KR101500839B1

KR101500839B1 - 리보스위치를 이용한 ｌ-트립토판 고생산균 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101500839B1
Application number: KR1020130069803A
Authority: KR
Inventors: 정규열; 양진아; 장성호; 서상우
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2015-03-16
Also published as: US9493767B2; US20150337293A1; KR20130142942A

Abstract

본 발명은 리보스위치를 이용한 L-트립토판 고생산균 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 트립토판 압타머, 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열 및 선택 표지 유전자를 포함하는 L-트립토판 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 리보스위치 및 이를 이용하여 L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균을 스크리닝하는 방법은 L-트립토판을 고농도로 생산하는 균주를 비교적 빠르고 쉽게 선별할 수 있으며, 이를 이용하여 미생물을 이용한 트립토판 생산의 가격경쟁력을 높일 수 있다.

Description

리보스위치를 이용한 Ｌ-트립토판 고생산균 스크리닝 방법{Method for Screening Microorganism with High L-tryptophan Productivity Using Riboswitch}

본 발명은 리보스위치를 이용한 L-트립토판 고생산균 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 트립토판 압타머, 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열 및 선택 표지 유전자를 포함하는 L-트립토판 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

미생물을 이용한 대사산물을 생산하는 방법의 가격경쟁력을 높이기 위해 지속적으로 균주 개발이 이루어지고 있다. 전통적이면서 효과적인, 균주 개발을 위한 조합적 접근법은 생산 균주를 기반으로 균주 라이브러리를 생성한 후 라이브러리 안의 개선된 균주를 스크리닝하는 단계로 이루어져있다. 그 예로 1960년대 추출법에서 미생물을 이용한 발효법으로 생산방법이 전환된 MSG(monosodium glutamate)생산균주의 개발 사례를 들 수 있다.

균주 라이브러리를 생성하기 위하여 예전에는 UV 조사, NTG(nitrosoguanidine)와 같은 화학적 돌연변이원을 첨가하는 화학적 변이법 등이 사용되었다. 분자생물학적 도구와 생화학적 지식이 축적된 현대에 들어서는 PCR(polymerase chain reaction) 기반으로 유전자에 돌연변이를 유발시키거나 프로토플라스트 퓨전(protoplast fusion)을 통한 게놈 셔플링(genome shuffling), 트랜스포손(transposon)을 이용한 임의 삽입(random insertion) 등의 다양한 균주 라이브러리 생성법이 제시되었다. 균주 라이브러리의 크기가 커질수록 그 중에 목적 대사산물 고생산균이 포함되었을 가능성이 높아지므로, 상기된 라이브러리 제조방법을 다중으로 사용함으로써 균주 라이브러리를 생성할 수 있다.

균주의 목적 대사산물 생산성을 파악하기 위해서 다양한 분석법이 쓰이고 있다. 액체/기체 크로마토그래피(LC/GC)는 개별 균주를 배양한 후 배양액과 균주 내의 대사산물 농도를 분석하는 방법이다. 이 방법은 대부분의 대사산물을 검출할 수 있고 표준검정곡선을 얻을 수 있다면 정량적 분석이 가능하다. 하지만 한 번에 한 종의 변이 균주에 대해서만 측정할 수 있기 때문에 처리량(throughput)이 낮아서 일정 크기 이상의 균주 라이브러리를 분석하기에는 비효율적이다.

멀티플레이트(multi plates)를 사용한 대사산물 분석 방법은 변이 균주를 구분된 칸(well)에 투입한 뒤 소량 시료의 발색, 흡광도 또는 형광도 등의 변화를 측정하여 시료 안의 대사산물의 농도 변화를 분석하는 방법이다. 소량의 시료를 사용하고, 멀티플레이트를 사용하기 때문에 비교적 다수의 변이 균주들을 동시에 분석할 수 있다. 그러나 상기된 제조방법에 의해 만들어진 크기가 큰 균주 라이브러리를 분석하기에는 처리능이 낮다. 또한, 대사산물을 기질로 한 발색 반응이 가능하거나, 흡광도 또는 형광도의 변화를 측정할 수 있는 대사산물에 대해서만 적용 가능하기 때문에 활용범위가 좁다.

유전적 바이오센서를 활용하여 생산 균주를 스크리닝하는 방법은 합성된 목적 대사산물의 농도를 즉각적으로 검출할 수 있는 신호로 전환시켜서 검출한다. 목적 대사산물에 특이적인 바이오센서를 개발하여 적용한다면 적합한 검출기를 활용함으로써 시각적으로 검출할 수 없는 목적 대사산물의 농도변화를 관찰할 수 있다.

FACS(fluorescence activated cell sorting) 기법은 변이 균주를 검출기로 흘려보내면서 개별 균주에서 방출되는 형광을 검출한다. 대량의 세포들을 동시에 흘려보내며 매우 빠르게 형광검출을 할 수 있기 때문에, 처리능이 10⁹ 이상에 달한다. 목적 대사물질이 형광을 내는 경우, 큰 라이브러리를 비교적 빠르고 쉽게 분석할 수 있기 때문에 고생산균을 효율적으로 스크리닝 할 수 있다. 그러나 형광을 나타내는 대사산물에 대해서만 적용할 수 있다는 한계점이 있다.

마지막으로 선별(selection) 방법을 사용할 수 있다. 이 방법은 균주 라이브러리에서 목적 대사산물을 고농도로 생산해내는 균주만 살아남도록 만드는 기술이다. 이 방법은 처리량이 매우 높아서 큰 균주 라이브러리로부터 고생산 균주만을 효과적으로 골라낼 수 있다. 그러나 목적 대사산물의 농도가 균주의 성장 혹은 생존에 관여하는 경우에만 이 기술을 적용할 수 있다.

한편, 리보스위치(riboswitch)는 세포 내에서 특정 대사산물의 농도를 감지하여 하류에 위치한 유전자의 발현량을 조절하는 생체 센서로서, 기질 특이성과 기질 친화도가 매우 높다. 또한, SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 기술을 이용하여 특정 대사산물에 결합하는 압타머(aptamer)를 생성하고, 이를 기반으로 리보스위치를 만드는 기술들이 개발되어 있다. 따라서 우리가 스크리닝 하고자 하는 대사산물만을 특이적이고 민감하게 인지하여 하류에 위치한 유전자의 발현량을 조절하는 리보스위치를 개발할 수 있다.

이렇게 개발한 리보스위치의 하류에 선택 표지 유전자를 삽입하게 되면, 목적 대사산물의 농도에 따라 선택표지 유전자의 발현을 조절하는 RNA device를 얻을 수 있다. 다양한 방법을 이용하여 생성한 균주 라이브러리에 RNA device를 도입하면 각 균주 내부의 목적 대사산물의 농도에 따라서 선택표지 유전자의 발현량이 달라진다. 이때, 인공선택회로가 형질전환 된 균주 후보군을 RNA device의 선택표지 유전자에 대응하는 적합한 선택압에 노출시킬 경우 목적 대사산물을 고농도로 생산하는 균주만 살아남게 될 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 다양한 목적 대사산물에 대해 적용할 수 있고, 높은 처리량을 가지는 스크리닝 기술을 개발하고자 한다.

이를 위하여 본 발명은 L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치를 제공하고자 한다.

본 발명은 또한, 상기 리보스위치를 이용하여 L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균을 효과적으로 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 트립토판 압타머, 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열 및 선택 표지 유전자를 포함하는 L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 트립토판 압타머는 서열번호 2, 서열번호 13 또는 서열번호 15로 기재되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열은 바람직하게는 10개의 염기로 이루어진 DNA 서열이며, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 기재되는 것을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 선택 표지 유전자는 tetA 유전자를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 트립토판 압타머, 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열 및 선택 표지 유전자를 포함하는 리보스위치를 이용하여 L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 리보스위치 및 이를 이용하여 L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균을 스크리닝하는 방법은 L-트립토판을 고농도로 생산하는 균주를 비교적 빠르고 쉽게 선별할 수 있으며, 이를 이용하여 미생물을 이용한 트립토판 생산의 가격경쟁력을 높일 수 있다.

도 1은 L-트립토판 압타머(L-tryptophan aptamer, Trp 70-727)의 구조를 나타낸 것이다. L-트립토판 압타머(L-tryptophan aptamer, Trp 70-727)의 RNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
도 2는 본 발명의 리보스위치 라이브러리의 설계도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 리보스위치 라이브러리 제작을 위한 클로닝 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 pMD20-tetA-linker-sGFP의 TA 클로닝 결과를 확인하기 위한 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 유전자가 삽입된 벡터를 제한 효소로 절단한 후 tetA-linker-sGFP 유전자를 회수한 결과를 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예 중 tetA-linker-sGFP 유전자와 pACYC Duet ΔlacI ΔT7 프로모터 플라스미드를 결합(ligation)한 후 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 있어서 J23100 프로모터와 10 bp의 무작위 서열을 오버행(overhang)으로 가지는 정방향 프라이머(forward primer)와 pACYC Duet ΔlacI ΔT7 프로모터 플라스미드에 상보적으로 결합하는 역방향 프라이머(reverse primer)를 사용하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 8은 본 발명의 리보스위치 라이브러리로부터 L-트립토판 특이적인 리보스위치를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 9는 sGFP 유전자를 활용하여 각 리보스위치의 성능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에서 제시하는 기술을 다양한 목적 물질에 대해 적용시키는 과정에 대해 나타낸 모식도이다.

본 발명은 L-트립토판(L-tryptophan)을 특이적으로 인지하여 하류에 위치한 유전자의 발현량을 조절하는 RNA 스위치를 개발하였다. 먼저, 기존에 알려진 L-트립토판 RNA 압타머(L-tryptophan RNA aptamer)를 이용해서 스위치가 될 가능성이 있는 라이브러리를 제작하였다. 그리고 상기 라이브러리로부터 실제로 작동하는 스위치만을 골라냈다.

본 발명에 있어서, 상기 선택 표지 유전자는 테트라사이클린 내성 단백질(tetracycline resistance protein)을 코딩하는 tetA 유전자를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 Taq 폴리머라제(Taq polymerase), Phusion 폴리머라제(Phusion polymerase), 및 제한효소들은 TaKaRa 또는 New England Biolabs에서 구매하였으며, pACYC_Duet과 pCDF_Duet 벡터는 Novagen에서 구매하였고, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들은 Genotech에서 합성하였다. 그 밖에 배양액 제조를 위한 재료들은 모두 Sigma에서 구매하였다.

실시예 1. RNA device 라이브러리 제작

먼저, L-트립토판(L-tryptophan)의 농도에 따라 하류에 위치한 유전자의 발현량을 조절하는 스위치를 만들기 위해서 다양한 서열을 갖는 라이브러리(library)를 제작하였다. 이 라이브러리는 이미 알려진 L-트립토판 압타머(L-tryptophan aptamer) (Irene Majerfeld and Michael Yarus, Nucl.Acids.Res.,2005)와 하류 선택 표지 유전자(tetA-sGFP fusion: 서열번호 6) 사이에 10 bp(base pairs) 길이의 무작위 서열을 삽입하여 만들었다.

L-트립토판 압타머(L-tryptophan aptamer, Trp 70-727)는 서열번호 1 및 도 1에 나타내었으며, L-트립토판이 결합할 수 있는 자리를 제공한다. 본 발명의 클로닝 단계에서는 L-트립토판 압타머 RNA 서열의 U를 T로 치환한 서열(서열번호 2)을 이용하였다. 하류 선택 표지 유전자 중 tetA 유전자는 리보스위치(RNA switch)로 작동하는 서열을 골라내는 데 활용했으며, 여기에 연결된 sGFP는 형광을 이용하여 선별된 리보스위치의 성능을 조사하는데 활용했다. 10 bp 길이의 무작위 서열은 리보솜 결합 부위(ribosome binding site, RBS)의 상류(upstream)에 위치시켰다.

L-트립토판이 압타머에 결합하면 무작위 서열들 중 일부는 리보솜 결합 부위(RBS)와 상보적인 결합을 통해 RBS를 2차 또는 3차 구조 내부에 갇히도록 하거나 반대로, 외부에 노출시킬 수 있다. 이렇게 RBS가 감추어지거나 노출되면 리보솜의 결합에 영향을 미쳐서, 결과적으로 하류 선택 표지 유전자(tetA-sGFP fusion)의 발현량을 조절하게 된다. 본 발명의 리보스위치 라이브러리의 설계도는 도 2에 나타내었다.

상기와 같은 구조의 라이브러리를 만들기 위해서 아래와 같은 과정의 클로닝(cloning)을 수행하였으며, 각각의 과정을 도 3에 간략히 나타내었다.

① 먼저, KpnI 부위와 SD 서열을 오버행(overhang)으로 가지는 정방향 프라이머(forward primer: 서열번호 7)와 연결 부위 서열(linker sequence; Gly-Gly-Gly-Ser)×4을 오버행으로 가지는 역방향 프라이머(reverse primer: 서열번호 8)를 이용하여 tetA 유전자를 PCR하였다. PCR 조건은 98℃ 30초, (98℃ 10초, 55℃ 15초, 72℃ 1분)×3 cycles, 72℃ 3분 수행 후, 4℃에서 저장하였다.

② 다음으로, 연결 부위 서열(linker sequence; Gly-Gly-Gly-Ser)×4을 오버행으로 가지는 정방향 프라이머(forward primer: 서열번호 9)와 SacI 부위를 오버행으로 가지는 역방향 프라이머(reverse primer: 서열번호 10)를 이용하여 sGFP 유전자를 PCR하였다.

③ 상기 각각의 PCR 결과물을 섞어서 오버랩 PCR(overlap PCR)을 수행하여 tetA-linker-sGFP 유전자를 얻었다. 구체적으로, 상기 ① 및 ②에서 얻은 PCR 산물(product)을 섞어준 뒤 98℃ 30초, (98℃ 10초, 60℃ 30초, 72℃ 2분)×3 cycles, 72℃ 5분, 4℃ 보관 후에 KpnI 부위와 SD 서열을 오버행(overhang)으로 가지는 정방향 프라이머(forward primer: 서열번호 7)와 SacI 부위를 오버행으로 가지는 역방향 프라이머(reverse primer: 서열번호 10)를 추가하여 98℃ 30초, (98℃ 10초, 55℃ 15초, 72℃ 2분)×30 cycles, 72℃ 5분 PCR 수행 후, 4℃에서 보관하였다.

④ 상기 ③에서 얻은 유전자 tetA-linker-sGFP를 T-vector에 삽입하였다. TA 클로닝을 통하여 T-vector에 삽입된 유전자를 PCR로 확인한 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적으로, 상기 ① 및 ②에서 얻은 PCR 산물(product)을 오버랩 PCR(overlap PCR) 수행하여 연결한 후, Taq 폴리머라제(Taq polymerase)를 사용하여 상기 구조(construct)의 양 끝에 A-tail을 달아주어, T-vector와 연결시킬 수 있게 하였다. 최종 결과물로써 T-vector 내에 KpnI-SD-tetA-linker-sGFP-SacI이 들어가 있는 상태가 된다. 이 상태에서 삽입된 결과물의 상류(upstream)와 하류(downstream)에 결합하는 프라이머 세트(primer set)를 이용하여 콜로니 PCR(colony PCR)을 수행하였다. 제대로 삽입이 된 경우는 도 4에 나타난 바와 같이, 1959 bp정도의 밴드(band)가 나타남을 확인할 수 있다.

⑤ 서열 분석(sequencing)을 통해 올바른 구조(construct)가 들어있는 플라스미드(plasmid)를 골라내었다. 상기 T-vector에 삽입하여 만들어진 플라스미드(plasmid)에 KpnI과 SacI 제한효소를 처리해주면 구조(construct)의 5'과 3'에 위치한 제한효소 인식 자리(restriction site)를 절단하게 되어 벡터 단편(vector fragment)과 구조 단편(construct fragment) 두 개의 조각이 생성된다. 겔-전기영동으로 유전자를 회수하였으며, 도 5에 나타낸 바와 같이 그 중에서 1959 bp에 해당하는 밴드가 우리가 회수하고자 하는 구조임을 알 수 있다.

⑥ 한편, pACYC Duet ΔlacI ΔT7 프로모터 플라스미드를 제한효소 KpnI과 SacI으로 절단(digestion)한 뒤에 겔-전기영동으로 유전자를 회수했다.

⑦ 다음으로, T4 라이게이즈(T4 ligase)를 사용해서 상기 ⑤와 ⑥의 결과물을 결합(ligation)하였으며, 전기영동으로 확인한 결과를 도 6에 나타내었다. 구체적으로, pACYC Duet 벡터에서 lacI유전자와 T7 프로모터를 삭제한 플라스미드를 KpnI과 SacI 제한효소로 절단한 후, 상기 ⑤에서 회수한 구조(construct)와 연결시켰다. 상기 구조도 5'과 3'에 각각 제한효소 KpnI과 SacI으로 잘렸기 때문에 pACYC와 정확하게 결합할 수 있으며, 그 결과를 도 6에서 확인할 수 있다.

⑧ 다음으로, J23100 프로모터와 10 bp의 무작위 서열을 오버행(overhang)으로 가지는 정방향 프라이머(forward primer: 서열번호 11)와 pACYC Duet ΔlacI ΔT7 프로모터 플라스미드에 상보적으로 결합하는 역방향 프라이머(reverse primer: 서열번호 12)를 사용하여 95℃ 30초, (95℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 5분)×30 cycles, 72℃ 7분 조건으로 PCR을 수행한 후, 4℃에서 보관하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. pACYC에 tetA-linker-sGFP가 들어가 있는 상태에서 tetA의 상류(upstream)에 압타머(aptamer)와 무작위 서열(random sequence)을 삽입하기 위해 정방향 프라이머를 설계하였다. 역방향 프라이머는 tetA의 바로 위쪽에 붙도록 설계하여 정방향 프라이머와 함께 PCR하면 pACYC-압타머(aptamer)-무작위 서열(random sequence)-tetA-링커(linker)-sGFP 전체를 얻게 하였다. 이 선형 DNA 서열을 blunt end ligation 수행하여 플라스미드로 만들었으며, 이를 도 7에서 확인하였다.

⑨ 다음으로, Blunt-end ligation 방법으로 상기 ⑧에서 얻은 결과물의 양 끝을 이어 붙인 후,

⑩ 상기 ⑨의 결과물을 MegaX DHα 10B cell에 형질전환(transformation)함으로써, 본 발명의 리보스위치 라이브러리를 완성하였다.

실시예 2. L-트립토판 특이적인 리보스위치의 선별

두 번의 선별과정을 통해 상기 실시예 1에서 제작한 리보스위치 라이브러리(RNA switch library)로부터 L-트립토판(L-tryptophan)에 반응하는 리보스위치(RNA switch)를 골라낼 수 있었다.

선별과정에서 tetA 유전자의 특성을 이용하였다. tetA 유전자가 발현되면 tetA 단백질이 세포막으로 이동하여 세포 내부의 테트라사이클린(tetracycline)을 외부로 배출하게 되며, 이로 인해 세포는 테트라사이클린에 내성을 가지게 된다. 그러나 tetA 유전자가 과발현되면, 세포가 니켈 이온(nickel ion)에 의해 사멸하게 되는 효과가 있다. 상기와 같은 tetA 유전자의 성질을 이용하면, 세포 내 L-트립토판 농도가 높을 때 tetA가 많이 발현되고, L-트립토판 농도가 낮을 때 tetA를 발현하지 않는 플라스미드를 가지는 세포를 골라낼 수 있다.

L-트립토판 특이적인 리보스위치를 선별하는 과정을 도 8에 나타내었으며, 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 세포 내 L-트립토판 농도가 높은 상태에서 배지에 테트라사이클린을 첨가하였을 때 살아남는 세포는 tetA를 많이 발현한 세포이다. 이 세포들을 수확하여 세포 내 L-트립토판 농도가 낮은 상태로 바꾸어준 다음, 배지에 니켈 이온(nickel ion)을 첨가해주고 키웠을 때 여전히 살아남아 있는 세포들을 얻을 수 있다(Adapted from Muranaka, N. et al., Nucl. AcidsRes., 37, e39, 2009).

상기와 같이 두 번의 선별과정을 거치고 살아남은 세포들은 L-트립토판 농도가 높을 때는 tetA 유전자를 발현시키지만, L-트립토판 농도가 낮을 때는 tetA 유전자를 발현시키지 않는 플라스미드를 가지고 있다. 이 플라스미드를 수확해서 시퀀싱(sequencing)하면 10 bp의 무작위 서열들 중에서 어떤 서열이 리보스위치의 작동을 가능케 하는지 확인할 수 있다.

한편, 각 tetA와 연결되어 있는 sGFP 유전자를 활용하여 각 리보스위치의 성능을 측정할 수 있다. 세포내 L-트립토판 농도가 높을 때와 낮을 때 sGFP가 나타내는 형광의 세기를 측정함으로써 유전자 발현조절 능력을 확인할 수 있다.

상세한 실험과정은 다음과 같다.

① 리보스위치 라이브러리 플라스미드(Riboswitch library plasmid)를 가지고 있는 E. coli W3110 세포들을 M9 배지에 클로람페니콜(chloramphenicol)을 첨가한 CM9 배지에서 8시간 동안 배양하였으며, 배양액을 0.2 mM의 NiCl₂를 포함한 CM9으로 옮기고 24시간 동안 배양하였다.

② 상기 ①의 결과물을 1 mM의 L-트립토판을 첨가한 CM9에 옮긴 뒤, 8시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 1 mM의 L-트립토판과 테트라사이클린(40 or 100 ㎍/ml)을 첨가한 CM9으로 옮긴 뒤, 24시간 동안 배양하였다.

③ 상기 ②의 결과물을 LB 배지에 클로람페니콜(chloramphenicol)을 첨가한 CLB 플레이트에서 키웠다. 이 중 몇 개의 콜로니(colony)들을 선택하여 L-트립토판을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지에서 각각 키운 뒤 형광 세기를 측정하였다.

실험 결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에서 콜로니 1 ~ 3은 40 ㎍/ml 테트라사이클린에서 선별한 세포들이고, 콜로니 4~9는 100 ㎍/ml 테트라사이클린에서 선별한 세포들이다. 도 9에 나타난 바와 같이, 콜로니 2, 3, 6이 좋은 성능을 보였으며, 이들의 활성 비율(activation ratio)은 2.3정도였다. 좋은 성능을 보인 콜로니 2, 3 및 6의 염기서열은 각각 서열번호 3,4 및 5와 같다.

한편, 좋은 성능을 보인 리보스위치 콜로니 2, 3 및 6의 시퀀싱 분석을 수행한 결과, 트립토판 압타머의 서열이 서로 다르게 나타남을 확인할 수 있었다. 즉, 콜로니 3의 경우에는 트립토판 압타머 서열이 서열번호 2의 서열을 가진 반면, 콜로니 2 및 6은 각각 서열번호 13 및 15의 서열을 가져 선별 중에 돌연변이가 발생함을 확인할 수 있었다.

본 명세서에서 "활성 비율(activation ratio)"은 배지에 트립토판이 첨가된 경우와 첨가되지 않은 경우의 세포배양의 형광 세기(fluorescence of cell culture)에서 배경 형광세기를 뺀 후, 그 값을 각각의 O.D.로 나누어서 표준화(normalize)한 값의 비율을 의미하며, 아래와 같이 나타낼 수 있다. 다만, 아래 식에서 background fluorescence는 PBS(Phosphate Buffered Saline)의 형광세기(fluorescence)를 측정한 값이며, 이를 background로 사용한 이유는, 세포배양(cell culture)의 형광세기를 측정할 때 PBS에 희석하여 측정했기 때문이다.

본 발명의 상기 실시예에 의해 제조된 리보스위치를 이용하여 L-트립토판 고생산균을 스크리닝하는 방법은 도 10에서 간략히 나타내었다.

도 10의 내용은 본 발명에서 제시하는 기술을 다양한 목적 물질에 대해 적용시키는 과정에 대해 묘사하고 있다. SELEX 과정을 통하여 목적 물질에 결합하는 RNA　압타머(aptamer)를 생성하고, 생성된 압타머를 기반으로 리보스위치를 생성한 후, 생성된 리보스위치를 사용하여 균주 라이브러리(strain library)에서 농축 단계(enrichment)를 수행하여 우수한 균주(superior strain)를 얻어낼 수 있다. 이와 같은 방법으로 얻어진 균주(strain)를 자세히 조사하여 곧바로 목적 물질 생산에 사용할 수도 있고, 상기 농축 단계(enrichment)를 여러 번 반복하여 더 좋은 균주(strain)를 얻을 수도 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method for Screening L-tryptophan Producing Microorganism Using Riboswitch <130> PB13-11413 <150> 10-2012-0066009 <151> 2012-06-20 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-tryptophan aptamer(Trp 70-727) : Colony #3 <400> 1 cuggacgacg gggacgccac uggacuaggu aagccaggac cguacgucgg gagccgucag 60 aaua 64 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-tryptophan aptamer(Trp 70-727) : Colony #3 <400> 2 ctggacgacg gggacgccac tggactaggt aagccaggac cgtacgtcgg gagccgtcag 60 aata 64 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Colony #2 <400> 3 gagggtaaga 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Colony #3 <400> 4 tatatgggat 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Colony #6 <400> 5 ctagaggggt 10 <210> 6 <211> 1953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tetA-sGFP fusion gene <400> 6 atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60 ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc 120 atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca 180 cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta 240 cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac 300 gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 360 gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420 ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480 gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540 atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600 agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660 atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720 tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780 ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840 atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900 tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960 caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020 gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080 gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140 tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgaccgg cggtgggtcg 1200 ggcggtgggt ccggcggtgg gagtggcggt gggagcgcta gcaagggcga ggagctgttc 1260 accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 1320 gtgcgcggcg agggcgaggg cgatgccacc aacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 1380 accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 1440 cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 1500 cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc agcttcaagg acgacggcac ctacaagacc 1560 cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 1620 gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaactt caacagccac 1680 aacgtctata tcaccgccga caagcagaag aacggcatca aggccaactt caagatccgc 1740 cacaacgtgg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 1800 ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgtgctgagc 1860 aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 1920 atcactctcg gcatggacga gctgtacaag tga 1953 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer : KpnI site-SD sequence-Start of tetA <400> 7 ggtaccaagg agcatctatg aaatctaaca atgcgctcat cgtca 45 <210> 8 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer : (GGGS)4 linker-Start of sGFP without start codon <400> 8 gctcccaccg ccactcccac cgccggaccc accgcccgac ccaccgccgg tcgaggtggc 60 ccggct 66 <210> 9 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer : (GGGS)4 linker-Start of sGFP without start codon <400> 9 ggcggtgggt cgggcggtgg gtccggcggt gggagtggcg gtgggagcgc tagcaagggc 60 gaggagct 68 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer : SacI 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Claims

트립토판 압타머, 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열, 및 선택 표지 유전자를 포함하는, L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치로,
상기 트립토판 압타머는 서열번호 2, 서열번호 13 또는 서열번호 15로 기재되는 것인, 리보스위치.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열은 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 기재되는 것인, L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치.
제 1항에 있어서,
상기 선택 표지 유전자는 tetA 유전자인, L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치.
트립토판 압타머, 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열 및 선택 표지 유전자를 포함하는 리보스위치를 이용하여 L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균을 스크리닝하는 방법으로,
상기 트립토판 압타머는 서열번호 2, 서열번호 13 또는 서열번호 15로 기재되는 것인, 방법.
삭제
제 5항에 있어서,
상기 1 내지 20개의 염기로 이루어진 DNA 서열은 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 기재되는 것인, L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균을 스크리닝하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 선택 표지 유전자는 tetA 유전자인, L-트립토판(L-tryptophan) 고생산균을 스크리닝하는 방법.