GGTCAGTGCCGACTGAACCTTTCGT和TCGGGGCGTTGACGCGCTTCGAGGG。
特异DNA分子如序列表的序列12所示，通过Gibson组装插入骨架载体中，得到质粒pXF201。序列12中，第495-562位核苷酸为P2启动子，第574-596位核苷酸为核糖体结合位点，第663-1484位核苷酸为待测氨酰-tRNA合成酶基因，第1545-1592位核苷酸为T7终止子。
特异DNA分子如序列表的序列11所示，通过Gibson组装插入骨架载体中，得到质粒pXF243。
特异DNA分子如序列表的序列13所示，通过Gibson组装插入骨架载体中，得到质粒pXF249。序列13中，第495-562位核苷酸为P2启动子，第574-596位核苷酸为核糖体结合位点，第663-1484位核苷酸为待测氨酰-tRNA合成酶基因，第1521-1543位核苷酸为核糖体结合位点，第1550-1843位核苷酸为Flag标签-SAMP1G24amb蛋白基因，第2055-2102位核苷酸为T7终止子，第2113-2222位核苷酸为tRNALys启动子，第2238-2333位核苷酸为待测tRNA基因，第2349-2377位核苷酸为rrnC终止子，第2435-2482位核苷酸为T7终止子。
二、转化大肠杆菌
同实施例2的步骤二。
三、转化沃氏富盐菌
同实施例2的步骤三。
四、培养沃氏富盐菌
1、同实施例2的步骤四的1。
2、同实施例2的步骤四的2。
3、完成步骤2后，取适量菌液，接种至2ml高盐YPC N+液体培养基，42℃、220rpm振荡培养40-48小时。
4、分组处理
第一组(BocK-组)：取步骤3得到的菌液，接种至2ml高盐YPC N+液体培养基中(单位菌液光学浓度[OD600]为0.1)，42℃、220rpm振荡培养40-48小时，收集菌液。
第二组(BocK+组)：取步骤3得到的菌液，接种至2ml含1mM伯克赖氨酸的高盐YPC N+液体培养基中(单位菌液光学浓度[OD600]为0.1)，42℃、220rpm振荡培养40-48小时，收集菌液。
五、目标蛋白的表达的检测(蛋白免疫印迹法)
同实施例2的步骤五。
结果见图7。图7中，BocK为伯克赖氨酸(一种非天然氨基酸)，WT为野生型，CBB为考马斯亮蓝。10kDa左右处蛋白信号认为是SAMP1蛋白，55kDa左右处蛋白信号认为是SAMP1-MoaE蛋白。蛋白上样量基本一致，阴性对照(质粒pXF201组)基本没有信号。质粒pXF201的(BocK+组)不显示SAMP1蛋白以及SAMP1-MoaE蛋白。质粒pXF243的(BocK+组)显示SAMP1蛋白以及SAMP1-MoaE蛋白。质粒pXF249的(BocK-组)基本观察不到SAMP1-MoaE蛋白。质粒pXF249的(BocK+组)明显观察到SAMP1-MoaE蛋白。当非天然氨基酸被添加到培养基中时，在目标工具配对(极端嗜盐生物来源的)的作用下，含有非天然氨基酸(BocK)的全长的SAMP1蛋白都能被表达出来，证明目标PylRS2/tRNA2配对工具具有体内活性。此外，含有非天然氨基酸的SAMP1报告蛋白能够共缀修饰大分子底物，形成SAMP1-MoAE共聚物，可明显提高免疫印迹的荧光信号，增强了了本方法的灵敏性。综上所述，本发明专利可以有效地检测出极端嗜盐环境来源的新型工具配对的活性。
实施例4、琥珀密码子的插入位置的选择
改变琥珀密码子的插入位置(一种形势下，采用实施例3的方案，用G24amb表示；一种形式下，将相应于序列3中第181-183的“GGC”替换为“TAG”，用G51amb表示；一种形式下，将相应于序列3中第190-192的“TAC”替换为“TAG”，用Y54amb表示；一种形式下，将相应于序列3中第235-237的“GGC”替换为“TAG”，用G69amb表示)。所有内容参照实施例3。
结果见图8。
图8中，BocK为伯克赖氨酸(一种非天然氨基酸)，WT为野生型，CBB为考马斯亮蓝。10kDa左右处蛋白信号认为是SAMP1蛋白，55kDa左右处蛋白信号认为是SAMP1-MoaE蛋白。当非天然氨基酸被引入到野生型SAMP1蛋白对应的第24位甘氨酸位点(G24amb)时，有非天然氨基酸底物添加时报告蛋白形成的SAMP1-MoAE共聚物信号最明显，没有非天然氨基酸底物添加时几乎没有报告蛋白的产生。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法
<130> GNCYX201730
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
agcggccgcc acggcgatat cgatgccctt aagtacaaca gggtacttcg gtggaatgcg 60
aacggatc 68
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tttgtttaac tttaagaagg aga 23
<210> 3
<211> 294
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atggactaca aggacgacga cgacaagggt accgagtgga agctgttcgc cgacctcgcg 60
gaagtcgccg gctcgcgcac cgttcgggtc gacgtcgacg gcgacgcgac cgtcggcgac 120
gcgctcgacg ccctcgtcgg ggcgcatccg gcgctcgaat cgcgggtgtt cggtgacgac 180
ggcgaactgt acgaccacat caacgtcctc cggaacggcg aggcggccgc gctcggcgag 240
gcgaccgccg ccggcgacga actcgcgctg ttcccgccgg tcagcggcgg ctga 294
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttg 48
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ccgccactta acacccaccg tttgttcgtt gtttcttgcg tgtgcgtccc tgccgtcgtc 60
gtgcagaaag gaaagtcatt ttacccaccg gcagttacga gagattgcaa 110
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atccttagcg aaagctaagg atttttttt 29
<210> 7
<211> 294
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
atggactaca aggacgacga cgacaagggt accgagtgga agctgttcgc cgacctcgcg 60
gaagtcgccg gctcgcgcac cgttcgggtc gacgtcgact aggacgcgac cgtcggcgac 120
gcgctcgacg ccctcgtcgg ggcgcatccg gcgctcgaat cgcgggtgtt cggtgacgac 180
ggcgaactgt acgaccacat caacgtcctc cggaacggcg aggcggccgc gctcggcgag 240
gcgaccgccg ccggcgacga actcgcgctg ttcccgccgg tcagcggcgg ctga 294
<210> 8
<211> 822
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
atggagttca ccgagacgca gaagcagcgc ctgcgcgaac tcggctacaa gggcgagttc 60
cccgagctcg acaccaagga ggaggtgaac gaggcgtact cgcagctcga aaagaagctc 120
cggaagaagc accgcaagaa actcaacgac ctgttcgagt cgaagaagcc gacgtggaag 180
aacaccgtcg agaacatccg gcagaacctc caggacctcg gcttcatcga agtccagacg 240
ccgctcatca tctcgaaaaa cctgctcaag aagatgaaaa tcgaccagaa aagcgacctc 300
atgaaccagg tctaccgcat caacgacaac aaggtcctcc gcccgatgct cgcgcagaac 360
ctctacaaag aactcgaaaa cttctcgaag ctctcgaacc gcgacacgat tcagctgttc 420
gaaatcggga cctgcttccg caaagagaaa ggcggcaagg accacctcaa cgagttcaag 480
atgctgaacg ccgtcgaact gggcaacttc aaggacaagg aaaagcgcct gaaggaggtc 540
atctccacgc tcttcaaaga cttcgacgag tacgtcctgg agaaggagaa gtcgaccgtg 600
tacggggaga cctacgacgt gctcgtcaac ggcaccgaac tcgcctcctg cgccatcggc 660
ccgcaccagt tggacgagaa gtgggacatc aaccggccgt ggattggtat cggcatcggc 720
atcgagcgct tcacgcgcga gctgaacaac tccgactcga cggtcaaggc ctacggccgc 780
tcgttcgtct accaggacgg catccgcctc gacatcaagt ga 822
<210> 9
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ggggggttgg tcgggttgac caaaggaggc tctaaacctt ctcaagggtt caggcaaatc 60
ctgggccttt accgggttcg actctcgggc cccccg 96
<210> 10
<211> 2353
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ggtcagtgcc gactgaacct ttcgttcaca gacgagcaag aacgccacaa gcggattctt 60
ccatcgttca tgctgaccga gtcgttcact cgagcgtcct ctttgagacg ctagaagcgc 120
ttgatgagtt gaccgaggag gtaatcgaga tatgggtaca atgcggacct aacgggctac 180
cggacatcga ccgtctccat acgatgtacg actgggtaga ctgggtacgt cccttactgt 240
cgagtctaac cgaagaacga gacgagacgg ttcagacgct gtctattggg ccggagattg 300
cacagcaacc cctcacggag gcaggttcgt gattgaacta acctttggta atatgttcgt 360
gatatgcgtt gtattcgggt atctcgtaat ctcgtggtat ctctcgagac agtacgttca 420
tgattagagt agggtcgacg aactctgaac ctatgaatcg cggtcggaca acaacccccg 480
atccaagctt ctagagcggc cgccacggcg atatcgatgc ccttaagtac aacagggtac 540
ttcggtggaa tgcgaacgga tcctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 600
ccatgggcag cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc 660
atatggagtt caccgagacg cagaagcagc gcctgcgcga actcggctac aagggcgagt 720
tccccgagct cgacaccaag gaggaggtga acgaggcgta ctcgcagctc gaaaagaagc 780
tccggaagaa gcaccgcaag aaactcaacg acctgttcga gtcgaagaag ccgacgtgga 840
agaacaccgt cgagaacatc cggcagaacc tccaggacct cggcttcatc gaagtccaga 900
cgccgctcat catctcgaaa aacctgctca agaagatgaa aatcgaccag aaaagcgacc 960
tcatgaacca ggtctaccgc atcaacgaca acaaggtcct ccgcccgatg ctcgcgcaga 1020
acctctacaa agaactcgaa aacttctcga agctctcgaa ccgcgacacg attcagctgt 1080
tcgaaatcgg gacctgcttc cgcaaagaga aaggcggcaa ggaccacctc aacgagttca 1140
agatgctgaa cgccgtcgaa ctgggcaact tcaaggacaa ggaaaagcgc ctgaaggagg 1200
tcatctccac gctcttcaaa gacttcgacg agtacgtcct ggagaaggag aagtcgaccg 1260
tgtacgggga gacctacgac gtgctcgtca acggcaccga actcgcctcc tgcgccatcg 1320
gcccgcacca gttggacgag aagtgggaca tcaaccggcc gtggattggt atcggcatcg 1380
gcatcgagcg cttcacgcgc gagctgaaca actccgactc gacggtcaag gcctacggcc 1440
gctcgttcgt ctaccaggac ggcatccgcc tcgacatcaa gtgaccggct gctaacaaag 1500
cccgaaagga tggactacaa ggacgacgac gacaagggta ccgagtggaa gctgttcgcc 1560
gacctcgcgg aagtcgccgg ctcgcgcacc gttcgggtcg acgtcgacgg cgacgcgacc 1620
gtcggcgacg cgctcgacgc cctcgtcggg gcgcatccgg cgctcgaatc gcgggtgttc 1680
ggtgacgacg gcgaactgta cgaccacatc aacgtcctcc ggaacggcga ggcggccgcg 1740
ctcggcgagg cgaccgccgc cggcgacgaa ctcgcgctgt tcccgccggt cagcggcggc 1800
tgagacgaac tcgcgctcta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 1860
ttttggttcc cgccggtcag cggcggctga ccgccactta acacccaccg tttgttcgtt 1920
gtttcttgcg tgtgcgtccc tgccgtcgtc gtgcagaaag gaaagtcatt ttacccaccg 1980
gcagttacga gagattgcaa ctatattatt acaatggggg gttggtcggg ttgaccaaag 2040
gaggctctaa accttctcaa gggttcaggc aaatcctggg cctttaccgg gttcgactct 2100
cgggcccccc gttcccaaat ccaaaaatcc ttagcgaaag ctaaggattt tttttaggaa 2160
ttaaccatgg atccgaggca ataactagca taaccccttg ggtgagcaat aactagcata 2220
accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc 2280
cggccagtcc cgcgttaagt actcaccggc agcggagtga aagtgaactc ggggcgttga 2340
cgcgcttcga ggg 2353
<210> 11
<211> 2575
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ggtcagtgcc gactgaacct ttcgttcaca gacgagcaag aacgccacaa gcggattctt 60
ccatcgttca tgctgaccga gtcgttcact cgagcgtcct ctttgagacg ctagaagcgc 120
ttgatgagtt gaccgaggag gtaatcgaga tatgggtaca atgcggacct aacgggctac 180
cggacatcga ccgtctccat acgatgtacg actgggtaga ctgggtacgt cccttactgt 240
cgagtctaac cgaagaacga gacgagacgg ttcagacgct gtctattggg ccggagattg 300
cacagcaacc cctcacggag gcaggttcgt gattgaacta acctttggta atatgttcgt 360
gatatgcgtt gtattcgggt atctcgtaat ctcgtggtat ctctcgagac agtacgttca 420
tgattagagt agggtcgacg aactctgaac ctatgaatcg cggtcggaca acaacccccg 480
atccaagctt ctagagcggc cgccacggcg atatcgatgc ccttaagtac aacagggtac 540
ttcggtggaa tgcgaacgga tcctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 600
ccatgggcag cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc 660
atatggagtt caccgagacg cagaagcagc gcctgcgcga actcggctac aagggcgagt 720
tccccgagct cgacaccaag gaggaggtga acgaggcgta ctcgcagctc gaaaagaagc 780
tccggaagaa gcaccgcaag aaactcaacg acctgttcga gtcgaagaag ccgacgtgga 840
agaacaccgt cgagaacatc cggcagaacc tccaggacct cggcttcatc gaagtccaga 900
cgccgctcat catctcgaaa aacctgctca agaagatgaa aatcgaccag aaaagcgacc 960
tcatgaacca ggtctaccgc atcaacgaca acaaggtcct ccgcccgatg ctcgcgcaga 1020
acctctacaa agaactcgaa aacttctcga agctctcgaa ccgcgacacg attcagctgt 1080
tcgaaatcgg gacctgcttc cgcaaagaga aaggcggcaa ggaccacctc aacgagttca 1140
agatgctgaa cgccgtcgaa ctgggcaact tcaaggacaa ggaaaagcgc ctgaaggagg 1200
tcatctccac gctcttcaaa gacttcgacg agtacgtcct ggagaaggag aagtcgaccg 1260
tgtacgggga gacctacgac gtgctcgtca acggcaccga actcgcctcc tgcgccatcg 1320
gcccgcacca gttggacgag aagtgggaca tcaaccggcc gtggattggt atcggcatcg 1380
gcatcgagcg cttcacgcgc gagctgaaca actccgactc gacggtcaag gcctacggcc 1440
gctcgttcgt ctaccaggac ggcatccgcc tcgacatcaa gtgaccggct gctaacaaag 1500
cccgaaaggc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tggactacaa 1560
ggacgacgac gacaagggta ccgagtggaa gctgttcgcc gacctcgcgg aagtcgccgg 1620
ctcgcgcacc gttcgggtcg acgtcgacgg cgacgcgacc gtcggcgacg cgctcgacgc 1680
cctcgtcggg gcgcatccgg cgctcgaatc gcgggtgttc ggtgacgacg gcgaactgta 1740
cgaccacatc aacgtcctcc ggaacggcga ggcggccgcg ctcggcgagg cgaccgccgc 1800
cggcgacgaa ctcgcgctgt tcccgccggt cagcggcggc tgacgcgcgg tcgtcccccc 1860
gacgcggcga cggtcatcgg ttctcgaagc ctgacggacg acccgcgagc ggccggtccg 1920
tcagtacgcg ggacggggga cgacggcacg agatggaagg gtgggagtag aacagcggga 1980
cgggagagaa ctgggtgaga tagaacagcg ggacgggacg cgataacgcg agagagaacg 2040
gaagtgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 2100
tgctgaaagg agccgccact taacacccac cgtttgttcg ttgtttcttg cgtgtgcgtc 2160
cctgccgtcg tcgtgcagaa aggaaagtca ttttacccac cggcagttac gagagattgc 2220
aactatatta ttacaatggg gggttggtcg ggttgaccaa aggaggctct aaaccttctc 2280
aagggttcag gcaaatcctg ggcctttacc gggttcgact ctcgggcccc ccgttcccaa 2340
atccaaaaat ccttagcgaa agctaaggat tttttttagg aattaaccat ggatccgagg 2400
caataactag cataacccct tgggtgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 2460
acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggccagt cccgcgttaa 2520
gtactcaccg gcagcggagt gaaagtgaac tcggggcgtt gacgcgcttc gaggg 2575
<210> 12
<211> 1685
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ggtcagtgcc gactgaacct ttcgttcaca gacgagcaag aacgccacaa gcggattctt 60
ccatcgttca tgctgaccga gtcgttcact cgagcgtcct ctttgagacg ctagaagcgc 120
ttgatgagtt gaccgaggag gtaatcgaga tatgggtaca atgcggacct aacgggctac 180
cggacatcga ccgtctccat acgatgtacg actgggtaga ctgggtacgt cccttactgt 240
cgagtctaac cgaagaacga gacgagacgg ttcagacgct gtctattggg ccggagattg 300
cacagcaacc cctcacggag gcaggttcgt gattgaacta acctttggta atatgttcgt 360
gatatgcgtt gtattcgggt atctcgtaat ctcgtggtat ctctcgagac agtacgttca 420
tgattagagt agggtcgacg aactctgaac ctatgaatcg cggtcggaca acaacccccg 480
atccaagctt ctagagcggc cgccacggcg atatcgatgc ccttaagtac aacagggtac 540
ttcggtggaa tgcgaacgga tcctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 600
ccatgggcag cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc 660
atatggagtt caccgagacg cagaagcagc gcctgcgcga actcggctac aagggcgagt 720
tccccgagct cgacaccaag gaggaggtga acgaggcgta ctcgcagctc gaaaagaagc 780
tccggaagaa gcaccgcaag aaactcaacg acctgttcga gtcgaagaag ccgacgtgga 840
agaacaccgt cgagaacatc cggcagaacc tccaggacct cggcttcatc gaagtccaga 900
cgccgctcat catctcgaaa aacctgctca agaagatgaa aatcgaccag aaaagcgacc 960
tcatgaacca ggtctaccgc atcaacgaca acaaggtcct ccgcccgatg ctcgcgcaga 1020
acctctacaa agaactcgaa aacttctcga agctctcgaa ccgcgacacg attcagctgt 1080
tcgaaatcgg gacctgcttc cgcaaagaga aaggcggcaa ggaccacctc aacgagttca 1140
agatgctgaa cgccgtcgaa ctgggcaact tcaaggacaa ggaaaagcgc ctgaaggagg 1200
tcatctccac gctcttcaaa gacttcgacg agtacgtcct ggagaaggag aagtcgaccg 1260
tgtacgggga gacctacgac gtgctcgtca acggcaccga actcgcctcc tgcgccatcg 1320
gcccgcacca gttggacgag aagtgggaca tcaaccggcc gtggattggt atcggcatcg 1380
gcatcgagcg cttcacgcgc gagctgaaca actccgactc gacggtcaag gcctacggcc 1440
gctcgttcgt ctaccaggac ggcatccgcc tcgacatcaa gtgaccggct gctaacaaag 1500
cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg 1560
gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggccagt 1620
cccgcgttaa gtactcaccg gcagcggagt gaaagtgaac tcggggcgtt gacgcgcttc 1680
gaggg 1685
<210> 13
<211> 2575
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ggtcagtgcc gactgaacct ttcgttcaca gacgagcaag aacgccacaa gcggattctt 60
ccatcgttca tgctgaccga gtcgttcact cgagcgtcct ctttgagacg ctagaagcgc 120
ttgatgagtt gaccgaggag gtaatcgaga tatgggtaca atgcggacct aacgggctac 180
cggacatcga ccgtctccat acgatgtacg actgggtaga ctgggtacgt cccttactgt 240
cgagtctaac cgaagaacga gacgagacgg ttcagacgct gtctattggg ccggagattg 300
cacagcaacc cctcacggag gcaggttcgt gattgaacta acctttggta atatgttcgt 360
gatatgcgtt gtattcgggt atctcgtaat ctcgtggtat ctctcgagac agtacgttca 420
tgattagagt agggtcgacg aactctgaac ctatgaatcg cggtcggaca acaacccccg 480
atccaagctt ctagagcggc cgccacggcg atatcgatgc ccttaagtac aacagggtac 540
ttcggtggaa tgcgaacgga tcctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 600
ccatgggcag cagccatcat catcatcatc acagcagcgg cctggtgccg cgcggcagcc 660
atatggagtt caccgagacg cagaagcagc gcctgcgcga actcggctac aagggcgagt 720
tccccgagct cgacaccaag gaggaggtga acgaggcgta ctcgcagctc gaaaagaagc 780
tccggaagaa gcaccgcaag aaactcaacg acctgttcga gtcgaagaag ccgacgtgga 840
agaacaccgt cgagaacatc cggcagaacc tccaggacct cggcttcatc gaagtccaga 900
cgccgctcat catctcgaaa aacctgctca agaagatgaa aatcgaccag aaaagcgacc 960
tcatgaacca ggtctaccgc atcaacgaca acaaggtcct ccgcccgatg ctcgcgcaga 1020
acctctacaa agaactcgaa aacttctcga agctctcgaa ccgcgacacg attcagctgt 1080
tcgaaatcgg gacctgcttc cgcaaagaga aaggcggcaa ggaccacctc aacgagttca 1140
agatgctgaa cgccgtcgaa ctgggcaact tcaaggacaa ggaaaagcgc ctgaaggagg 1200
tcatctccac gctcttcaaa gacttcgacg agtacgtcct ggagaaggag aagtcgaccg 1260
tgtacgggga gacctacgac gtgctcgtca acggcaccga actcgcctcc tgcgccatcg 1320
gcccgcacca gttggacgag aagtgggaca tcaaccggcc gtggattggt atcggcatcg 1380
gcatcgagcg cttcacgcgc gagctgaaca actccgactc gacggtcaag gcctacggcc 1440
gctcgttcgt ctaccaggac ggcatccgcc tcgacatcaa gtgaccggct gctaacaaag 1500
cccgaaaggc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacca tggactacaa 1560
ggacgacgac gacaagggta ccgagtggaa gctgttcgcc gacctcgcgg aagtcgccgg 1620
ctcgcgcacc gttcgggtcg acgtcgacta ggacgcgacc gtcggcgacg cgctcgacgc 1680
cctcgtcggg gcgcatccgg cgctcgaatc gcgggtgttc ggtgacgacg gcgaactgta 1740
cgaccacatc aacgtcctcc ggaacggcga ggcggccgcg ctcggcgagg cgaccgccgc 1800
cggcgacgaa ctcgcgctgt tcccgccggt cagcggcggc tgacgcgcgg tcgtcccccc 1860
gacgcggcga cggtcatcgg ttctcgaagc ctgacggacg acccgcgagc ggccggtccg 1920
tcagtacgcg ggacggggga cgacggcacg agatggaagg gtgggagtag aacagcggga 1980
cgggagagaa ctgggtgaga tagaacagcg ggacgggacg cgataacgcg agagagaacg 2040
gaagtgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 2100
tgctgaaagg agccgccact taacacccac cgtttgttcg ttgtttcttg cgtgtgcgtc 2160
cctgccgtcg tcgtgcagaa aggaaagtca ttttacccac cggcagttac gagagattgc 2220
aactatatta ttacaatggg gggttggtcg ggttgaccaa aggaggctct aaaccttctc 2280
aagggttcag gcaaatcctg ggcctttacc gggttcgact ctcgggcccc ccgttcccaa 2340
atccaaaaat ccttagcgaa agctaaggat tttttttagg aattaaccat ggatccgagg 2400
caataactag cataacccct tgggtgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 2460
acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggccagt cccgcgttaa 2520
gtactcaccg gcagcggagt gaaagtgaac tcggggcgtt gacgcgcttc gaggg 2575
<210> 14
<211> 86
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 14
Glu Trp Lys Leu Phe Ala Asp Leu Ala Glu Val Ala Gly Ser Arg Thr
1 5 10 15
Val Arg Val Asp Val Asp Gly Asp Ala Thr Val Gly Asp Ala Leu Asp
20 25 30
Ala Leu Val Gly Ala His Pro Ala Leu Glu Ser Arg Val Phe Gly Asp
35 40 45
Asp Gly Glu Leu Tyr Asp His Ile Asn Val Leu Arg Asn Gly Glu Ala
50 55 60
Ala Ala Leu Gly Glu Ala Thr Ala Ala Gly Asp Glu Leu Ala Leu Phe
65 70 75 80
Pro Pro Val Ser Gly Gly
85

Claims (7)

1.一种检测翻译工具是否具有合成非天然氨基酸的蛋白质的活性的方法；
所述翻译工具为待测氨酰-tRNA合成酶和待测tRNA；
所述方法包括如下步骤：
（1）制备具有功能元件表达框的重组表达载体；功能元件表达框包括如下元件：报告蛋白的编码基因、待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因、待测tRNA的编码基因；功能元件表达框中，报告蛋白的编码基因和待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因以多顺反子形式被组成型启动子驱动表达；所述报告蛋白自N端至C端包括如下两个区段：标签蛋白区段、SAMP1G24amb蛋白区段；SAMP1G24amb蛋白区段对应于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基，并且相对于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基的编码基因而言，SAMP1G24amb蛋白区段的编码基因中进行了一个密码子替换，该密码子为SAMP1蛋白的第24位氨基酸残基的密码子，由甘氨酸密码子替换为了“TAG”；
所述SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基如序列表的序列14所示；
所述功能元件表达框中，待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因上游具有核糖体结合位点；
（2）将具有功能元件表达框的重组表达载体导入沃氏富盐菌，得到重组菌；
（3）在含有非天然氨基酸的环境中培养重组菌，然后采用蛋白免疫印迹法检测重组菌的全菌蛋白中报告蛋白的表达情况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：具有功能元件表达框的重组表达载体先借助甲基化系统缺失的大肠杆菌进行扩繁，再导入沃氏富盐菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为可在大肠杆菌和沃氏富盐菌中复制的穿梭质粒。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：功能元件表达框中，报告蛋白的编码基因和目标氨酰-tRNA合成酶的编码基因被组成型强启动子驱动表达，由T7终止子介导转录终止。
5.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：功能元件表达框中，待测tRNA的编码基因被tRNALys启动子驱动表达，由rrnC终止子介导转录终止。
6.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：功能元件表达框中，报告蛋白的编码基因上游具有核糖体结合位点。
7.一种检测翻译工具是否具有合成非天然氨基酸的蛋白质的活性的试剂盒；
所述翻译工具为待测氨酰-tRNA合成酶和待测tRNA；
所述试剂盒包括特异DNA分子和沃氏富盐菌；
所述特异DNA分子包括如下元件：报告蛋白的编码基因、供待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因插入的位点甲、供待测tRNA的编码基因插入的位点乙；所述报告蛋白自N端至C端包括如下两个区段：标签蛋白区段、SAMP1G24amb蛋白区段；SAMP1G24amb蛋白区段对应于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基，并且相对于SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基的编码基因而言，SAMP1G24amb蛋白区段的编码基因中进行了一个密码子替换，该密码子为SAMP1蛋白的第24位氨基酸残基的密码子，由甘氨酸密码子替换为了“TAG”；
使用时，将待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因插入位点甲、待测tRNA的编码基因插入位点乙；报告蛋白的编码基因和待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因以多顺反子形式被组成型启动子驱动表达；
所述SAMP1蛋白的第2-87位氨基酸残基如序列表的序列14所示；
将待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因插入位点甲后，待测氨酰-tRNA合成酶的编码基因上游具有核糖体结合位点。
CN202011014249.XA 2020-09-24 2020-09-24 一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法 Active CN114250243B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011014249.XA CN114250243B (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011014249.XA CN114250243B (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114250243A CN114250243A (zh) 2022-03-29
CN114250243B true CN114250243B (zh) 2024-05-03

Family

ID=80789956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011014249.XA Active CN114250243B (zh) 2020-09-24 2020-09-24 一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114250243B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101048506A (zh) * 2004-10-27 2007-10-03 斯克利普斯研究院 体内掺入非天然氨基酸的正交翻译组分
CN102348807A (zh) * 2009-01-12 2012-02-08 苏特罗生物制药公司 利用体外蛋白合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的单装载体系
CN107012121A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大学 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
CN107022568A (zh) * 2016-02-01 2017-08-08 北京大学 哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统
WO2019005973A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 President And Fellows Of Harvard College SYNTHASE VARIANTS FOR INCORPORATING BIPHENYLALANINE INTO A PEPTIDE
CN109957559A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 深圳先进技术研究院 一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用
CN110172467A (zh) * 2019-05-24 2019-08-27 浙江大学 一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系
CN110835633A (zh) * 2018-08-13 2020-02-25 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2301099T3 (es) * 2003-07-07 2008-06-16 The Scripps Research Institute Composiciones de parejas ortogonales lisil-arnt y aminoacil-arnt sintetasa y usos de las mismas.
US20060134748A1 (en) * 2004-11-20 2006-06-22 Rajbhandary Uttam Orthogonal suppressor tRNAs and aminoacyl-tRNA synthetases and uses thereof
US8183037B2 (en) * 2007-04-13 2012-05-22 The Salk Institute For Biological Studies Methods of genetically encoding unnatural amino acids in eukaryotic cells using orthogonal tRNA/synthetase pairs
WO2011158895A1 (ja) * 2010-06-16 2011-12-22 独立行政法人理化学研究所 非天然タンパク質製造用の組換え細菌の作製方法、及びその利用
US11466260B2 (en) * 2015-10-19 2022-10-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Thermostable haloarchaeal inorganic pyrophosphatase

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101048506A (zh) * 2004-10-27 2007-10-03 斯克利普斯研究院 体内掺入非天然氨基酸的正交翻译组分
CN102348807A (zh) * 2009-01-12 2012-02-08 苏特罗生物制药公司 利用体外蛋白合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的单装载体系
CN107012121A (zh) * 2016-01-27 2017-08-04 北京大学 携带正交tRNA/氨酰tRNA合成酶的稳定细胞系的构建
CN107022568A (zh) * 2016-02-01 2017-08-08 北京大学 哺乳动物细胞中高效多点插入非天然氨基酸的系统
WO2019005973A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 President And Fellows Of Harvard College SYNTHASE VARIANTS FOR INCORPORATING BIPHENYLALANINE INTO A PEPTIDE
CN109957559A (zh) * 2017-12-26 2019-07-02 深圳先进技术研究院 一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用
CN110835633A (zh) * 2018-08-13 2020-02-25 北京大学 利用优化的基因密码子扩展系统制备ptc稳定细胞系及应用
CN110172467A (zh) * 2019-05-24 2019-08-27 浙江大学 一种利用嵌合设计方法构建正交的氨酰-tRNA合成酶/tRNA体系

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A chemical biology route to site-specific authentic protein modifications;Yang A.等;Science;第354卷(第6312期);第623–626页 *
Engineering of an Orthogonal Aminoacyl-tRNA Synthetase for Efficient Incorporation of the Non-natural Amino Acid O-Methyl-L-tyrosine using Fluorescence-based Bacterial Cell Sorting;Sebastian M. Kuhn等;Journal of Molecular Biology;第404卷(第1期);第70-87页 *
Methionine sulfoxide reductase a (MsrA) and its function in ubiquitin-like protein modification in archaea;Fu X.等;Mbio;第8卷(第5期);第e01169-17页 *
基于正交脱笼策略的蛋白质在体激活技术系列进展;王杰;刘源;刘衍军;王初;陈鹏;;中国基础科学;20191015(05);第8-12+57+2页 *
谷氨酰胺tRNA合成酶的克隆、表达、纯化及活性测定;张银山等;生物学杂志;第33卷(第01期);第6-8页 *
遗传密码扩充技术在蛋白质研究中的应用进展;刘亚光;方正之;姚文兵;;中国生化药物杂志;20110820(04);第328-331页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114250243A (zh) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schütze et al. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells
Ohana et al. HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells
Subramanian et al. A versatile 2A peptide-based bicistronic protein expressing platform for the industrial cellulase producing fungus, Trichoderma reesei
Matos et al. High‐yield export of a native heterologous protein to the periplasm by the tat translocation pathway in Escherichia coli
WO2006019876A2 (en) Production of fusion proteins by cell-free protein synthesis
EP1036323B1 (en) A bacterial multi-hybrid system and applications
CN108753792A (zh) 绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因及其制备方法和应用
US6867042B2 (en) Method for determining and modifying protein/peptide solubility
JP2023514045A (ja) 活性特異的な細胞濃縮
EP1109931A1 (en) METHOD FOR STUDYING PROTEIN INTERACTIONS $i(IN VIVO)
JP3439763B2 (ja) 合成ｔＲＮＡ
CN114250243B (zh) 一种检测极端嗜盐生物中氨酰-tRNA合成酶和tRNA活性的系统及方法
US20160229899A1 (en) LUCIGEN YELLOW (LucY), A YELLOW FLUORESCENT PROTEIN
Bessette et al. Flow cytometric screening of cDNA expression libraries for fluorescent proteins
CN113528563A (zh) 一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用
KR101500839B1 (ko) 리보스위치를 이용한 ｌ-트립토판 고생산균 스크리닝 방법
CN114958884B (zh) 一种能够快速检测普鲁兰多糖的基因构建及应用方法
Miura et al. Enzyme evolution by yeast cell surface engineering
CN112126656B (zh) 基于尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶CysGA的蛋白质稳定性检测系统
CN113528412B (zh) 一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用
CN117106101B (zh) 质粒及asfv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法
Willmer Release of a Natural mRNA During Recycling of the Prokaryotic Ribosome
Ojima-Kato et al. Nascent MSKIK peptide prevents or releases translation arrest in Escherichia coli
EP1548111A1 (en) Process for producing ligand binding protein with the use of cell-free protein synthesis system and utilization thereof
Yoshida et al. An effective peptide screening system using recombinant fluorescent bacterial surface display

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant